謝玲玲

宮頸癌是全球婦女第四大常見惡性腫瘤，其轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致患者預(yù)后較差，手術(shù)和放化療是其主要治療方式［1-2］。中醫(yī)在癌癥的治療中一直發(fā)揮著重要作用，研究表明，中藥可聯(lián)合化療治療局部晚期宮頸癌，提升病人生存質(zhì)量，降低化療不良反應(yīng)［3］。

蜂斗菜素是菊科蜂斗菜屬植物的有效成分之一，具有抗炎癥、解痙攣的療效，還有潛在的抗癌活性［4］。研究表明，蜂斗菜素可抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5-6］。蜂斗菜素對宮頸癌是否有抑制作用尚不清楚。絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號通路在宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡等過程中具有重要調(diào)節(jié)作用［7］。本研究自2019 年3—10 月以宮頸癌細(xì)胞系Siha 為主要研究對象，假設(shè)蜂斗菜素通過AKT 信號通路調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞周期、增殖及凋亡，并對其進(jìn)行驗(yàn)證。以期為宮頸癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料人宮頸癌細(xì)胞系SiHa 購自美國ATCC；DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)基胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司，蜂斗菜素（批次20181005）購自西安天瑞生物技術(shù)有限公司；四氮唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、AKT信號通路激活劑IGF-1、胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich 公司；CCK-8 試劑盒、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）抗體、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）抗體、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Cleaved-caspase-9）抗體、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗體、p-PI3K 抗體、AKT 抗體、p-AKT 抗體和β 肌動蛋白（β-actin）抗體購自英國Abcam；流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司，全自動酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM 高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)人宮頸癌SiHa 細(xì)胞，培養(yǎng)液中添加10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素，培養(yǎng)條件：在濕度95%，37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，隔天換一次培養(yǎng)液，消化傳代，收集對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）測定在蜂斗菜素處理后SiHa 細(xì)胞的活性取對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，以濃度2×103個細(xì)胞/孔（200μL 細(xì)胞）接種于96 孔板，在培養(yǎng)24 h 后加入不同終濃度（5、15、45μmol/L）的蜂斗菜素（實(shí)驗(yàn)組）和空白培養(yǎng)液（對照組），分別在培養(yǎng)至24、48 和72 h 時進(jìn)行MTT 實(shí)驗(yàn)，加入20 μL（5 g/L）MTT 溶液，培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)上清，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10 min 溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度（A）值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡率用胰蛋白消化對數(shù)生長期的SiHa 細(xì)胞，以濃度5×105個細(xì)胞/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)48 h 后加入不同終濃度（5、15、45μmol/L）的蜂斗菜素（實(shí)驗(yàn)組）和空白培養(yǎng)液（對照組），繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞周期檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，分別上流式細(xì)胞儀檢測并計算各組G0～G1期、S 期、G2～M期細(xì)胞百分比及細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）實(shí)驗(yàn)收集經(jīng)5、15、45 μmol/L 的蜂斗菜素培養(yǎng)48 h 的SiHa 細(xì)胞，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞并超聲破碎，收集上清，檢測蛋白濃度。將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF 膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，cyclinD1 抗體（1∶3 000）、CDK2 抗體（1∶2 000）、Cleaved caspase-3 抗體（1∶1 000）、Cleaved caspase-9抗體（1∶1 500）、p-PI3K 抗體（1∶1 000）、PI3K 抗體（1∶1 000）、p-AKT 抗體（1∶1 000）、AKT 抗體（1∶1 000）和抗β-actin 抗體（1∶5 000），4 ℃過夜孵育。洗膜3次，然后加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫條件孵育2 h，顯影拍照。以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。滿足正態(tài)分布的定量資料用±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（下、上四分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步地兩兩比較采用LSD 法，不同濃度時間點(diǎn)間交互作用指標(biāo)采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度蜂斗菜素對宮頸癌SiHa 細(xì)胞增殖的影響用5、15、45 μmol/L 的蜂斗菜素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在24、48和72 h細(xì)胞OD值均顯著降低，在45 μmol/L 濃度和72 h 時抑制率達(dá)到最高，呈濃度和時間依賴性（P＜0.05），細(xì)胞活力（OD490）在不同濃度、不同時間點(diǎn)間、濃度×?xí)r間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F濃度=69.84，P濃度＜0.001；F時間=36.87，P時間＜0.001；F濃度×?xí)r間=26.56，P濃度×?xí)r間＜0.001）；見表1。

表1 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞SiHa活力的影響/±s

表1 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞SiHa活力的影響/±s

注：①與蜂斗菜素0μmol/L組相比較，P＜0.05。

組別蜂斗菜素0μmol/L蜂斗菜素5μmol/L蜂斗菜素15μmol/L蜂斗菜素45μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)9 999細(xì)胞活力（OD490）24 h 0.44±0.04 0.36±0.05 ①0.33±0.04①0.32±0.03①16.14＜0.001 48 h 0.82±0.08 0.71±0.06 ①0.63±0.07①0.55±0.06①25.87＜0.001 72 h 1.45±0.07 1.15±0.11①0.98±0.07①0.84±0.06①97.37＜0.001

