高淼，蔡繼寶，徐振宇，田大雨，蘇加坤，張翼，楊俊*

煙草與煙氣化學(xué)

煙草木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的二維核磁共振波譜表征

高淼1，蔡繼寶2，徐振宇2，田大雨1，蘇加坤2，張翼2，楊俊1*

1中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥市徽州大道1129號 230051；2江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，南昌市京東大道201號 330096

【】煙草木質(zhì)素對煙草品質(zhì)和安全性有重要影響，為了提高煙草制品的質(zhì)量，需要探究煙草木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及含量。利用二維異核單量子相干核磁共振技術(shù)（2D HSQC NMR）建立表征煙草木質(zhì)素的方法，實(shí)現(xiàn)煙草木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)表征及半定量分析。（1）煙草樣品木質(zhì)素中共發(fā)現(xiàn)10種主要的木質(zhì)素基本單元及單元間連接鍵結(jié)構(gòu)，27種相關(guān)結(jié)構(gòu)的信號。（2）煙草樣品木質(zhì)素是SGH型木質(zhì)素，愈創(chuàng)木基（G）是最主要的基本單元，含量在50.72%～73.50%范圍內(nèi)，紫丁香基（S）的含量在15.62%～26.51%范圍內(nèi)，對羥基苯基（H）的含量在5.66%～28.90%范圍內(nèi)；β-芳基醚單元β-O-4（A）是最主要的單元間連接鍵，含量在72.93%～92.97%范圍內(nèi)，樹脂醇單元β-β（C）次之，含量在3.88%～15.81%范圍內(nèi)。（3）烤煙煙葉部位自上而下，紫丁香基（S）單元的含量逐漸減少，愈創(chuàng)木基（G）和對羥基苯基（H）單元的含量逐漸增加。梗絲和煙草薄片與煙葉相比，愈創(chuàng)木基（G）單元的含量較高，對羥基苯基（H）單元的含量較低，β-芳基醚單元β-O-4（A）的含量較低，樹脂醇單元β-β（C）的含量較高。本研究實(shí)現(xiàn)了不同煙草木質(zhì)素的基本單元及單元間連接鍵結(jié)構(gòu)的定性表征和半定量分析，提出煙草木質(zhì)素分子的結(jié)構(gòu)示意圖，為煙草木質(zhì)素大分子研究提供一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

二維核磁共振；HSQC；煙草；木質(zhì)素；結(jié)構(gòu)表征；定量分析

木質(zhì)素是由紫丁香基（S）、愈創(chuàng)木基（G）和對羥基苯基（H）等基本單元組合成的一種復(fù)雜的，高度交聯(lián)的網(wǎng)狀多酚類聚合物[1-2]，與纖維素、半纖維素等成分共同構(gòu)成次生植物細(xì)胞壁。煙草中木質(zhì)素不僅有增強(qiáng)煙株抗倒伏性和抵御微生物侵害等生物學(xué)功能，還對卷煙的品質(zhì)有重要影響[3]。在煙葉調(diào)制和醇化階段，煙草木質(zhì)素降解產(chǎn)生苯甲醇、苯乙醛等一系列芳香族小分子致香成分，對煙草的吸食品質(zhì)起到積極作用[4]；在卷煙燃吸過程中，煙草木質(zhì)素?zé)崃呀馍煞宇?、醛類、稠環(huán)芳烴類等有害物質(zhì)，引起澀口，對煙草的吸食品質(zhì)有負(fù)面作用，此外這些物質(zhì)還具有促癌或致癌活性，影響煙草制品的吸食安全性[5-6]。深入研究煙草木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及含量，可為提高煙草制品的吸食品質(zhì)和安全性提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

