張莉，孫佳寧，朱明睿，邢世均，劉廣娟，肖志遠(yuǎn)，姜美齡，王子榮

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000）

哈薩克羊?qū)佟叭庵嬗谩毙?，在新疆存欄?shù)量占比最大[1]。該品種羊常年放牧，適應(yīng)能力較強(qiáng)，具有四肢健壯，肌肉發(fā)達(dá)的特點(diǎn)。但由于其生產(chǎn)周期長，導(dǎo)致肉硬度大，口感較差[2]，消費(fèi)者的接受度低。肉品嫩度不僅與自身品種有關(guān)，還與宰后成熟程度有關(guān)。動物經(jīng)屠宰死亡后，生命活動也隨之停止，糖酵解過程進(jìn)入無氧呼吸階段，肌肉開始僵直，此時肉的硬度大、保水性差、加工性能低。隨著成熟時間的延長，胴體在解僵的作用下硬度降低，嫩度增加，系水力和風(fēng)味均有所增加，從肌肉轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒秤萌?。研究表明，宰后充分成熟對肉的色澤、嫩度及保水性等有明顯改善[3,4]，通過延長成熟期可以提高肉的食用品質(zhì)[5]。因此了解原料肉在僵直-成熟過程中的品質(zhì)變化，對肉制品加工企業(yè)有重要意義。

超聲波是指頻率在20~100 kHz、強(qiáng)度>1 W/cm2的物理加工技術(shù)，具有效率高、操作簡單、污染小及安全性高的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在肉制品加工[6]。超聲波產(chǎn)生的空化、機(jī)械及熱效應(yīng)不僅可以改變?nèi)庵破返牡鞍捉Y(jié)構(gòu)[7,8]，還可以破壞肌肉細(xì)胞的完整性、促進(jìn)酶促反應(yīng)作用于肉類組織。該技術(shù)能夠有效改善肉品嫩度，縮短肉品所需成熟時間，減少資源浪費(fèi)。李蘭會等[9]發(fā)現(xiàn)超聲波水浴處理，能明顯提高山羊肉塊的嫩度，使山羊肉提前3 d成熟。朱琪等[10]利用超聲波處理羊背最長肌，發(fā)現(xiàn)超聲波處理降低了歐拉藏羊肉的剪切力值、硬度值，提高了歐拉藏羊肉的蛋白溶解性、MFI，認(rèn)為超聲處理能夠較大程度改善肌肉品質(zhì)。

目前超聲波對羊肉嫩度影響效果研究較少，因此本研究以哈薩克羊半膜肌為試驗對象，分別超聲處理0、20、40 min后置于4 ℃冰箱進(jìn)行冷藏成熟，以pH值、ATP含量、色差、蒸煮損失、剪切力、MFI及MP溶解度、濁度等指標(biāo)為評判標(biāo)準(zhǔn)，研究超聲對羊肉嫩度及品質(zhì)的影響，為預(yù)測和控制宰后肌肉嫩化的速度和程度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

哈薩克羊（14月齡），新疆烏魯木齊市米東區(qū)新華凌市場；KH2PO4，分析純，云誠化工有限公司；K2HPO4，分析純，廊坊天科生物科技有限公司；KCl，分析純，山東凱米科化工股份有限公司；牛血清白蛋白，北京索萊寶科技有限公司；ATP含量測定試劑盒、總蛋白定量測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

KQ250DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HR40-IIA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州天瑞儀器有限公司；SF-GL-16A高速冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理

哈薩克羊（6只未去勢的14月齡公羊、質(zhì)量約50 kg），宰前24 h禁食禁水，屠宰放血30 min內(nèi)取出半膜肌，剔除肌肉表面脂肪、筋膜及結(jié)締組織，裝入標(biāo)記好的自封袋，置于冰盒內(nèi)（0~4 ℃）2 h內(nèi)運(yùn)回實驗室。

1.2.2 試驗設(shè)計

將半膜肌沿肌纖維方向分割成200±5 g的肉塊，分別置于標(biāo)記好的真空包裝袋內(nèi)，浸于超聲波清洗器內(nèi)，設(shè)置超聲頻率：40 kHz，功率：100 W，超聲時間：20 min、40 min，溫度：20 ℃左右，對照組采用直接冷藏處理。所有處理組均設(shè)置3個平行，于4 ℃冰箱冷藏0、2、12、24、72、120、168 h后測定相關(guān)指標(biāo)[10]。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 pH值

