李欣燃 朱 淼 楊友聯(lián) 廖 雯 張曉勇 李樹(shù)江 翁貴英 王緒英

（六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤(pán)水 553001）

丁香假單胞菌獼猴桃變種 （Pseudomonas syringae var. kiwifruit）作為獼猴桃主要病原菌之一[1]，極易引發(fā)嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失[2]。如何有效地對(duì)該病原菌進(jìn)行綠色防控，對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展極為重要。

研究表明， 核桃青皮[3-7]和蕺菜（Houttuynia cordata Thunb， 又名魚(yú)腥草）[8-10]對(duì)多種病原微生物具有不同程度的抑菌效果， 而狹萼鬼吹簫（Leycesteria formosa Wall. var. stenosepala Rehd）作為忍冬科（Caprifoliaceae）鬼吹簫屬（Leycesteria）植物變種[11]，尚未見(jiàn)其抗菌作用的相關(guān)報(bào)道。 本研究首次檢測(cè)以上三種植物的不同濃度乙醇提取物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種的抑菌效果， 以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的植源抗菌劑以及為獼猴桃潰瘍病的防治提供參考依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

酵母提取物（紅潤(rùn)寶順）；胰化蛋白胨（源葉生物）；氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NaOH（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（天津富宇）；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

核桃采于貴州省畢節(jié)市大方縣， 經(jīng)過(guò)脫皮處理后獲得外層核桃青皮； 蕺菜采自貴州省六盤(pán)水市鐘山區(qū)，取地下莖部分；狹萼鬼吹簫采自貴州省水城區(qū)保華鎮(zhèn)，取全草待用，以上三種植物海拔均在1 400~1 900m 之間。

丁香假單胞菌獼猴桃變種保存于六盤(pán)水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，菌種活化及后續(xù)培養(yǎng)溫度為37℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （北京東西分析儀器有限公司，UV-2100 型）；全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本三洋（SANYO），MLS-3750）；恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司，HH-2 型）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，SB-800DT 型）；烘箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，BGZ 系列II 型）；自動(dòng)脫帽離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司，TD5 脫帽型）；電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，JA4103）；恒溫培養(yǎng)箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHP-9270B）； 全溫振蕩培養(yǎng)箱（常州普天儀器制造有限公司，HZQ-F400）； 無(wú)菌操作臺(tái) （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2FD）；電子分析天平（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，ATY124 型）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 材料處理

將當(dāng)年采摘的新鮮核桃外側(cè)青色果皮 （即核桃青皮）、蕺菜地下莖、狹萼鬼吹簫全草放置于空曠陰涼處風(fēng)干，并于40℃烘箱內(nèi)恒溫烘干至恒重，用粉碎機(jī)將其粉碎成粉末狀， 過(guò)40 目篩收集后，密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 提取物浸膏獲取

分別準(zhǔn)確稱取三種處理后的材料5 g 各6 份置于250 mL 錐形瓶?jī)?nèi)， 依次加入蒸餾水、20%乙醇溶液、40%乙醇溶液、60%乙醇溶液、80%乙醇溶液和無(wú)水乙醇， 輕輕搖動(dòng)錐形瓶混勻后， 放置在800 W 功率條件下超聲 50 min，5 000 rpm/min 離心3 min 取上清，40℃恒溫水浴蒸干形成浸膏并稱重。 所得浸膏用5mL 二甲基亞砜進(jìn)行溶解后于4℃保存[12]。

2.3 得率計(jì)算

水溶液和不同濃度乙醇溶液提取物的得率用下列公式計(jì)算[13]：

其中，M 為含有浸膏的燒杯質(zhì)量 （g），m 為燒杯質(zhì)量（g），5 為所取材料 5 g。

2.4 抑菌效果檢測(cè)

將丁香假單胞菌獼猴桃變種在37℃條件下進(jìn)行活化， 在無(wú)菌超凈臺(tái)中用Luria-Bertani 培養(yǎng)基（LB）培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，并以液體LB 培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm 處測(cè)量菌液光密度值至菌液吸光度為0.5 為止。取稀釋后的菌液60 ul 加入到無(wú)菌平板內(nèi)用涂布棒涂抹均勻， 使用玻璃棒在鋪好菌液的平板中打出規(guī)則圓孔后，加入40 ul 植物提取液[14]。 用封口膜將平板封好， 放置37℃恒溫培養(yǎng)16 h 后取出后觀察，并采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小[15]。

3 結(jié)果及分析

3.1 三種植物乙醇提取物得率

三種植物的浸膏提取質(zhì)量及得率詳見(jiàn)表2。 從表2 可知，核桃青皮用80%乙醇為提取劑時(shí)浸膏得率最高，蕺菜用40%乙醇為提取劑時(shí)浸膏得率最高，狹萼鬼吹簫用80%乙醇為提取劑時(shí)浸膏得率最高。

表2 三種植物的浸膏的質(zhì)量（g）及得率（%）Table 2 Quality (g) and yield (%) of extracts of three plants

3.2 三種植物提取物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種的抑制作用

采用打孔法分析三種植物的水提物和不同濃度乙醇提取物對(duì)該病原菌的抑制，結(jié)果詳見(jiàn)圖1（a-c）。

上述數(shù)據(jù)提示DAAs治療CHC療效確切，對(duì)于DAAs治療失敗患者可使用SOF/VEL/VOX進(jìn)行挽救治療，然而基因3型、肝硬化程度重及存在NS5A RAS再治療的應(yīng)答率相對(duì)較低。

圖1 三種植物提取物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種的抑制作用圖1 Figure 1 Inhibitory effects of three plant extracts on P.syringae var.kiwifruit.