目前，表征木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的方法包括濕化學(xué)法和儀器分析法。濕化學(xué)法是通過硫代酸解（TA）、硝基苯氧化（NBO）或衍生化后還原裂解（DFRC）等手段將木質(zhì)素降解為低分子量化合物，然后經(jīng)過酯化、乙酰化處理后采用色譜技術(shù)進(jìn)行定性或定量分析[7-9]，通過解釋降解過程的數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)了對木質(zhì)素大分子組成和結(jié)構(gòu)的初步了解，但其得出的降解過程數(shù)據(jù)僅占總聚合物的一部分。儀器分析法包括紫外光譜法、紅外光譜法、核磁共振波譜法等，其中紫外光譜法、紅外光譜法提供的結(jié)構(gòu)信息有限，核磁共振技術(shù)包括1H NMR、13C NMR、二維核磁共振波譜等，然而常規(guī)的一維1H NMR信號重疊，13C NMR靈敏度低，無法對各個信號進(jìn)行詳細(xì)的歸屬和定量，限制了其應(yīng)用[10-12]。隨著核磁共振技術(shù)的發(fā)展，二維核磁共振波譜提高了圖譜分辨率，減少了信號之間的重疊，可獲得更詳細(xì)的信號歸屬，包括同核位移相關(guān)譜（Correlation Spectroscopy）、異核位移相關(guān)譜（Heteronuclear Multiple Quantum Coherence 、Heteronuclear Multiple-Bond Correlation、Heteronuclear Single Quantum Coherence）和NOE類相關(guān)譜（Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy、Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy），其中二維異核單量子相干譜（Two-dimentional Heteronuclear Single Quantum Coherence，2D HSQC）多用于木質(zhì)素樣品的分析檢測。 2D HSQC NMR是將官能團(tuán)上直接相連的碳核和氫核的峰組關(guān)聯(lián)起來，通過獲取氫核數(shù)據(jù)從而大大提高波譜的分辨率，其靈敏度比傳統(tǒng)的13C NMR提高了30多倍[13]。近年來，以球磨植物細(xì)胞壁直接溶脹在核磁共振溶劑中的溶液態(tài)2D HSQC NMR成為研究木本類木質(zhì)素原始結(jié)構(gòu)的主要方法。Ralph等使用2D HSQC NMR先后分析乙?；举|(zhì)素及高度球磨后松樹、楊樹的全植物細(xì)胞壁，得到了這些物質(zhì)的具有較高分辨率的二維核磁共振譜圖[14-17]。Ragauskas等改進(jìn)了溶劑體系，以DMSO-d6/HMPA-d18（4:1 v/v）為溶劑用于楊樹等植物細(xì)胞壁溶脹，在一定程度上提高了生物質(zhì)樣品的溶脹度和遷移率，增強(qiáng)了核磁共振的信號[18]。溶液態(tài)2D HSQC NMR具有分辨率高、樣品處理簡單和不破壞植物的原始結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，它除了在定性表征方面有絕對的優(yōu)勢，還可進(jìn)行定量分析[13,19]。最常用的是2D HSQC NMR的半定量分析法，通過分別對波譜的不同區(qū)域進(jìn)行體積積分估算其所占比例[20]。2D HSQC NMR已廣泛應(yīng)用于松樹、楊樹和多年生芒草等生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征[21]，但由于行業(yè)核磁共振儀器尚不普及，導(dǎo)致煙草木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的二維核磁共振研究鮮有報道。

本文通過優(yōu)化溶劑種類和樣品前處理技術(shù)，建立了表征煙草木質(zhì)素的2D HSQC NMR方法，實(shí)現(xiàn)對煙草木質(zhì)素基本單元及單元間連接鍵信號的定性歸屬和定量分析，提出煙葉木質(zhì)素分子的結(jié)構(gòu)示意圖。為提高煙草制品的吸食品質(zhì)和安全性提供重要的基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)樣品為烤煙（B2F、C2F、X2F，湖北恩施，2019年）、白肋煙（C2F，湖北恩施，2019年）、香料煙（B2，云南保山，2016年）、梗絲、煙草薄片（由江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供）。煙葉樣品均除去莖脈，全部實(shí)驗(yàn)樣品在50℃下烘干2 h后進(jìn)行機(jī)械粉碎，過40目篩，密封儲存以備用。

松柏醇（標(biāo)準(zhǔn)品，>98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；脫堿木質(zhì)素（95%，北京沃凱生物科技有限公司，CAS號9005-53-2）；氘代吡啶（Pyridine-d5，D，99.5%）、氘代二甲基亞砜（DMSO-d6，D，99.9%）、氘代六甲基磷酰三胺（HMPA-d18，D，99.6%）（上海麥克林生化科技有限公司）；纖維素分解酶Cellic? Ctec2（100 FPU/mL，Sigma-Aldrich公司）；甲苯、乙醇、冰醋酸、醋酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

Bruker Avance Ⅲ 600 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀配備5 mm帶Z梯度場線圈1H/13C/15N三共振反式超低溫探頭（德國Bruker公司）、DECO-PBM-V-0.4L球磨機(jī)配備4個100 mL瑪瑙球磨罐（長沙市德科儀器設(shè)備有限公司）、XW-80A漩渦振蕩器（上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司）、FD-2D-80真空冷凍干燥機(jī)（上海舜制儀器制造有限公司）、DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、S7500超聲儀（上海必能信超聲有限公司）、TDL-5-A離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、THZ-92B數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器（常州市金壇科興儀器廠）、JA2003電子天平（感量0.001 g，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 全植物細(xì)胞壁樣品的制備

取10 g煙草樣品，用甲苯-乙醇混合溶液（2:1 v/v）索氏提取預(yù)粉碎的樣品8 h，風(fēng)干然后置于60℃的烘箱內(nèi)烘干，得到去脂樣品。取去脂樣品1 g，置于100 mL球磨罐中球磨6 h，球磨機(jī)工作環(huán)境為室溫，轉(zhuǎn)速設(shè)置為600 r/min，為防止球磨過程中植物粉末溫度過度升高，球磨機(jī)每工作20 min后休息10 min，得到全植物細(xì)胞壁樣品（WCW），密封保存，以備分析。

1.2.2 木質(zhì)素的提取及純化

1.2.2.1 酸洗-酶解法提取

采用煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 347—2010[22]中酸性洗滌方案對10 g煙草樣品進(jìn)行預(yù)處理，以去除半纖維素等成分。將獲得的酸性洗滌纖維置于250 mL錐形瓶中，加入pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和纖維素分解酶。50℃下，在空氣浴搖床中孵育48 h后，離心除去上清液，用乙酸緩沖液和二次蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥后得到酸洗-酶解木質(zhì)素（AEL），密封保存以備分析。