參照郭守立等[11]的方法，將TESTO 205便攜式pH計的探頭插入肉樣2 cm左右，測定其pH值，待讀數(shù)穩(wěn)定，記錄結(jié)果并取平均值，每個樣品隨機(jī)取6個點(diǎn)進(jìn)行測試。

1.3.2 ATP含量

參照李桂霞等[12]的方法，采用ATP含量測試盒測定。利用天平準(zhǔn)確稱取1.0 g肉樣，加入9 mL煮沸的雙蒸水，調(diào)整高速勻漿機(jī)轉(zhuǎn)速為11000 r/min，冰浴條件下勻漿3次，每次30 s（中間間隔60 s），制成10%的勻漿液，置于10 mL離心管內(nèi)，并在沸水中煮10 min，取出后混勻抽提1 min，設(shè)置離心機(jī)參數(shù)，轉(zhuǎn)速：3500 r/min、時間：10 min，取上清液待用。用雙蒸水將上清液濃度調(diào)整為0.5%，總蛋白定量測定試劑盒測定蛋白濃度，以每克蛋白含有ATP的物質(zhì)的量作為ATP含量單位。

1.3.3 色差

參照郭守立等[11]的方法，將肉樣取出后用吸水紙擦干其表面的水分并置于試驗臺表面，同時對色差儀進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)完畢測定樣品的亮度值（L*值）、紅綠值（a*值）及藍(lán)黃值（b*值），每個樣品隨機(jī)選取6個點(diǎn)進(jìn)行測定，結(jié)果取平均值。

1.3.4 蒸煮損失

參考Gambuteanu等[13]的方法，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。沿肌肉纖維方向，將肉樣切成5 cm×3 cm×2 cm肉條，用吸水紙將其表面水分擦干稱重，記為m1并置于蒸煮袋內(nèi)，將蒸煮袋置于85 ℃水浴鍋中加熱，當(dāng)肉樣中心溫度為70±1 ℃，立即取出，并將樣品流出汁液進(jìn)行擦拭，冷卻至室溫后對肉條稱重，記為m2，稱重后的肉樣用于剪切力測定，蒸煮損失按照下列公式進(jìn)行計算。

1.3.5 剪切力

參照李桂霞等[12]的方法。沿肌纖維方向用取樣器取直徑為1 cm的肉柱，利用肌肉嫩度儀下測定剪切力。1.3.6 MFI

參考Culler等[14]的方法，利用天平準(zhǔn)確稱取1.0 g肉樣，切碎后加入10 mL預(yù)冷的MFI緩沖液（100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L KH2PO4、8.8 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3），按照1.3.2的方法制備組織勻漿液，再將勻漿液置于高速冷凍離心機(jī)中，設(shè)置參數(shù)為轉(zhuǎn)速：2500 r/min、溫度：4 ℃、時間：20 min，去除上清液，此過程重復(fù)兩次，得到MP沉淀。再加入5.0 mL預(yù)冷的MFI緩沖液將沉淀充分懸浮，用200目篩網(wǎng)過濾懸浮液去除結(jié)締組織，利用雙縮脲法測定濾液的蛋白濃度，最后用MFI緩沖液將蛋白濃度調(diào)整為0.50±0.05 mg/mL，540 nm波長處測定紫外吸光度A，結(jié)果乘200得到MFI。

1.3.7 MP溶解度、濁度

1.3.7.1 MP提取

參考Park等[15]的方法，利用天平準(zhǔn)確稱取1.0 g肉樣，加入10 mL預(yù)冷的920 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA pH 6.8），按照1.3.2的方法制備組織勻漿液，將勻漿液置于高速冷凍離心機(jī)中，設(shè)置參數(shù)轉(zhuǎn)速：2500 r/min、溫度：4 ℃、時間：20 min，棄上清液，此過程重復(fù)兩次，得到MP沉淀，將沉淀與4 mL 0.1 mol/L氯化鈉溶液充分懸浮，將懸浮液置于高速冷凍離心機(jī)內(nèi)，設(shè)置參數(shù)轉(zhuǎn)速：2500 r/min、溫度：4 ℃、時間：20 min，棄上清液，此過程重復(fù)兩次，得到純化MP沉淀。