2.2 不同濃度蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞周期的影響與蜂斗菜素0 μmol/L 相比，蜂斗菜素5 μmol/L組、15 μmol/L 組和45 μmol/L 組的SiHa 細(xì)胞中cyclin D1 和CDK2 表達(dá)量均降低（P＜0.05），G0～G1期細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05），S 期細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05），G2～M期細(xì)胞百分比變化不顯著（P＞0.05），見圖1和表2。

表2 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期的影響/±s

表2 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期的影響/±s

注：①與蜂斗菜素0μmol/L組相比較，P＜0.05。

組別蜂斗菜素0μmol/L蜂斗菜素5μmol/L蜂斗菜素15μmol/L蜂斗菜素45μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)9 999 cyclinD1 0.73±0.08 0.54±0.06 ①0.45±0.07①0.33±0.06①55.31＜0.001 CDK2 0.53±0.04 0.36±0.05①0.33±0.04①0.32±0.05①42.29＜0.001細(xì)胞周期/%G0～G1 43.59±2.15 56.26±3.57 60.85±3.84①62.32±4.15①52.86＜0.001 S 37.89±2.18 25.04±2.32①22.97±2.27①19.48±2.45①109.07＜0.001 G2～M 20.46±2.34 21.83±2.89 20.50±2.67 19.37±2.56 1.33 0.283

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測cyclinD1和CDK2蛋白的表達(dá)

2.3 不同濃度蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響與蜂斗菜素0 μmol/L 相比，蜂斗菜素5 μmol/L組、15 μmol/L 組和45 μmol/L 組的SiHa 細(xì)胞中Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)量均升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率也顯著升高（P＜0.05），見圖2和表3。

表3 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞SiHa凋亡的影響/±s

表3 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞SiHa凋亡的影響/±s

注：Cleaved-caspase-9 為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；Cleaved-caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。①與蜂斗菜素0μmol/L組相比較，P＜0.05。

組別蜂斗菜素0μmol/L蜂斗菜素5μmol/L蜂斗菜素15μmol/L蜂斗菜素45μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)9999 Cleaved caspase-3 0.28±0.05 0.38±0.04①0.59±0.04①0.67±0.06①126.71＜0.001 Cleaved caspase-9 0.17±0.05 0.28±0.04①0.43±0.03①0.56±0.05①139.84＜0.001細(xì)胞凋亡率/%3.12±0.48 8.64±1.11①12.76±1.30①15.43±1.65①176.24＜0.001

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)

2.4 不同濃度蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞AKT 信號通路的影響與蜂斗菜素0 μmol/L 相比，蜂斗菜素5μmol/L 組、15μmol/L 組和45μmol/L 組的SiHa 細(xì)胞中p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），PI3K 和AKT 蛋白含量無顯著變化，見圖3和表4。

表4 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞AKT信號通路的影響/±s

表4 不同濃度的蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞AKT信號通路的影響/±s

注：PI3K 為磷脂酰肌醇3-激酶，AKT 為絲/蘇氨酸蛋白激酶，p-AKT 為磷酸化的絲/蘇氨酸蛋白激酶。①與蜂斗菜素0μmol/L 組相比較，P＜0.05。

組別蜂斗菜素0μmol/L蜂斗菜素5μmol/L蜂斗菜素15μmol/L蜂斗菜素45μmol/L F值P值重復(fù)次數(shù)9999 p-PI3K 0.52±0.04 0.43±0.03①0.32±0.05①0.18±0.03①131.14＜0.001 PI3K 0.43±0.04 0.41±0.05 0.44±0.04 0.40±0.05 1.46 0.243 p-AKT 0.63±0.05 0.38±0.06①0.27±0.05①0.14±0.04①152.59＜0.001 AKT 0.52±0.05 0.54±0.06 0.51±0.05 0.53±0.06 0.49 0.691

圖3 不同濃度蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞AKT信號通路的影響

2.5 AKT 信號通路激活劑部分逆轉(zhuǎn)蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞的抑制作用用45 μmol/L 蜂斗菜素和AKT 信號通路激活劑IGF-1 處理SiHa 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGF-1 可促進(jìn)AKT 信號通路蛋白p-PI3K 和p-AKT的表達(dá)，SiHa細(xì)胞在24、48和72 h時細(xì)胞OD值均顯著升高（P＜0.05），見圖4和表5。

表5 AKT信號通路激活劑IGF-1和蜂斗菜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞AKT信號通路和細(xì)胞增殖的影響/±s

表5 AKT信號通路激活劑IGF-1和蜂斗菜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞AKT信號通路和細(xì)胞增殖的影響/±s

注：PI3K為磷脂酰肌醇3-激酶，AKT為絲/蘇氨酸蛋白激酶，p-AKT為磷酸化的絲/蘇氨酸蛋白激酶。

組別蜂斗菜素45μmol/L+PBS蜂斗菜素45μmol/L+IGF-1 t值P值重復(fù)次數(shù)99 p-PI3K 0.37±0.04 0.53±0.05 7.50＜0.001 PI3K 0.41±0.06 0.45±0.05 1.54 0.144 p-AKT 0.32±0.03 0.54±0.06 9.84＜0.001 AKT 0.61±0.05 0.57±0.06 1.54 0.144細(xì)胞活力（OD490）24 h 0.32±0.03 0.43±0.04 6.60＜0.001 48 h 0.52±0.05 0.74±0.06 8.45＜0.001 72 h 0.79±0.08 1.09±0.09 7.47＜0.001