1.2.2.2 堿溶法提取

參考文獻(xiàn)[23-24]的方法對煙草樣品進(jìn)行堿溶法提取。取10 g去脂煙草樣品，置于500 mL燒瓶中，加入200 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，將燒瓶置于恒溫水浴鍋在100℃下反應(yīng)4 h，離心，過濾，用雙蒸水洗滌，收集濾液，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液pH 5.5～6.0，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約50 mL，將濾液滴入3倍體積的95%的乙醇溶液中進(jìn)行純化，離心收集上清液，再次減壓濃縮，將濃縮液滴入10倍體積pH 2的鹽酸溶液中，析出堿提木質(zhì)素沉淀（AL），冷凍干燥后保存，以備分析。

1.2.3 核磁共振樣品的制備

稱取一定量的實(shí)驗(yàn)樣品，轉(zhuǎn)移到5 mm核磁共振管中，樣品盡可能從試管底部和側(cè)面向上分布。加入0.5 mL核磁共振溶劑，旋渦振蕩5～15 min，超聲1～3 h（取決于樣品），使樣品溶解或溶脹在溶劑體系中。

1.2.4 核磁共振分析

核磁共振譜是在600 MHz Bruker Avance Ⅲ超導(dǎo)核磁共振譜儀上獲得的，儀器配備超低溫探頭，在298 K下，采用標(biāo)準(zhǔn)布魯克脈沖序列（invietgssi）實(shí)現(xiàn)。具體參數(shù)如下：F2（1H）維度的譜寬為11 ppm，采樣點(diǎn)為1024 （TD1）；F1（13C）維度的譜寬為170 ppm，采樣點(diǎn)為256（TD2）；掃描次數(shù)（NS）為64；掃描延遲（D1）1 s。使用DMSO-d6溶劑中心峰（δC/δH= 39.52/2.50 ppm）進(jìn)行化學(xué)位移校準(zhǔn)，并使用MestReNova 6.1軟件對HSQC譜中的特征峰進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙草木質(zhì)素2D HSQC NMR定性分析

2.1.1 2D HSQC NMR溶劑體系的優(yōu)化

2D HSQC NMR的溶劑應(yīng)具備對待測樣品有良好溶解度且不破壞樣品的天然結(jié)構(gòu)和連接的特點(diǎn)，并且得到的樣品溶液應(yīng)具有較小的粘度，以獲得較長的T2弛豫時間。同時，為了進(jìn)行較為準(zhǔn)確的半定量研究，應(yīng)基于在波譜區(qū)域中獲得較高的信號強(qiáng)度和信號分散來選擇溶劑。目前，用于木質(zhì)素2D HSQC NMR分析的溶劑體系有DMSO-d6、DMSO-d6/Pyridine-d5（4:1 v/v）、DMSO-d6/HMPA-d18（4:1 v/v）、DMSO/四丁基氟化銨（TBAF）、DMSO/氮甲基咪唑（NMI）[14-16,18]。但是，DMSO/TBAF、DMSO/NMI溶劑體系需要對樣品進(jìn)行乙?；瘜?shí)驗(yàn)，從而導(dǎo)致部分信息丟失[15]。因此，我們選擇DMSO-d6、DMSO-d6/Pyridine-d5（4:1 v/v）、DMSO-d6/HMPA-d18（4:1 v/v）3種溶劑體系，來探討溶劑對木質(zhì)素二維核磁共振譜圖的影響。將50 mg脫堿木質(zhì)素分別溶解在0.5 mL以上3種溶劑體系中進(jìn)行2D HSQC NMR分析。脫堿木質(zhì)素在以上3種溶劑中的溶解和流動性狀況如圖1所示，脫堿木質(zhì)素在以上3種溶劑體系中均可完全溶解，且呈棕褐色溶液。與DMSO-d6和DMSO-d6/Pyridine-d5相比，脫堿木質(zhì)素在DMSO-d6/HMPA-d18溶液流動性更好，粘度更低，有利于提高信號分辨率，獲得更高質(zhì)量的二維HSQC NMR譜圖。這是因?yàn)镠MPA的P=O鍵高度極化，氧原子帶強(qiáng)負(fù)電荷，作為一種強(qiáng)極性非質(zhì)子溶劑，HMPA-d18的加入可能會產(chǎn)生溶劑化效應(yīng)，增加樣品溶液的流動性[18]。

注：(a)DMSO-d6, (b)DMSO-d6/Pyridine-d5, (c)DMSO-d6/HMPA-d18。

脫堿木質(zhì)素在DMSO-d6、DMSO-d6/Pyridine-d5（4:1 v/v）和DMSO-d6/HMPA-d18（4:1 v/v）中的2D HSQC NMR譜圖如圖2所示，木質(zhì)素的二維譜圖可分為2個區(qū)域：木質(zhì)素邊鏈區(qū)（δH2.5-6.0 ppm, δC50-90 ppm）和芳香區(qū)（δH6.0-8.0 ppm, δC100-150 ppm）。圖3是木質(zhì)素邊鏈區(qū)和芳香區(qū)的局部放大圖，由圖3可知，木質(zhì)素邊鏈區(qū)由不同類型的木質(zhì)素連接鍵組成，包括β-芳基醚單元β-O-4（A），苯基香豆素單元β-5（B），樹脂醇單元β-β（C）；芳香區(qū)有紫丁香基單元（S）、愈創(chuàng)木基單元（G）、對羥基苯基單元（H）、阿魏酸鹽（FA）和肉桂醇端基（XI）信號出現(xiàn)，這些基本單元及單元間連接鍵的信號依據(jù)文獻(xiàn)報道的化學(xué)位移[16,18]進(jìn)行歸屬，定性表征結(jié)果見表1。由表1可知，在DMSO-d6溶劑中A-Sβ、Bβ、Cβ等信號均不能被檢測到，在DMSO-d6/Pyridine-d5溶劑中Bβ、Cβ等信號不能被檢測到，而在DMSO-d6/HMPA-d18（4:1 v/v）混合溶劑中脫堿木質(zhì)素主要的特征峰信號均可被檢測到。與其它2種溶劑相比，在DMSO-d6/HMPA-d18溶劑中木質(zhì)素芳香區(qū)中S'2/6、G6、FA6相關(guān)的峰較為分散，對羥基苯基H2,6的信號峰強(qiáng)度較高。綜上，DMSO-d6/HMPA-d18溶劑中得到的木質(zhì)素的相關(guān)信號最豐富并且分散，所以本研究優(yōu)選DMSO-d6/HMPA- d18作為木質(zhì)素的最佳NMR分析溶劑。