1.3.7.2 MP溶解度

參照Zhang等[16]的方法，并稍做優(yōu)化。向MP沉淀內(nèi)加入1.3.7.1中的磷酸緩沖液使?jié)舛日{(diào)整為2.0 mg/mL，取5 mL加入10 mL離心管內(nèi)，設(shè)置高速冷凍離心機(jī)參數(shù)轉(zhuǎn)速：10000 r/min、溫度：4 ℃、時間：20 min，雙縮脲法測定上清液蛋白質(zhì)濃度。

1.3.7.3 MP濁度

參照Li等[17]的方法，向MP沉淀中加入1.3.7.1中的磷酸緩沖液使調(diào)整濃度為1.0 mg/mL，在660 nm處測定紫外吸光值，磷酸鹽緩沖液做空白對照，每個樣品測定3次，結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016整理、作圖，運(yùn)用SPSS 19.0軟件（SPSS公司）（Duncan法）分析數(shù)據(jù)差異性，結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲處理對羊半膜肌pH值的影響

pH值反映肌肉乳酸、無機(jī)磷酸的沉積量，間接反映糖酵解程度。超聲處理羊半膜肌的pH值變化情況如圖1所示。隨成熟時間的延長，肌肉pH值呈先下降后緩慢上升趨勢。超聲處理組的pH值較直接冷藏組下降速度緩慢，且提前到達(dá)最低點(diǎn)，12 h后大于直接冷藏組（p<0.05）；超聲處理組在72 h后pH值變化不顯著（p>0.05），直接冷藏組在120 h后到達(dá)最小值（5.39）后小幅度上升。

機(jī)體宰后呼吸停止，糖酵解進(jìn)入無氧呼吸階段，糖原分解產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致機(jī)體pH值下降[18]，而后緩慢上升可能是微生物的繁殖作用或蛋白質(zhì)發(fā)生降解產(chǎn)生含氮化合物[19]。研究表明該技術(shù)可以延緩肉品pH值降低，高pH值肉的鈣蛋白酶活性高、蛋白降解速度快且嫩度高[20]。Got等[21]用超聲波（2.6 MHz，10 W/cm2）處理牛的半膜肌發(fā)現(xiàn)，初始pH值高的肉，嫩度較高；Jayasooriya等[22]用超聲波（24 kHz，12 W/cm2）處理發(fā)現(xiàn)其pH值降低緩慢，剪切力顯著降低，與本研究結(jié)果一致。可能是由超聲產(chǎn)生的空穴效應(yīng)引起，空穴效應(yīng)能使蛋白水解酶、脫氨基酶釋放，提高堿性胺類的利用率[23,24]，而酸性蛋白基團(tuán)的數(shù)量降低[25]，另外超聲能夠促進(jìn)某些離子從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致某些離子基團(tuán)位置發(fā)生改變[26]，最終導(dǎo)致pH值升高。

2.2 超聲處理對羊半膜肌ATP含量的影響

ATP是直接供給肌肉代謝的能源物質(zhì)。不同處理下肌肉的ATP含量變化情況如圖2所示。隨著成熟時間的延長，各處理間均呈先上升后下降趨勢，超聲處理組顯著低于直接冷藏組（p<0.05）。半膜肌超聲20 min、超聲40 min組分別在12、2 h后開始下降，72 h后下降不明顯，說明成熟完全，直接冷藏組在24 h后始終處于下降趨勢。上述結(jié)果表明，超聲處理可以使肌肉提前進(jìn)入僵直期，并加快成熟進(jìn)程。

宰后羊呼吸停止，但機(jī)體的功能活動仍在繼續(xù)，為維持能量平衡，骨骼肌內(nèi)的酶在無氧條件下進(jìn)行糖代謝合成ATP，產(chǎn)生乳酸[27]，隨著肌肉內(nèi)ATP的消耗殆盡，引發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)的鈣泵功能奔潰，鈣離子被釋放但不能回收，隨著肌漿鈣離子濃度的增大，肌肉嫩度降低，進(jìn)入僵直狀態(tài)；另外ATP含量降低促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶[Adenoisune5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]活化，它的活化會增加機(jī)體對葡萄糖的攝取，抑制糖原合成代謝，加快糖酵解進(jìn)程，引起pH值發(fā)生變化，最終影響肌肉成熟速度[28-30]，此外，Nakashima等[31]表明AMPK的激活刺激了骨骼肌中MP的降解，也對肉品嫩度有積極作用。本試驗發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠較大程度降低肌肉內(nèi)ATP含量，進(jìn)一步驗證了超聲處理可以降低肌肉硬度，提升肉品嫩度。