圖4 AKT信號通路激活劑部分逆轉(zhuǎn)蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞的抑制作用

2.6 AKT 信號通路激活劑和蜂斗菜素對宮頸癌Si-Ha細(xì)胞周期和凋亡的作用與蜂斗菜素45μmol/L+PBS組相比，蜂斗菜素45μmol/L+IGF-1組SiHa細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白cyclinD1 和CDK2 表達(dá)量顯著升高，凋亡蛋白Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9表達(dá)均降低，細(xì)胞凋亡率降低，G0～G1 期細(xì)胞百分比顯著降低，S 期細(xì)胞百分比顯著升高，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5和表6。

表6 絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號通路激活劑IGF-1和蜂斗菜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響/±s

表6 絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）信號通路激活劑IGF-1和蜂斗菜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響/±s

注：cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，CDK2為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2，Cleaved-caspase-3為活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。

組別蜂斗菜素45μmol/L+PBS蜂斗菜素45μmol/L+IGF-1 t值P值重復(fù)次數(shù)99 cyclinD1 0.38±0.04 0.61±0.06 9.57＜0.001 CDK2 0.42±0.04 0.49±0.05 3.28＜0.001 Cleaved caspase-3 0.78±0.05 0.48±0.06 11.52＜0.001 Cleaved caspase-9 0.65±0.05 0.31±0.06 13.06＜0.001細(xì)胞周期/%G0～G1 63.21±2.38 48.66±3.51 10.29＜0.001 S 27.07±2.52 31.73±2.72 3.77＜0.001 G2～M 20.46±1.61 21.83±1.55 1.84 0.085細(xì)胞凋亡率/%13.96±1.63 6.08±0.85 12.86＜0.001

圖5 IGF-1和蜂斗菜素對宮頸癌SiHa細(xì)胞中增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

在發(fā)展中國家，每年大約有25萬多人死于宮頸癌；宮頸癌病人確診時多為晚期，病人治療效果差，化療的副作用導(dǎo)致病人生存質(zhì)量低［8］。研究表明，多種中藥（黃芪提取物和萹蓄提取物等）均對宮頸癌HeLa 細(xì)胞具有抑制作用［9-10］，中藥聯(lián)合放化療的綜合治療方法可有效提高病人機(jī)體免疫功能，降低不良反應(yīng)，提高病人生存質(zhì)量［11］。

蜂斗菜素是藥食兩用蜂斗菜的有效活性成分之一，有抗炎、解痙、抗癌活性。研究表明，蜂斗菜素可通過AKT/mTOR 通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW-620 的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲［12］。蜂斗菜素可抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。蜂斗菜素也對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用和周期阻滯作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］。蜂斗菜素對宮頸癌是不是也具有同樣的抑制作用尚不清楚。本研究用5、15、45μmol/L蜂斗菜素處理宮頸癌SiHa細(xì)胞，通過檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞OD 值隨培養(yǎng)時間和蜂斗菜素濃度升高均逐漸降低，細(xì)胞凋亡率升高，呈濃度和時間依賴性，細(xì)胞中增殖蛋白cyclin D1、CDK2 含量降低，凋亡蛋白Cleaved caspase-3 和Cleaved caspase-9 含量升高，G0～G1期細(xì)胞百分比升高，S期細(xì)胞百分比降低，說明蜂斗菜素可使SiHa細(xì)胞停滯在G0～G1期，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與上述研究結(jié)果［14］類似。本研究結(jié)果證實(shí)了蜂斗菜素對宮頸癌細(xì)胞具有抑制作用，但具體機(jī)制還有待研究。

AKT 信號通路在腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及耐藥性中都發(fā)揮重要作用，且AKT 信號通路蛋白AKT 和p-AKT 在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致AKT 通路異常激活［15］。多種藥物包括白樺脂醇、順鉑等均可通過AKT 信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［16-17］。且蜂斗菜素可通過AKT/mTOR 通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞［12］，因此本研究假設(shè)蜂斗菜素通過AKT 信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞。通過檢測發(fā)現(xiàn)，蜂斗菜素處理后SiHa 細(xì)胞中p-PI3K 和p-AKT 蛋白含量均顯著降低，說明AKT 信號通路被抑制；而AKT信號通路激活劑IGF-1 處理被蜂斗菜素抑制的SiHa細(xì)胞后p-PI3K 和p-AKT 含量升高，蜂斗菜素對SiHa細(xì)胞的抑制作用被部分逆轉(zhuǎn)，說蜂斗菜素確實(shí)通過AKT信號通路抑制SiHa細(xì)胞。

綜上所述，本研究闡述了蜂斗菜素可能通過AKT 信號通路阻滯宮頸癌SiHa 細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。蜂斗菜素對宮頸癌可能具有的潛在治療作用。