注：(a)DMSO-d6, (b)DMSO-d6/Pyridine-d5, (c)DMSO-d6/HMPA-d18。

注：(a)DMSO-d6, (b)DMSO-d6/Pyridine-d5, (c)DMSO-d6/HMPA-d18。

表1 不同溶劑中木質(zhì)素樣品主要單元的2D HSQC NMR譜圖信號歸屬

Tab.1 Assignments of main cross-peaks in 2D HSQC NMR spectra of lignin in different solvents

2.1.2 煙草木質(zhì)素的2D HSQC NMR結(jié)構(gòu)表征

在DMSO-d6/HMPA-d18溶劑中，對烤煙中部煙葉的堿提木質(zhì)素（AL）進(jìn)行2D HSQC NMR分析，共檢測出27種木質(zhì)素基本單元及單元間連接鍵結(jié)構(gòu)的信號，見圖4，對圖4中特征峰信號進(jìn)行歸屬得到表1定性表征結(jié)果。如圖4所示，煙草木質(zhì)素二維譜圖的邊鏈區(qū)同脫堿木質(zhì)素邊鏈區(qū)類似，有β-芳基醚單元β-O-4（A），苯基香豆素單元β-5（B），樹脂醇單元β-β（C），二苯并二噁英單元5-5/β-O-4（D）和甲氧基信號的出現(xiàn)。木質(zhì)素單元間連接鍵中最突出的信號對應(yīng)于β-O-4（A）連接的芳基之間的醚鍵和樹脂醇單元β-β（C）連接的芳基之間的C-C鍵。在這幾種木質(zhì)素單元間連接鍵中，首先，β-O-4（A）的13Cα-1Hα相關(guān)性顯示兩個重疊的信號，這可以解釋為在煙葉木質(zhì)素的β-O-4（A）結(jié)構(gòu)包含至少2個不同的變體。變體可能包括在Aα（G/H），Aα（S）的γ-C上有一個游離羥基的β-O-4'（A′）；在 γ-C為酯化形成對羥基苯甲酸酯結(jié)構(gòu)的β-O-4''（A''）。特別是，在δC/δH63.34/3.96 ppm處可明顯觀察到γ-乙?；摩?O-4的信號。其次，應(yīng)位于δC/δH53.14/3.82 ppm處的苯基香豆素單元β-5（B）的Cβ-Hβ與甲氧基基團(tuán)的信號重疊，而樹脂醇單元β-β（C）的Cβ-Hβ信號與甲氧基基團(tuán)的信號則能夠良好分離，位于53.50/3.04 ppm處。最后，在δC/δH83.45/5.01 ppm處出現(xiàn)痕量的二苯并二噁英單元5-5/β-O-4（Dα）信號峰，并且與β-O-4（A），β-5（B），β-β（C）等木質(zhì)素間連接鍵的α位13C-1H相關(guān)信號峰分離，有利于進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量分析。

在煙草木質(zhì)素芳香區(qū)（圖4b）中，可清晰檢測到紫丁香基（S）、愈創(chuàng)木基（G）和對羥基苯基（H）芳香環(huán)的結(jié)構(gòu)信號。S型單元的C2,6-Ｈ2,6相關(guān)峰主要在δC/δH103.21/6.64 ppm，而Cα被氧化的結(jié)構(gòu)S′在δC/δH107.66/7.27 ppm位置顯示一個相對較弱的信號。G型單元的C5-H5和C6-H6相關(guān)峰分別在δC/δH115.04/6.88 ppm和117.59/6.93 ppm位置被觀察到，而G型單元被氧化成α-酮的C2-H2和C6-H6相關(guān)峰分別位于δC/δH111.17/7.48 ppm和122.52/7.48 ppm。在δC/δH127.70/7.20 ppm處H單元的C2,6-H2,6相關(guān)峰與在δC/δH128. 80/7.23 ppm苯丙氨酸的相關(guān)峰有重疊，這會導(dǎo)致H單元的含量被高估，這與Wang等相關(guān)研究一致[25]。此外，在δC/δH110.85/7.29 ppm和123.30/7.14 ppm處清楚地檢測到阿魏酸酯FA的C2-H2和C6-H6相關(guān)峰，表明該單元存在于煙葉木質(zhì)素中。據(jù)報道，阿魏酸酯在草本植物中通過酯鍵和醚鍵與半纖維素形成木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物（LCC）[26]。通過以上對煙草木質(zhì)素的定性分析可知，2D HSQC NMR分辨率良好，適合煙草木質(zhì)素的表征。

注：（a）邊鏈區(qū)，（b）芳香區(qū)，（c）木質(zhì)素組分的分子結(jié)構(gòu)。

Note:(a) Side-chain region, (b) Aromatic region, (c) Molecular structures of lignin components.

