穆應花, 邢家溧, 沈 堅, 應 璐, 毛玲燕, 徐曉蓉, 婁永江, 吳 希

(1. 寧波大學食品與藥品學院, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波市產品食品質量檢驗研究院(寧波市纖維所), 浙江 寧波 315048)

氯酚類化合物(chlorophenols, CPs)是苯環(huán)上活性位點的氫原子被氯原子取代后的產物,根據(jù)所取代的氯原子數(shù)不同可分為單氯酚(chlorophenol, CP)、二氯酚(dichlorophenol, DCP)、三氯酚(trichlorophenol, TrCP)、四氯酚(tetrachlorophenol, TeCP)和五氯酚(pentachlorophenol, PCP)共19種同分異構體[1],其中單氯酚和四氯酚共有3種同分異構體,二氯酚和三氯酚共有6種同分異構體。CPs是木材、紡織品、皮革制品及紙制品的防霉防腐劑,是果樹、蔬菜及其他農作物和水產品的殺蟲劑和殺菌劑,以及農作物的除草劑[2]。大量研究表明,CPs具有致畸、致癌和致突變作用,且其毒性隨著氯原子數(shù)目的增多而增強,間位氯取代基的毒性明顯高于鄰位氯取代基[3-5]。CPs種類多、危害大、不易降解,低濃度的CPs便可帶來嚴重的水質污染,并可通過生物富集在魚體內達到很高的濃度,進而給人類帶來安全隱患,已成為重點監(jiān)控的環(huán)境污染物之一,現(xiàn)已被許多國家禁止使用。如美國環(huán)境保護署(environmental protection agency, EPA)與人類環(huán)境健康評估組根據(jù)對2,4,5-三氯酚可能的致腫瘤效應的研究將其歸為D等級致癌物[6]。此外,2-氯酚、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚和五氯酚已經被EPA列為優(yōu)先控制污染物[7]。因而有必要對水環(huán)境和其中的生物體進行監(jiān)測。但目前對生物體中氯酚的檢測標準僅見于五氯酚或五氯酚鈉鹽的測定[8-10],國內外尚無水生生物體中涵蓋19種CPs同時檢測的方法標準和限量標準。

現(xiàn)有文獻報道的CPs的測定方法多為色譜法,主要有氣相色譜法(GC)[11,12]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[13-15]、液相色譜法(LC)[16]、液相色譜-質譜法(LC-MS)等[17-19]。LC和LC-MS不需要衍生化處理且檢測較快,但其定性能力和靈敏度較低,對溶劑要求較高,分析成本和日常維護費用較高。GC和GC-MS都需將CPs進行衍生化處理再進行分析,但GC-MS靈敏度更高,定性更可靠,相比于LC-MS檢測成本更低,被廣泛應用于CPs的測定。目前對于環(huán)境樣品、紡織品以及皮革制品和紙制品中多種CPs同時測定的方法已有文獻報道,如王成云等[20]建立了GC-MS測定紙和紙制品中19種CPs的方法,各組分的定量限均為2 μg/kg。莫賢科等[21]建立了GC-MS測定皮革中19種CPs的方法,前處理方法較為復雜,但也能滿足皮革中CPs的日常檢測。

目前對魚肉中氯酚的檢測多見于三氯酚、四氯酚、五氯酚或五氯酚鈉鹽的測定[22],而19種CPs同時檢測的方法報道較少。鐘惠英等[23]建立了GC-MS法測定大黃魚和草魚中的19種CPs,前處理采用硫酸消解后的液液萃取,較為復雜,且消耗大量有機溶劑。近年來發(fā)展較快的QuEChERS簡化了樣品處理過程,且對環(huán)境污染較小,具有高效、經濟、快速、簡便等優(yōu)點,被廣泛應用于有機污染物殘留檢測的前處理中[24,25]。如Padilla-Sanchez等[26]采用QuEChERS前處理結合氣相色譜-三重四極桿質譜法對農用土壤中的2-氯酚、4-氯酚、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、2,4,5-三氯酚和五氯酚進行了檢測,實現(xiàn)了樣品的快速前處理,節(jié)省了檢測時間。王連珠等[27]建立了QuEChERS結合UPLC-MS/MS測定動物源食品(豬肉、豬肝、雞肉、魚肉、牛奶、雞蛋)中痕量五氯酚。黃建芳[28]采用QuEChERS結合HPLC-MS/MS測定大黃魚中五氯酚的含量,檢出限為0.1 μg/kg,但該方法只對五氯酚進行檢測,未對其他氯酚類化合物的同分異構體進行分析。