核桃青皮提取物抑菌圈直徑詳見(jiàn)表3。 由表3 可知，在各稀釋倍數(shù)乙醇提取物原液中，其抑菌圈均超過(guò)20 mm，說(shuō)明核桃青皮對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種具有較強(qiáng)的抑制作用，其中60%乙醇提物具有最大的抑菌圈，其直徑為32.3 mm；無(wú)水乙醇提取物的抑菌圈直徑最小， 為22.6 mm。 同時(shí)，隨著提取液稀釋倍數(shù)的增加，抑菌圈的直徑逐漸減小，而各濃度中，60%乙醇提物均具有最大的抑菌圈直徑，充分說(shuō)明了此濃度乙醇的提取物中含有對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種抑制性較強(qiáng)的化合物，可進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分離純化。

表3 核桃青皮提取物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種抑菌圈直徑（mm）Table 3 Diameter of bacteriostatic circle of walnut green husk extract against P.syringae var.kiwifruit(mm)

蕺菜提取物抑菌圈直徑詳見(jiàn)表4。 由表4 可見(jiàn)，在各稀釋倍數(shù)溶劑提取物原液中，80%乙醇提取物原液具有最大抑菌圈，直徑為20.5 mm，而水提物的抑菌圈直徑最小為12.4 mm。 結(jié)果表明蕺菜80%醇提物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種的抑制作用最強(qiáng)，其水提物的抑制性最弱。 當(dāng)提取物原液8 倍稀釋后，低濃度的醇提物和水提物抑菌作用消失。

表4 蕺菜提取物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種抑菌圈直徑（mm）Table 4 Diameter of bacteriostatic circle of Houttuynia cordata Thunb.extract against P.syringae var.kiwifruit(mm)

狹萼鬼吹簫提取物抑菌圈直徑詳見(jiàn)表5，各稀釋倍數(shù)溶劑提取物原液對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種都有抑菌作用，其60%醇提物和40%醇提物抑菌圈直徑最大， 分別為21.3mm 和21.4mm，當(dāng)提取物原液8 倍稀釋后，低濃度的醇提物和水提物抑菌作用消失。

表5 狹萼鬼吹簫提取物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種抑菌圈直徑（mm）Table 4 Diameter of bacteriostatic circle of Leycesteria formosa var.stenosepala Rehd.extract against P.syringae var.kiwifruit(mm)

4 討論與結(jié)論

丁香假單胞菌獼猴桃變種是獼猴桃潰瘍病的主要病原菌之一，已給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，目前農(nóng)業(yè)上主要應(yīng)用化學(xué)制劑進(jìn)行殺菌處理， 長(zhǎng)期采用該處理方式容易導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，同時(shí)對(duì)獼猴桃的產(chǎn)量和品質(zhì)造成損害，不利于該產(chǎn)業(yè)的長(zhǎng)期健康發(fā)展[16-17]，開(kāi)發(fā)一種綠色安全有效的生物制劑控制該病原菌將為獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。

植物體內(nèi)含有豐富的生物活性物質(zhì)[18-19]，其成分較復(fù)雜，常用的天然植物有效成分提取試劑有乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等，各成分間極性存在一定差異， 采用不同溶劑進(jìn)行提取時(shí)，其提取物的種類和含量會(huì)有所不同，且不同提取物之間生物活性也會(huì)存在一定差異[20-21]。 由于試驗(yàn)的最終目的是應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品綠色防控方面，故僅采用無(wú)毒無(wú)殘留乙醇作為提取試劑考察三種植物的抑菌效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用80%乙醇提取核桃青皮時(shí)，其浸膏得率最高，為24.04%；采用40%乙醇提取蕺菜時(shí)，其浸膏得率最高，為25.08%；采用80%乙醇提取狹萼鬼吹簫時(shí)，其浸膏得率最高，為12.96%。 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，60%核桃青皮、80%蕺菜、40%或60%狹萼鬼吹簫乙醇提取液具有最佳的抑菌效果。 可見(jiàn)，抑菌效果與浸膏得率間相關(guān)性較小，而與植物不同極性中所含有的化合物相關(guān)。

此外，大量研究已發(fā)現(xiàn)核桃青皮和蕺菜對(duì)多種病原菌具有抑制作用[22-23]，通過(guò)查閱中外文獻(xiàn)和書(shū)籍，筆者未發(fā)現(xiàn)關(guān)于狹萼鬼吹簫抑菌效果方面的報(bào)道，本研究首次發(fā)現(xiàn)該植物對(duì)丁香假單胞菌獼猴桃變種具有一定的抑制作用，且值得注意的是狹萼鬼吹簫乙醇提取物的最佳抑菌效果優(yōu)于蕺菜，未來(lái)可對(duì)該植物具體抑菌成分進(jìn)一步深入研究。本試驗(yàn)補(bǔ)充了狹萼鬼吹簫在抑菌效果方面的相關(guān)研究，為其在該領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

結(jié)論：三種植物浸提物對(duì)獼猴桃變種抑菌效果為：核桃青皮提取物＞狹萼鬼吹簫提取物＞蕺菜提取物。 核桃青皮乙醇提取物的抑菌效果優(yōu)于其他兩種植物，可作為丁香假單胞菌獼猴桃變種最佳的植源抗菌劑候選材料之一。