圖4 DMSO-d6/HMPA-d18溶劑中烤煙中部煙葉堿提木質(zhì)素的2D HSQC NMR譜圖

Fig.4 2D HSQC NMR spectra of alkali-lignin from middle leafs of flue-cured tobacco in DMSO-d6/HMPA-d18

2.1.3 松柏醇的2D HSQC NMR分析

松柏醇是愈創(chuàng)木基（G）型木質(zhì)素的單體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖5a所示，松柏醇的二維核磁譜圖特征峰數(shù)量少，峰形簡單，易于分辨，因此本文選擇松柏醇對2D HSQC NMR方法進(jìn)行驗(yàn)證。將50 mg松柏醇樣品分別溶于DMSO-d6和DMSO-d6/HMPA-d18中，通過渦旋振蕩、超聲等手段，使樣品溶解在溶劑中后進(jìn)行2D HSQC NMR分析。

松柏醇在兩種溶劑中的二維核磁共振譜圖見圖5，相關(guān)峰的化學(xué)位移歸屬見表2。由表2知，在DMSO-d6中松柏醇的化學(xué)位移與文獻(xiàn)[18]相比高度一致；在DMSO-d6和DMSO-d6/HMPA-d18兩種溶劑體系中，松柏醇特征峰的化學(xué)位移差值均小于0.2 ppm，因此DMSO-d6/HMPA-d18作為核磁共振溶劑對木質(zhì)素組分的化學(xué)位移沒有影響。此外，HMPA-d18溶劑峰的信號位于35.53/2.47 ppm處，不干擾木質(zhì)素組分共振峰的定性定量分析。為了確定日間精密度，在同一參數(shù)下連續(xù)3 d對溶于DMSO-d6/HMPA-d18溶劑中的松柏醇進(jìn)行2D HSQC NMR檢測，通過比較同一樣品的多次波譜采集結(jié)果確定精密度。結(jié)果表明，松柏醇特征峰的化學(xué)位移偏差均小于0.1 ppm，特征峰化學(xué)位移δC/δH的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于0.2%。說明在DMSO-d6/HMPA-d18溶劑體系內(nèi)進(jìn)行2D HSQC NMR實(shí)驗(yàn)的精密度較好，可以實(shí)現(xiàn)樣品的準(zhǔn)確定性表征。

注：(a)DMSO-d6, (b)DMSO-d6/HMPA-d18。

表2 松柏醇在不同溶劑中的2D HSQC NMR譜圖信號歸屬

Tab.2 Assignments of main cross-peaks in 2D HSQC NMR spectra of coniferyl alcohol in different solvents

2.2 煙草木質(zhì)素2D HSQC NMR定量分析

2.2.1 不同含量脫堿木質(zhì)素的2D HSQC NMR定量分析

通過2D HSQC NMR對木質(zhì)素的主要基本單元和單元間連接鍵進(jìn)行定量分析，可以更好地了解木質(zhì)素片段的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。然而，2D HSQC NMR由于1H-13C耦合常數(shù)的偏差、非共振效應(yīng)、1H T1弛豫效應(yīng)、1H和13C T2弛豫效應(yīng)以及1H同核耦合效應(yīng)[1]，難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，目前主要以半定量分析為主。2D HSQC NMR的半定量分析是在同一水平下比較木質(zhì)素基本單元和單元間連接鍵的體積積分來實(shí)現(xiàn)相對定量。Cheng等用木質(zhì)素基本單元的相對體積積分之和表示樣品中木質(zhì)素的相對含量，具體計算如公式1所示[21]。木質(zhì)素基本單元的相對含量是每種木質(zhì)素基本單元的體積積分占總木質(zhì)素基本單元體積積分之和的比例，如公式2所示。單元間連接鍵的相對含量則是每種單元間連接鍵的體積積分占總單元連接鍵體積積分的比例，如公式3所示[13,21]。

其中，（2/6+'2/6），（2+6），（2/6），（2+6），（2/6）分別代表S和S'，G，H，F(xiàn)A，PB在2、6位的體積積分之和；，，，分別代表 β-O-4，β-5，β-β，5-5/β-O-4在α位的體積積分；I，I分別代表待測木質(zhì)素基本單元和單元間連接鍵的體積積分；令木質(zhì)素基本單元S、G、H的相對含量之和為100%，即[0.5 (2/6+2/6)]%+(2)%+[0.5(2/6)]%=100%；木質(zhì)素基本單元間連接鍵A、B、C、D的相對含量之和為100%，即%+%+%+%=100%。