鑒于當前魚中19種CPs同時檢測的方法較少,現(xiàn)有的研究存在前處理復雜或僅能檢測少數(shù)幾種CPs的現(xiàn)狀,因此本研究開發(fā)了基于改良的QuEChERS前處理提取凈化方法,結合GC-MS技術對魚中19種CPs同時測定,通過化合物的色譜保留時間和峰面積進行定性和定量分析,并通過實際樣品進行了方法的驗證。建立的方法能夠減少分析時間和溶劑消耗、降低環(huán)境污染、提高檢測效率,可適用于魚肉中19種CPs的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ 8000 Evo氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司); DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);分析天平(中國北京賽多利斯科學儀器有限公司);高速離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司); Vortex 3自動漩渦混合器(德國IKA公司);一次性無菌注射器(中國上海金塔醫(yī)用器材有限公司); Milli-Q Academic超純水儀(美國Millipore公司); KQ-500E超聲波清洗儀(中國寧波海曙科盛超聲設備有限公司);多功能渦旋混合器(德國IKA公司);多功能全自動氮吹濃縮儀(瑞典Biotage公司);移液槍(法國GILSON公司); 0.22 μm濾膜(美國Waters公司)。

實驗用的魚類(帶魚、鯽魚、鱸魚、鰱魚、鯉魚、草魚等)購于寧波路林市場。乙腈、丙酮(色譜純),購自德國Merck公司;正己烷、乙酸乙酯(色譜純),購自中國天津致遠化學試劑有限公司;二氯甲烷、環(huán)己烷(色譜純),購自中國江蘇永華化學科技有限公司;無水硫酸鎂、氯化鈉(分析純),購自中國國藥化學試劑有限公司;十八烷基鍵合硅膠(octadecylsilane chemically bonded silica, C18)、中性氧化鋁(alumina-N, AL-N)、石墨化炭黑(graphitized carbon black, GCB)、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine, PSA),硅烷化衍生試劑:N,O-雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, BSTFA),購自中國上海安譜實驗科技股份有限公司。

氯酚混合標準溶液:一氯酚(2-CP、3-CP、4-CP),二氯酚(2,3-DCP、2,4-DCP、2,5-DCP、2,6-DCP、3,4-DCP、3,5-DCP),三氯酚(2,3,4-TrCP、2,3,5-TrCP、2,3,6-TrCP、2,4,5-TrCP、2,4,6-TrCP、3,4,5-TrCP),四氯酚(2,3,4,5-TeCP、2,3,4,6-TeCP、2,3,5,6-TeCP),五氯酚(PCP)(上海安譜實驗科技股份有限公司),質量濃度均為1 000 μg/mL,使用時用正己烷稀釋至所需濃度。

1.2 標準溶液的配制

氯酚標準儲備液的配制:原混合標準溶液質量濃度為1 000 μg/mL,溶于二氯甲烷,使用時用正己烷配制。準確量取100 μL原混合標準溶液液于10 mL的容量瓶中,用正己烷定容至刻度線,搖勻,配制成10 μg/mL的儲備液,置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

混合標準溶液系列梯度的配制:吸取10 μg/mL的混合標準儲備液10 μL于1 mL的進樣瓶中,用正己烷定容至刻度線,搖勻,配制成100 μg/L的中間液,依次取100 μg/L的中間液10、20、40、60、80、100 μL于6個2 mL的進樣瓶中,分別用正己烷定容至1 mL,密封、搖勻。再取10 μg/L的溶液40、80 μL用正己烷定容至1 mL,密封、搖勻。得到標準系列溶液,質量濃度依次為0.4、0.8、1、2、4、6、8、10 μg/L。

1.3 樣品的制備及其前處理

提取:選取魚樣的肌肉組織絞碎均質,置于-18 ℃的冰箱中保存,準確稱取5.00 g魚肉樣品于50 mL的聚乙烯塑料離心管中,加入5 mL超純水和10 mL乙酸乙酯,渦旋分散30 s,然后向管中加入3 g氯化鈉和5 g無水硫酸鎂,渦旋振蕩1 min,隨后40 ℃超聲15 min,再以4 500 r/min離心5 min。

