陳旭晉 陸宇陽(yáng) 曹佳 周鋒杰 沈林林

(蘇州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心，江蘇 蘇州 215000)

大閘蟹學(xué)名中華絨螯蟹，是河蟹的一種。其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受人們的喜愛(ài)。大閘蟹之所以口味鮮美，是因?yàn)槠浜衔?游離氨基酸、核苷酸)和非含氮化合物(有機(jī)酸、糖類)，其中，核苷酸對(duì)其滋味有著重要作用[1]。部分核苷酸如5′-腺嘌呤核苷酸(AMP)、5′-肌苷酸(IMP)、鳥苷酸(GMP)等有明顯的鮮味特點(diǎn)。三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)作為能量物質(zhì)在機(jī)體死亡之后，會(huì)降解成呈味核苷酸，提高鮮味[2]。

目前核苷酸的檢測(cè)方法主要有近紅外快速檢測(cè)[3]、紫外分光光度計(jì)[4]、高效液相色譜法等[5,6]。近紅外快速檢測(cè)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法不同，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性幾乎完全依賴于一個(gè)成熟的數(shù)據(jù)庫(kù)。紫外分光光度計(jì)適合純度較高，干擾較少的樣品，不適用于基質(zhì)復(fù)雜的組分。目前最常用的方法是高效液相色譜法。液相色譜法分析速度快，操作也簡(jiǎn)單，但是在分析部分結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)相近的物質(zhì)時(shí)，色譜峰較難分離。液質(zhì)聯(lián)用法相比液相色譜法，即使化合物沒(méi)有在色譜柱上完全分開，但通過(guò)特征離子質(zhì)量色譜圖也可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量。因此，本文擬采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)大閘蟹中5種核苷酸進(jìn)行分離測(cè)定，并驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

乙腈(HPLC，Honeywell)，亞甲基二磷酸(AR，TCI)；高氯酸，氫氧化鈉(GR，國(guó)藥集團(tuán))；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(美國(guó)Millipore)。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

ATP、ADP、AMP、IMP、GMP(LGC，純度≥99%)。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 5500串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)AB SCIEX)；H_Class超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters)。

1.3 樣品制備

將鮮活大閘蟹樣品分解為若干大塊，放入粉碎機(jī)制成勻漿。取勻漿放入冷凍干燥機(jī)中凍干，將凍干后的樣品研磨成粉狀，過(guò)10目篩得到待測(cè)樣品。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取ATP、ADP、AMP、IMP、GMP標(biāo)準(zhǔn)品各約10mg，于100mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，得濃度為100μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。使用時(shí)稀釋為5ng·mL-1、10ng·mL-1、50ng·mL-1、100ng·mL-1、200ng·mL-1、500ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.5 前處理方法

稱取供試試料0.1g于50mL離心管中，加入0.6mol·L-1高氯酸溶液3.0mL提取，渦旋混勻1min，振蕩5min，4℃，10000rpm·min-1離心10min。重復(fù)上述步驟。合并2次上清液，將pH調(diào)整為6.7～7.0，取去離子水定容至50mL。過(guò)0.22μm濾膜后上機(jī)。

1.6 儀器條件

1.6.1 液相條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm，1.8μm)。柱溫：40℃。流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為10mM乙酸銨(含5μM亞甲基二磷酸)。梯度洗脫：0min，1%A，99%B；3.5min，1%A，99%B；4min，10%A，90%B；8min，10%A，90%B；8.5min，1%A，99%B；10min，1%A，99%B。流速：0.2mL·min-1。

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI；實(shí)驗(yàn)方式：MRM；掃描方式：ATP、ADP為負(fù)離子掃描，AMP、IMP、GMP為正離子掃描；離子化電壓：5500V，-4500V；溫度：550℃；輔助加熱氣：55psi；氣簾氣：55psi。詳細(xì)參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱及流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)中高效液相色譜法測(cè)定呈味核苷酸都用C18柱[7,8]。但部分核苷酸極性較大，在普通的C18柱上不易保留。需要使用高濃度、高比例的磷酸鹽溶液，才能有效分離及保留目標(biāo)物，對(duì)色譜柱有較大損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了Waters ACQUITY UPLC BEHAmide和Waters ACQUITY UPLC HSS T3。Amide柱是正向色譜柱。在正離子掃描模式下AMP、GMP色譜峰均有一定程度拖尾，IMP分離效果不佳。負(fù)離子掃描的ATP及ADP峰形很差。T3柱采用雙鍵鍵合C18技術(shù)，采用三官能團(tuán)C18烷基鍵合相，鍵合密度高，對(duì)極性化合物具有更好保留，并且能做到和100%水相兼容。5種核苷酸在T3柱上可以很好的保留及分離。

表1 5種核苷酸MRM離子對(duì)信息

在乙腈-0.1%甲酸水的體系下，AMP、GMP、IMP峰形及相應(yīng)良好，負(fù)離子模式下的ADP及ATP沒(méi)有響應(yīng)。在乙腈-10mmoL·L-1乙酸銨體系下，5種核苷酸均得到較好的保留和分離，峰形稍差?？紤]到液相色譜法中會(huì)用到磷酸鹽緩沖液，嘗試在流動(dòng)相中加入了微量的亞甲基二磷酸，發(fā)現(xiàn)對(duì)峰形有較明顯的改善作用。詳見(jiàn)圖1。

2.2 線性關(guān)系及最低檢出濃度

將1.4配制的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別進(jìn)樣2μL，以5種核苷酸峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2可知，線性范圍為5～500ng·mL-1時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)在0.99901～0.99999，線性良好。在信噪比(S/N)為3時(shí)，最低檢出濃度在0.23～0.98ng·mL-1。

2.3 精密度測(cè)試

同一樣品經(jīng)過(guò)1.5處理后，在1.6的條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，AMP、GMP、IMP、ADP、ATP的平均含量分別是14.2mg·100g-1、1.90mg·100g-1、6.23mg·100g-1、22.2mg·100g-1、7.14mg·100g-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是1.96%、1.21%、4.09%、2.45%、1.92%。

圖1 T3柱不同流動(dòng)相體系色譜峰比較

表2 5種核苷酸線性關(guān)系及最低檢出濃度

2.4 加標(biāo)回收測(cè)試

回收率測(cè)試是衡量標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)。稱取等量大閘蟹凍干樣品18份，按3水平3平行的方式加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5進(jìn)行處理，在1.6的條件下上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示,5種核苷酸在3水平加標(biāo)下平均添加回收率在91.7%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.03%～6.98%。方法準(zhǔn)確度符合要求。

表3 5種核苷酸回收率測(cè)定結(jié)果

3 討論

本文建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定大閘蟹中5種核苷酸，方法操作簡(jiǎn)單，線性關(guān)系、精密度、準(zhǔn)確度均能符合要求，可用于測(cè)定大閘蟹5種核苷酸的檢測(cè)。與傳統(tǒng)的液相色譜法相比，擁有更高的靈敏度及更短的檢測(cè)時(shí)間。解決了GMP、ATP、IMP這3種組分分離效果差，無(wú)法準(zhǔn)確定量的問(wèn)題。減少了有機(jī)相溶液的消耗，對(duì)環(huán)境友好。也不需要使用高濃度的磷酸鹽緩沖液，減少對(duì)色譜柱的損傷。

4 結(jié)論

采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，以乙腈-10mM乙酸銨(含5μM亞甲基二磷酸)為流動(dòng)相梯度洗脫，在電噴霧離子源下正、負(fù)切換掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)5種核苷酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定性及定量。5種核苷酸在5～500ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且方法準(zhǔn)確度、精密度較高。