為了獲得高分辨、高靈敏度的二維核磁共振譜圖，不僅需提高核磁共振儀器的分辨率，還要求核磁共振樣品中木質(zhì)素含量足夠高。為探討木質(zhì)素核磁共振樣品中木質(zhì)素的量對2D HSQC NMR分析結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了2.5 mg、5 mg、10 mg、15 mg四種不同含量的脫堿木質(zhì)素溶液（0.5 mL DMSO-d6/HMPA-d18，v/v 4:1）進(jìn)行2D HSQC NMR分析，譜圖如圖6所示，對圖6中信號歸屬結(jié)果見表3。由圖6可知，隨著木質(zhì)素含量的增大，譜圖中信號越來越豐富。以溶劑DMSO-d6中甲基的C-H相關(guān)峰（δC/δH39.52/2.50 ppm）作為參考，把其體積積分設(shè)為100，即設(shè)I（DMSO-d6）=100，將木質(zhì)素基本單元的體積積分與之比較，得到各個脫堿木質(zhì)素基本單元的相對體積積分，再代入公式1計算，得到不同含量脫堿木質(zhì)素的相對體積積分，結(jié)果如圖7所示，隨著脫堿木質(zhì)素含量增大，可檢出的脫堿木質(zhì)素芳香區(qū)的相對體積積分也隨之增大。結(jié)合表3，對不同含量脫堿木質(zhì)素2D HSQC NMR譜圖信號歸屬，可知當(dāng)木質(zhì)素含量在2.5 mg時，可檢測到11種木質(zhì)素特征峰信號；木質(zhì)素含量在5 mg時，可檢測到19種木質(zhì)素特征峰信號；木質(zhì)素含量在10 mg以上時，可檢測到所有主要的特征峰信號。研究表明，只有核磁共振樣品中木質(zhì)素含量在10 mg以上，即計算所得木質(zhì)素的相對含量在21.83以上時，才能夠得到清晰分辨的高靈敏二維核磁共振譜圖。

注：(a)2.5 mg, (b) 5 mg, (c)10 mg, (d)15 mg。

表3 不同含量脫堿木質(zhì)素在DMSO-d6/HMPA-d18溶劑中的2D HSQC NMR信號歸屬

Tab.3 Assignments of 2D HSQC NMR spectra of different contents of dealkaline lignin in DMSO-d6/HMPA-d18

圖7 不同含量脫堿木質(zhì)素的相對體積積分

2.2.2 煙草木質(zhì)素的2D HSQC NMR定量分析

王婉婉等[27]對楊樹、松樹等木本類作物的全植物細(xì)胞壁溶液態(tài)二維核磁共振進(jìn)行研究，得到了分辨率良好的二維譜圖。但楊樹、松樹的木質(zhì)素含量約在25%～30%，而煙葉中木質(zhì)素含量約在3.5%～7.5%之間[28]，因此，要得到清晰煙草木質(zhì)素的二維核磁共振譜圖，需要對煙草樣品進(jìn)行預(yù)處理，以提高煙草核磁共振樣品木質(zhì)素的相對含量。通常，植物樣品中木質(zhì)素分離的預(yù)處理方法分為4類，有機(jī)溶劑提取法、酶解法、酸析法和堿溶法[24,29-30]。有機(jī)溶劑提取法是通過降解半纖維素和木質(zhì)素間交聯(lián)的酯鍵，使木質(zhì)素溶解，再重結(jié)晶于酸性水溶液中來分離木質(zhì)素。但由于有機(jī)溶劑提取法具有提取率低、成本高等特點(diǎn)而不適合煙草木質(zhì)素的提取。酶解法則是通過特定的蛋白酶降解纖維素和半纖維素等物質(zhì)，木質(zhì)素留在固體中，該方法具有特異性高、生物友好等特點(diǎn)，但是過程速度慢、耗時長，且可能會引入蛋白質(zhì)雜質(zhì)。酸析法是在酸性條件下使纖維素和半纖維素等干擾成分發(fā)生水解，木質(zhì)素留在固體中。但是，濃酸條件下木質(zhì)素芳基醚鍵發(fā)生了嚴(yán)重的斷裂。通常也可采用酸性洗滌劑法[22]與酶解法結(jié)合來分離木質(zhì)素，但是實(shí)驗(yàn)過程繁瑣，需要多次洗滌，可能會產(chǎn)生操作誤差。堿溶法是通過降解木質(zhì)素與碳水化合物之間的鍵，使木質(zhì)素溶出，該方法具有提取率高，成本低，實(shí)驗(yàn)易操作等特點(diǎn)。

因此，本研究選擇僅進(jìn)行去脂后的煙葉全植物細(xì)胞壁（WCW），酸洗-酶解木質(zhì)素（AEL）以及使用堿溶法提取的堿提木質(zhì)素（AL）這3種不同處理程度的樣品各50 mg進(jìn)行二維核磁共振實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)所得的譜圖比較分析。通過公式1計算，得到不同預(yù)處理方式提取的烤煙中部煙葉木質(zhì)素的相對含量，如圖8所示，全植物細(xì)胞壁（WCW）木質(zhì)素的相對含量為2.79，酸洗-酶解木質(zhì)素（AEL）為5.95，與全植物細(xì)胞壁（WCW）相比，其木質(zhì)素的相對含量稍有增加，但仍遠(yuǎn)小于21.83，得不到清晰可觀的二維譜圖，而堿提木質(zhì)素（AL）的相對含量為37.51，所有相關(guān)的特征峰結(jié)構(gòu)均可清晰展現(xiàn)。研究表明，使用堿溶法提取煙草木質(zhì)素的預(yù)處理方式，對煙草木質(zhì)素進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和半定量分析，可以獲得更加全面且豐富的定性定量信息。