凈化:收集離心好的上清液至裝有500 mg的C18和100 mg無水硫酸鎂的15 mL聚乙烯塑料離心管中,渦旋振蕩30 min,超聲15 min,高速離心后取5 mL上清液于另一15 mL試管中,在45 ℃水浴中氮吹濃縮至小于1 mL,再用乙酸乙酯定容至1 mL,然后過0.22 μm的有機濾膜后再加入50 μL衍生試劑,在45 ℃衍生30 min,最后搖勻、冷卻至室溫,用GC-MS進行上機檢測。

1.4 儀器分析條件

GC條件:DB-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度為:260 ℃;載氣為高純He(純度≥99%);流速為1.0 mL/min。程序升溫條件:初始溫度70 ℃,維持1 min;然后以8 ℃/min升至160 ℃;再以3 ℃/min升至200 ℃;最后以40 ℃/min升至300 ℃,保持3 min。不分流進樣;進樣量為1 μL。

MS條件:離子源溫度260 ℃,傳輸線溫度280 ℃, EI離子源,電子能量:70 eV,溶劑延遲10 min,數(shù)據(jù)采集采用全掃模式定性,選擇離子監(jiān)測(SIM)模式定量,19種CPs的監(jiān)測離子詳見表1。

表 1 19種CPs的保留時間、定量、定性離子

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的優(yōu)化

CPs含羥基,使分子的極性增強,不利于直接色譜分離[29]。因此,需要衍生化,變成極性弱的物質,提高其揮發(fā)性,減少色譜分離過程中的峰拖尾,便于在色譜柱上分離。國家標準GB/T 18414.2-2006《紡織品含氯苯酚的測定》中采用了DB-17MS具有中等極性的色譜柱[30],但該色譜柱只對TeCP和PCP這兩類酚有很好的分離效果,對TrCP分離效果不好,因此本實驗參照ISO 17070∶2015(E)《皮革化學測試測定含氯苯酚的含量》[31],采用DB-5MS毛細管色譜柱對19種CPs的衍生化產物進行檢測,各同分異構體的出峰順序及保留時間分別見圖1和表1。

如圖1所示,DB-5MS色譜柱除了無法分離2,6-DCP和3,5-DCP外,對其他17種氯酚均能完全分開且峰形較好。這進一步說明了2,6-DCP和3,5-DCP性質相似,因而難以將兩者分離。所以應用本方法進行測定時2,6-DCP和3,5-DCP只能測定其二者的總量。

為進一步優(yōu)化方法,獲得更好的檢測效率,在上述色譜柱的條件下進行載氣流速的優(yōu)化,選擇不同流速0.8、1.0、1.2 mL/min,實驗結果發(fā)現(xiàn)隨著載氣流速的降低,2,6/3,5-DCP峰未見很好的分離,但載氣流速過慢導致拖尾峰以及分析時間大幅增加。因此,在保證分離度的基礎上,綜合評估,選取1.0 mL/min的載氣流速。

2.1.2質譜條件的優(yōu)化

先對19種CPs單標準溶液采用全掃描模式進樣,初步確定其對應的特征定量離子及其保留時間,分別找出豐度最高的離子碎片,如表1所示。進一步采用SIM模式,只對待測組分物質離子信號進行定性定量采集,很大程度上提高了對目標化合物的檢測靈敏度,減少了雜質的干擾,從而使試驗結果更加準確可靠。

圖 1 19種CPs的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion chromatogram of the 19 CPs 1. 2-CP; 2. 3-CP; 3. 4-CP; 4. 2,5-DCP; 5-6. 2,6-DCP+3,5-DCP; 7. 2,4-DCP; 8. 2,3-DCP; 9. 3,4-DCP; 10. 2,4,6-TrCP; 11. 2,3,5-TrCP; 12. 2,4,5-TrCP; 13. 2,3,6-TrCP; 14. 3,4,5-TrCP; 15. 2,3,4-TrCP; 16. 2,3,5,6-TeCP; 17. 2,3,4,6-TeCP; 18. 2,3,4,5-TeCP; 19. PCP.