2.3 超聲處理對羊半膜肌色差的影響

肉的色澤直接影響消費(fèi)者的購買欲望，它是人們判斷肉品新鮮度的重要指標(biāo)[32]。超聲處理后羊半膜肌的色差變化情況如表1所示。隨著成熟時間的延長，超聲處理后肌肉L*值均顯著高于直接冷藏組（p<0.05），而a*值低于同期直接冷藏組（p<0.05）。超聲處理產(chǎn)生空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，空化泡破裂產(chǎn)生局部的瞬時高溫、高壓[33]，使肌纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞，自由水含量上升，L*值升高，肉色更加鮮亮；但超聲處理降低了羊肉的a*值，分析認(rèn)為是氧合肌紅蛋白（MbO2）被氧化生成褐色的高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin，MetMb），且肌紅蛋白變性，使其a*值降低[34]；b*值變化趨勢不顯著（p>0.05），這與陳麗艷等[35]研究結(jié)果一致，可能與超聲功率和超聲時間有關(guān)。

表1 不同超聲時間對羊半膜肌亮度值（L*）、紅綠值（a*）、黃藍(lán)值（b*）的影響Table 1 The influence of different ultrasound time on the brightness value (L*), red-green value (a*), blue-yellow value (b*) of the semimembranosus in sheep

2.4 超聲處理對羊半膜肌蒸煮損失的影響

蒸煮損失反映肉的保水性，超聲處理后羊半膜肌的蒸煮損失變化情況如圖3所示。不同處理下半膜肌的蒸煮損失變化趨勢相同，0~24 h逐漸上升至最大值，此時超聲40 min（35.67%）>直接冷藏（34.74%）>超聲20 min（33.83%）；24~168 h超聲處理組顯著低于直接冷藏組（p<0.05），第168 h時，超聲20 min與超聲40 min分別降低了3.28%、2.78%，說明超聲處理能夠在一定程度上提高肉的保水性。

超聲強(qiáng)度、時間能夠直接影響肉品持水性。Zou等[36]發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲強(qiáng)度高于93.33 W/cm2時，經(jīng)腌制后的牛肉蒸煮損失逐漸增加；Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲強(qiáng)度低于150 W/cm2時，MP凝膠結(jié)構(gòu)均勻致密且保水性較高，但高于150 W/cm2時，凝膠內(nèi)部出現(xiàn)孔洞，且隨著超聲強(qiáng)度加大，保水性顯著降低。Li等[37]研究不同超聲時間（10、20、30、40 min）對雞胸肉蛋白功能特性的影響，表明10 min或20 min均能提高其持水能力，改善肌肉質(zhì)構(gòu)，但40 min時，產(chǎn)品持水能力顯著降低，失水率增加。

2.5 超聲處理對羊半膜肌剪切力的影響

剪切力是評價肉嫩度的重要指標(biāo)，剪切力越大，嫩度越差[38]。超聲處理后肌肉的剪切力變化情況如圖4所示。隨著成熟時間的延長，肌肉各處理組均呈下降趨勢，超聲處理組顯著低于直接冷藏組（p<0.05），12~24 h時，各處理組緩慢上升，表明肌肉進(jìn)入僵直前期。超聲處理組在24~168 h顯著下降至最小值（超聲20 min為37.54 N，超聲40 min為41.37 N）（p<0.05），而直接冷藏組緩慢下降至最小值（50.42 N）。上述結(jié)果表明超聲處理使得肌肉提前進(jìn)入僵直期，并且對肉的嫩化起積極作用。

嫩度的大小是各種生物化學(xué)物質(zhì)相互作用的結(jié)果，受肌肉纖維收縮、膠原蛋白、結(jié)締組織含量及pH值的影響[39,40]。超聲產(chǎn)生熱效應(yīng)、空化效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)能破壞肌肉結(jié)締組織、MP和溶酶體等，使鈣蛋白酶、組織蛋白酶及Ca2+等固體物質(zhì)提前釋放并進(jìn)入細(xì)胞間隙，肌肉提前僵直；隨著成熟時間的延長，肌纖維拉伸，肌節(jié)長度增加，實現(xiàn)肌肉嫩化[41,42]。