圖8 不同預(yù)處理方式對烤煙中部煙葉木質(zhì)素相對體積積分的影響

通過堿溶法提取烤煙中部煙葉獲得了煙葉堿提木質(zhì)素的二維核磁共振譜圖，結(jié)合公式2、公式3計算木質(zhì)素基本單元結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素連接鍵的相對含量，結(jié)果如表4所示，烤煙中部煙葉木質(zhì)素是SGH型木質(zhì)素，且G型木質(zhì)素單元含量最高（54.25%），S型木質(zhì)素單元含量最低（17.96%），木質(zhì)素化學(xué)穩(wěn)定性重要指標(biāo)S/G值[31]為0.33。與其它植物相比（楊樹S/G值為1.5、玉米芯S/G值為1.0）[18,32]，煙葉木質(zhì)素的S/G值較低，這也與植物樣品中木質(zhì)素含量越低，其S型木質(zhì)素單元含量越少，S/G值越小的規(guī)律是一致的[31]。此外，烤煙煙葉H型木質(zhì)素單元含量比其它植物類型要高，這符合草本植物H型木質(zhì)素單元含量較高的規(guī)律，如玉米芯（15.1%）、柳枝稷（13.4%）[18,32]。烤煙中部煙葉木質(zhì)素的邊鏈區(qū)，β-芳基醚單元β-O-4（A）是最主要的單元間的連接鍵，占木質(zhì)素單元間連接鍵的91.36%，樹脂醇單元β-β（C）是次豐富的，占木質(zhì)素單元間連接鍵的5.65%。此外，烤煙中部煙葉木質(zhì)素還含有豐富的阿魏酸酯FA（25.82%）和少量的對羥基苯甲酸酯PB（0.5%）。

表4 不同煙草木質(zhì)素樣品基本單元及單元間連接鍵的相對含量及S/G的比值

Tab.4 Relative content of lignin subunits and linkages and S/G ratio in different tobacco lignin samples

注：a. A:β-O-4; b.B:β-5;c.C:β-β; d.D:5-5/β-O-4; e.S/G=0.5I(S2/6+S'2/6)/I(G2+G'2)[33];木質(zhì)素芳香區(qū)基本單元相對百分比（S+G+H=100%）;木質(zhì)素邊鏈區(qū)結(jié)構(gòu)單元相對百分比（A+B+C+D=100%）;FA,PB占S+G+H的百分比。

Note:a.A:β-O-4;b.B:β-5;c.C:β-β; d.D:5-5/β-O-4; e.S/G=0.5I(S2/6+S'2/6)/I(G2+G'2)[33]; Lignin-Aromatic molar percentages (S+G+H=100%);Lignin-Aliphatic molar percentages(A+B+C+D=100%); FA,PB as percentages of (S+G+H).

2.3 不同樣品中煙草木質(zhì)素的2D HSQC NMR分析

通過優(yōu)化溶劑和預(yù)處理手段，利用2D HSQC NMR方法對烤煙上中下部位煙葉、白肋煙葉、香料煙葉、梗絲和煙草薄片等實(shí)驗(yàn)樣品中的木質(zhì)素進(jìn)行二維核磁共振波譜表征，分析發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素代表性的基團(tuán)均在以上樣品中出現(xiàn)，主要木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元及單元間連接鍵的定量分析結(jié)果如表4所示，所有實(shí)驗(yàn)樣品均為SGH型木質(zhì)素，愈創(chuàng)木基（G）是最主要的基本單元，且在這些樣品中，β-芳基醚單元β-O-4（A）始終是最主要的木質(zhì)素間連接鍵，其次是樹脂醇單元β-β（C）?？緹煙熑~部位自上而下，S型木質(zhì)素單元含量不斷減少（26.51%～15.62%），G型和H型木質(zhì)素單元含量不斷增加（G:52.88%～55.58%；H:20.62%～28.81%），S/G比值不斷減少（0.50～0.28），且G型木質(zhì)素單元含量最高，這反映煙葉的生長發(fā)育過程中，G型木質(zhì)素單元最先沉積[34]。不同品種的煙葉木質(zhì)素單元之間的比例也不相同，中部烤煙、白肋煙和香料煙煙葉木質(zhì)素中，S型木質(zhì)素單元含量從低到高為烤煙<白肋煙<香料煙，G型木質(zhì)素單元含量從低到高為香料煙<烤煙<白肋煙，且香料煙S/G比值最高（0.4）。梗絲與煙草薄片跟煙葉相比，其G型木質(zhì)素單元含量偏高，均在70%左右，而H型木質(zhì)素單元含量偏低，約在5%左右。在熱解過程中β-芳基醚單元β-O-4（A）單元更容易斷裂，而縮合的樹脂醇單元β-β（C）不容易斷裂，即β-O-4（A）單元含量越低、β-β（C）單元含量越高，樣品的熱穩(wěn)定性越好[31]。梗絲和煙草薄片中β-O-4（A）單元在70%左右，顯著低于煙葉中的含量，β-β（C）單元含量則明顯增加到15%左右，揭示梗絲與煙草薄片樣品比煙葉樣品的熱穩(wěn)定性高。