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑種類及用量的優(yōu)化

不同的提取劑對CPs的提取效果不同,且產生的雜質干擾也不同。為了確定合適的提取溶劑,本實驗選擇正己烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯進行考察,結果如圖2所示。二氯甲烷和乙酸乙酯的回收率相當(64.0%～113.0%和67.0%～116.0%,p>0.05),高于弱極性的環(huán)己烷和正己烷的回收率(43.8%～85.0%和51.0%～92.0%)?？紤]到二氯甲烷沸點較低,在實驗操作過程中易揮發(fā),且二氯甲烷易帶來雜質峰,不利于大批量樣本的測定,因此選取強極性的乙酸乙酯作為提取劑。

圖 2 不同提取劑對19種CPs回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of different extraction agents on the recoveries of the 19 CPs (n=6)

同時,本實驗還考察了提取劑用量(6、8、10、12 mL)的影響。結果顯示,10 mL乙酸乙酯足以完全提取基質中的目標化合物,19種CPs的平均加標回收率達到最佳,在78.0%～112.0%之間;提取溶劑過多不僅會造成試劑浪費,還會導致基質中共萃取干擾物不斷增多,從而導致基質效應不斷加強;與黃武等[32]的實驗結果一致(5 g樣品選擇10 mL提取劑時提取酚類化合物的回收率最高)。因此,本實驗最終選擇提取劑用量為10 mL。

2.2.2凈化劑種類及用量的優(yōu)化

魚肉中含有脂肪、蛋白質、色素等物質,這些物質會干擾19種CPs的離子化,影響其檢測分析[33]。所以本實驗選擇C18、AL-N、PSA和GCB這4種凈化劑,考察凈化效果。

由表2可以看出,使用AL-N和GCB時都有3種氯酚的平均回收率低于60.0%,分別是2,4,6-TrCP、2,3,5-TrCP、PCP和2,4,6-TrCP、2,4,5-TrCP、PCP。PSA和C18的回收率范圍分別是60.5%～103.0%和69.8%～108.0%,但使用PSA時2,4,6-TrCP、2,3,4-TrCP和PCP的回收率較低(64.3%、68.9%和60.5%),使用C18時只有PCP的回收率較低(69.8%),其余18種CPs大多集中在82.0%～108.0%之間。可能的原因是,C18可以很好地除去疏水性共提物,如脂肪、有機酸等,還能有效除去非極性雜質,而CPs是極性的,所以除雜效果更好,與黃建芳[28]的研究結果一致。因此,選擇C18作為19種CPs的凈化劑。

表 2 不同凈化劑對19種CPs回收率的影響(n=6)

本實驗進一步考察了不同C18用量(100、300、500、700 mg)對19種CPs回收率的影響。由圖3可以看出,C18為500 mg時,目標化合物的回收率相對較高,為76.0%～114.0%,且絕大多數(shù)目標物的回收率都集中在89.2%～114.0%之間,因此選為所用。

圖 3 不同C18用量對19種CPs回收率的影響(n=6)Fig. 3 Effect of different dosages of C18 on the recoveries of the 19 CPs (n=6)

2.2.3衍生條件的優(yōu)化

硅烷化衍生具有熱穩(wěn)定性好、揮發(fā)性強、易于制備以及色譜性能好等優(yōu)點[34]。CPs極性強,揮發(fā)性和穩(wěn)定性都較低,不適于直接進樣。為獲得良好的峰形,需對提取物進行衍生化處理,因此本實驗選用BSTFA進行硅烷化衍生。考察了不同衍生劑體積對19種CPs回收率的影響(見表3)。CPs的回收率隨著衍生劑添加量的增加而增加,當達到50 μL時,衍生劑與目標物的反應達到飽和,回收率達到最佳,其回收率范圍為68.9%～115.0%;當衍生劑添加量為60 μL時,回收率基本保持不變;到70 μL時略有下降,回收率范圍為67.6%～109.0%。因此本實驗選擇衍生劑的量為50 μL。

表 3 不同衍生劑體積對19種CPs回收率的影響(n=6)

隨后對衍生溫度(35、40、45、50 ℃)進行了優(yōu)化,實驗結果發(fā)現(xiàn),隨著衍生溫度的上升,回收率逐漸呈上升趨勢,達到45 ℃時趨于平緩。在45 ℃時平均回收率達到最佳,為94.6%,所以本實驗選用衍生溫度為45 ℃。

在45 ℃下,加入50 μL衍生劑,分別衍生20、30、40、50 min。結果發(fā)現(xiàn),在20 min時衍生化反應不完全,目標物的回收率在49.0%～110.0%之間;在30 min時衍生化反應完全,19種CPs的回收率在74.0%～112.0%之間;在40 min和50 min時,其回收率效果差異不大。所以本實驗選擇衍生30 min以提高衍生效率。