2.6 超聲處理對羊半膜肌MFI的影響

MFI用于預(yù)測宰后肌肉的嫩度大小，MFI值越大，MP降解程度越大，嫩度越高[43,44]。超聲處理后肌肉的MFI變化情況如圖5所示。隨著成熟時間的延長，半膜肌不同處理間差異顯著，超聲處理組均顯著大于直接冷藏組（p<0.05），超聲處理組在2~24 h緩慢下降，進(jìn)入僵直期，在24 h時達(dá)到最小值（超聲20 min為32.20，超聲40 min為37.60）后呈上升趨勢；直接冷藏組在2~72 h始終呈下降趨勢，72 h時達(dá)到最小值（25.92）后呈上升趨勢。Wang等[45]發(fā)現(xiàn)，超聲處理（20 kHz、25 W/cm2）提高了肉品的MFI，增加了嫩度。Yeung等[46]利用超聲處理豬腰肉發(fā)現(xiàn)，超聲后的MFI顯著提高，嫩度得到很大程度的改善，與本研究結(jié)果一致。

2.7 超聲處理對羊半膜肌MP溶解度的影響

蛋白溶解度是溶液中的蛋白質(zhì)量占肌肉總蛋白質(zhì)量的比，它反映蛋白質(zhì)與水之間的平衡與相互作用，與肌肉的持水性相關(guān)[47]。超聲處理后肌肉的MP溶解度變化情況如圖6所示。肌肉的溶解度隨著成熟時間的延長呈波動上升趨勢，超聲處理組均顯著大于直接冷藏組（p<0.05）。超聲處理組及直接冷藏組分別在24 h、72 h達(dá)到最小值（超聲20 min為11.90%、超聲40 min為17.71%，直接冷藏為5.20%）后逐漸上升。這與Hasnain等[48]研究結(jié)果一致。超聲波空化效應(yīng)產(chǎn)生局部高溫高壓，導(dǎo)致蛋白小聚體破碎、分子結(jié)構(gòu)變得疏松，疏水性氨基酸釋放，使更多的親水基團(tuán)暴露到蛋白質(zhì)的表面，增加蛋白質(zhì)與水的相互作用[49]，導(dǎo)致MP溶解度的增加。

2.8 超聲處理對羊半膜肌MP濁度的影響

濁度用于評估MP分散體的聚集水平[50]，濁度越高，說明蛋白質(zhì)聚集程度越高，溶液中懸浮顆粒粒徑越大，反之亦然。超聲處理后肌肉的濁度變化如圖7所示。隨著成熟時間的延長，各處理組均呈波動下降趨勢，且超聲處理組始終低于直接冷藏組（p<0.05）。超聲處理組及直接冷藏組分別在12、2 h后開始上升，在24、72 h后開始下降；超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)使氫鍵斷裂，疏水相互作用遭到破壞，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白聚集體破碎、可溶性蛋白結(jié)構(gòu)遭到破壞，減小了蛋白質(zhì)的粒徑，降低了樣品的濁度，與溶解度結(jié)果對應(yīng)。

3 結(jié)論

動物宰后呼吸停止、供氧中斷，為維持穩(wěn)態(tài)，機(jī)體進(jìn)入無氧酵解，該過程產(chǎn)生能量物質(zhì)，但隨著糖原的消耗殆盡，ATP含量降低，并積累了大量乳酸，導(dǎo)致肌肉的pH值迅速下降，肌肉進(jìn)入僵直階段，此時肌肉嫩度較差；隨著肌肉解僵，肌肉剪切力下降，促進(jìn)MP聚合和降解程度高，MP溶解度增加。本試驗中超聲處理能夠顯著提高肌肉的pH值、L*值、MFI及MP溶解度，降低肌肉ATP含量蒸煮損失及剪切力，進(jìn)而改善肉品保水性與嫩度，縮短肌肉成熟所需時間。與超聲20 min相比，超聲40 min的蒸煮損失較大，且能耗較大，因此認(rèn)為超聲時間控制在20 min左右較好。