通常，苯基香豆素單元β-5（B）只能通過木質(zhì)素單體與愈創(chuàng)木基（G）或?qū)αu基苯基（H）單元偶聯(lián)制得，PB通過酰化連接到γ位置，同時FA通過醚鍵與木質(zhì)素連接[16]。依據(jù)表4中木質(zhì)素樣品基本單元及單元間連接鍵的含量，參照文獻(xiàn)[21,25]的方法，構(gòu)建出煙葉木質(zhì)素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以烤煙中部煙葉為例，本研究首次描繪出煙葉木質(zhì)素大分子的結(jié)構(gòu)示意圖（圖9）。研究結(jié)果為研究煙草大分子結(jié)構(gòu)與熱解性能的關(guān)系提供堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。

圖9 烤煙中部煙葉木質(zhì)素結(jié)構(gòu)示意圖

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化溶劑與預(yù)處理手段，建立了一種煙草木質(zhì)素二維核磁共振波譜分析新方法，實(shí)現(xiàn)了煙草中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)表征和半定量分析，通過對二維譜圖中木質(zhì)素單元信號峰歸屬，結(jié)合木質(zhì)素單元及其連接鍵的相對含量，成功獲得了煙葉木質(zhì)素分子的結(jié)構(gòu)示意圖。將本方法應(yīng)用于煙葉、梗絲和煙草薄片等實(shí)驗(yàn)樣品的分析，結(jié)果表明：煙草木質(zhì)素為SGH型木質(zhì)素，β-芳基醚單元A（β-O-4）始終是最主要的木質(zhì)素間連接鍵，其次是樹脂醇單元C（β-β）。與其它植物樣品相比，煙葉中的紫丁香基（S）單元的含量較低，對羥基苯基（H）單元的含量較高，S/G值較小?？緹煙熑~部位自上而下，紫丁香基（S）單元的含量逐漸減少，愈創(chuàng)木基（G）和對羥基苯基（H）單元的含量逐漸增加。梗絲和煙草薄片與煙葉相比，愈創(chuàng)木基（G）單元的含量較高，對羥基苯基（H）單元的含量較低，同時β-芳基醚單元A（β-O-4）的含量較低，樹脂醇單元C（β-β）的含量較高，表現(xiàn)為較高的熱穩(wěn)定性。因此，本研究可為煙草制品吸食品質(zhì)與安全性和其內(nèi)在生物大分子的關(guān)系研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Structure characterization of tobacco lignin by Two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

GAO Miao1, CAI Jibao2, XU Zhenyu2, TIAN Dayu1, SU Jiakun2, ZHANG Yi2, YANG Jun1*

1 Tobacco and Health Research Center, University of Science and Technology of China, Hefei 230051, China;2 Technology Center, China Tobacco Jiangxi Industrial Co., LTD., Nanchang 330096, China

Lignin has an important effect on tobacco quality and safety. In order to improve the quality of tobacco products, it is necessary to study the chemical structure and content of tobacco lignin.In this study, tobacco lignin was characterized by two-dimensional heteronuclear single quantum coherence nuclear magnetic resonance(2D HSQC NMR), and the structure characterization and semi-quantitative analysis of tobacco lignin were studied.Test data show: 1) There were 10 kinds of lignin subunits and linkages and 27 signals of related structures were found in tobacco lignin; 2) Tobacco sample lignin is a SGH type lignin. Guaiacyl (G) is the most important lignin subunit, of which the content ranges from 50.72 to 73.50 percent; the content of syringyl (S) is between 15.62 and 26.51 percent, and the content of p-hydroxyphenyl (H) is between 5.66 and 28.90 percent. β-aryl ether units β-O-4 (A) are the most important lignin linkages, whose content ranges from 72.93 to 92.97 percent of the whole linkages of lignin, followed by resinol units β-β (C) in the range of 3.88-15.81 percent; 3) From the top to the bottom of flue-cured tobacco leaves, the content of syringyl (S) units gradually decreases, while the content of guaiacyl (G) and p-hydroxyphenyl (H) units gradually increases. Compared with tobacco leaves, the content of guaiacyl (G) units is higher in cut stem and tobacco sheet, but the content of p-hydroxyphenyl (H) units is lower. However , the content of β-aryl ether units β-O-4 (A) is lower, and the content of resinol units β-β (C) is higher.In this paper, qualitative and semi-quantitative analysis of lignin subunits and linkages of different tobacco samples were realized by using 2D HSQC NMR method, and the model of tobacco lignin molecular structure was proposed. These results provide a theoretical and technical basis for the study of tobacco lignin macromolecules.

2D NMR; HSQC; tobacco; lignin; structural characterization; quantitative analysis

. Email：yjun8202@ustc.edu.cn

高淼，蔡繼寶，徐振宇，等. 煙草木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的二維核磁共振波譜表征[J]. 中國煙草學(xué)報，2022，28（2）.GAO Miao, CAI Jibao, XU Zhenyu, et al. Structure characterization of tobacco lignin by Two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(2).doi:10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0169

江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目“煙草木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的二維核磁共振波譜研究與應(yīng)用”（2020360000340303）

高淼（1998—），碩士研究生，主要從事煙草大分子結(jié)構(gòu)分析研究，Tel：0551-63492060，Email：gaomiao@mail.ustc.edu.cn

楊?。?967—），博士，副教授，主要從事煙草化學(xué)研究，Tel：0551-63492065，Email：yjun8202@ustc.edu.cn

2021-09-24；

2022-03-07