2.3 方法學評價

2.3.1線性范圍與方法的檢出限

以空白基質提取液為溶劑,配制19種CPs混合標準溶液,在優(yōu)化的色譜條件下進樣檢測。以氯酚化合物的質量濃度(x, μg/L)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標,繪制校準曲線,計算回歸方程。結果如表4所示,19種CPs的相關系數(shù)R2均大于0.998,在0.4～10 μg/L范圍內線性關系良好。同時,在最低添加水平下,以3倍信噪比結合濃度外推法確定方法的檢出限(limit of detection, LOD),以10倍信噪比確定方法的定量限(limit of quantification, LOQ)。

表 4 19種CPs的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

2.3.2回收率與精密度

以空白魚樣為基質,分別添加低、中、高3個不同加標水平(0.16、0.32、1.6 μg/kg)的混合標準溶液,然后按優(yōu)化的樣品前處理方法進行測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差,每個加標水平平行測定6次,評估該方法的準確性和精密度,結果詳見表5。各組分的平均加標回收率為70.6%～115.0%,精密度(RSD)為2.6%～10.5%(n=6)。

2.3.3基質效應

本實驗通過比較帶魚、鯉魚、黃花魚空白基質溶液配制的混合標準溶液與正己烷配制的混合標準溶液的斜率來評價基質效應(matrix effect, ME)。

計算公式為:ME=[(基質匹配標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率)-1]×100%。ME為負值表示存在基質抑制效應,正值表示存在基質增強效應。以其絕對值為判斷依據(jù),絕對值越大則基質效應越強[35-37]。當|ME|<20%,為弱基質效應,可忽略;當20%≤|ME|≤50%,為中等強度基質效應;當|ME|>50%,為強基質效應[38,39]。結果如表6所示,帶魚中除2,5-DCP表現(xiàn)為強基質增強效應,其他化合物均為弱或中等強度基質效應;黃花魚中除2,3-DCP、2,3,5,6-TeCP和2,3,4,6-TeCP表現(xiàn)為強基質抑制效應,其他均為弱或中等強度基質效應;鯉魚均表現(xiàn)為弱基質效應或中等基質效應。因此,本方法采用基質匹配標準溶液進行校正,以消除基質帶來的影響,改善回收率。

表 6 不同魚類樣品中19種CPs的基質效應

2.3.4與其他方法的比較

將本研究與近幾年文獻報道的檢測CPs的前處理方法進行了簡單對比(見表7)。本方法與符昌雨等[22]的超聲萃取(ultrasonic extraction, UE)結合GC-MS檢測水產品中10種CPs的方法相比,可以實現(xiàn)19種CPs的同時檢測。UE雖操作簡單,但凈化不完全,導致檢測靈敏度降低,如黃姣等[40]和陳秋凱等[41]的方法檢出限為20 μg/kg。與鐘惠英等[23]、莫賢科等[21]的液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)結合GC-MS方法相比,具有前處理簡便、消耗溶劑少、提取效率高等優(yōu)點。固相萃取(solid phase extraction, SPE)具有凈化效果好、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,但處理步驟較復雜,本文的QuEChERS方法較為簡單,避免了SPE方法繁瑣的活化、上樣、淋洗和洗脫過程,樣品提取凈化成本低。結合GC-MS進行檢測,進一步提高了檢測結果的準確度和靈敏度。

2.3.5實際樣品的檢測

應用本方法分別對帶魚、巴沙魚、鯉魚和黃花魚等15個樣品進行檢測,結果如表8所示,在7個樣品中同時檢測出2,4-DCP、3,4-DCP、2,3,4-TrCP、2,3,4,5-TeCP,其中最小檢出值為0.04 μg/kg,最大檢出值為4.8 μg/kg。15個魚樣中黃花魚檢出的CPs總量最大,為8.74 μg/kg,其次為鯽魚7.59 μg/kg,米魚的檢出量最少,為1.59 μg/kg。

3 結論

本研究建立了QuEChERS-氣相色譜-質譜測定魚肉樣品中19種CPs含量的方法。通過優(yōu)化前處理條件以及衍生條件,該方法在0.4～10 μg/L范圍內呈良好的線性關系,線性相關系數(shù)均大于0.998,方法檢出限為0.01～0.05 μg/kg。應用本方法進行實際樣品檢測,不同魚肉樣品中均有不同程度的氯酚類污染物檢出。其中,黃花魚和鯽魚污染最嚴重,石斑魚和大黃魚次之,米魚污染程度最輕。所建立的方法簡化了樣品的前處理步驟,操作簡單,方法靈敏度高、重復性好,可滿足魚肉中19種CPs的高通量檢測要求,顯著提高CPs的檢測效率。