李 想, 王麗梅, 宋璐璐, 萬(wàn)政策, 寇 婧, 張明燁, 呂永曼, 王友潔, 梅素容*

(1. 華中科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所, 教育部環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430030; 2. 華中科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健系, 湖北 武漢 430030; 3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院健康管理中心, 湖北 武漢 430030)

有機(jī)氯農(nóng)藥(organochlorine pesticides, OCPs)和多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署簽署的“斯德哥爾摩公約”中兩類(lèi)主要的持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs),具有高毒性、持久性、生物蓄積性和遠(yuǎn)距離遷移性[1]。我國(guó)于20世紀(jì)70～80年代陸續(xù)禁產(chǎn)禁用OCPs和PCBs,但OCPs和PCBs仍可以在自然水體、土壤、食品及大氣中廣泛檢出[2-5]。環(huán)境介質(zhì)及食品中OCPs、PCBs的普遍污染導(dǎo)致人群的高暴露風(fēng)險(xiǎn),對(duì)人類(lèi)造成潛在的健康危害,如內(nèi)分泌干擾效應(yīng)、神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性和致癌效應(yīng)等[6-9]。因此,人體內(nèi)OCPs與PCBs暴露水平與健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估至關(guān)重要。

建立靈敏快速的人體內(nèi)OCPs和PCBs的檢測(cè)方法可為環(huán)境暴露與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。高脂溶性的OCPs和PCBs易蓄積于人體的脂肪組織,但在實(shí)際研究中,脂肪組織不易獲取[10]。在平衡狀態(tài)下,血液中POPs的濃度可以代表蓄積在脂肪組織中的POPs濃度[11,12];且血液獲取方便快捷,易獲得不同年齡層的樣本,因此血液被廣泛用作評(píng)價(jià)OCPs、PCBs在人體內(nèi)暴露水平的生物監(jiān)測(cè)樣本[13-15]。人體血液成分復(fù)雜,生物體內(nèi)殘留的OCPs、PCBs多處于痕量甚至超痕量水平,高效的前處理方法既可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的高效富集,又可以降低或去除基質(zhì)的干擾[16]。相較于傳統(tǒng)的液液萃取技術(shù)(liquid-liquid extraction, LLE),固相萃取技術(shù)(solid phase extraction, SPE)溶劑使用量少,樣品富集與凈化可以同時(shí)完成,使得檢測(cè)靈敏度大幅提高[17]。OCPs和PCBs的儀器分析方法包括氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)法(GC-ECD)、氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法(GC-MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法(GC-MS/MS)等,其中GC-MS/MS可高效分離多種組分,特異性強(qiáng)、靈敏度高,適用于血液中痕量OCPs和PCBs的精準(zhǔn)定量分析[18-20]。

目前,國(guó)內(nèi)外已有許多人體內(nèi)OCPs和PCBs殘留的檢測(cè)研究,屈偉月[21]建立的LLE串聯(lián)硅膠柱-GC-MS/MS檢測(cè)血清中12種OCPs和43種PCBs的分析方法回收率良好(79%～84%),檢測(cè)組分多,但前處理操作復(fù)雜,樣本用量大,且OCPs與PCBs不能同時(shí)檢測(cè);Stubleski等[22]建立的96孔板固相萃取-GC-MS/MS檢測(cè)血中5種OCPs和16種PCBs的分析方法樣本用量少,檢出限在2.2～167.0 ng/L之間,但回收率不甚理想(31%～63%)。

基于此,本研究建立了一種快速簡(jiǎn)便、樣本用量少、回收率和精密度良好的SPE-GC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)人血清中35種OCPs和PCBs的分析方法,并應(yīng)用于武漢市普通人群體內(nèi)OCPs和PCBs的濃度分布特征研究,為進(jìn)一步開(kāi)展人群健康效應(yīng)研究提供技術(shù)支撐和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Trace 1300氣相色譜-TSQ 8000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司);氮吹儀(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);固相萃取儀(美國(guó)Agilent公司);隔膜真空泵(美國(guó)GAST公司)。

Oasis?HLB固相萃取柱(1 mL/30 mg,美國(guó)Waters公司),胎牛血清(美國(guó)Thermo Fisher公司),尿素(分析純,中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)),二氯甲烷(農(nóng)殘級(jí),美國(guó)J. T. Baker公司),甲醇(色譜純,德國(guó)默克集團(tuán)),正己烷(農(nóng)殘級(jí),美國(guó)Sigma-Aldrich公司),純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán))。

17種OCPs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含α-六六六(α-HCH)、β-六六六(β-HCH)、γ-六六六(γ-HCH)、δ-六六六(δ-HCH)、p,p′-滴滴伊(p,p′-DDE)、p,p′-滴滴滴(p,p′-DDD)、p,p′-滴滴涕(p,p′-DDT)、艾氏劑(aldrin)、狄氏劑(diedrin)、異狄氏劑(endrin)、異狄氏劑醛(endrin aldehyde)、α-氯丹(α-chlordane)、γ-氯丹(γ-chlordane)、硫丹Ⅱ(endosulfan Ⅱ)、硫丹硫酸鹽(endosulfan sulfate)、環(huán)氧七氯(heptachlor epoxide)、甲氧滴滴涕(methoxychlor))和18種PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含PCB-28、PCB-52、PCB-77、PCB-81、PCB-101、PCB-105、PCB-114、PCB-118、PCB-123、PCB-126、PCB-138、PCB-153、PCB-156、PCB-157、PCB-167、PCB-169、PCB-180、PCB-189)均購(gòu)自美國(guó)AccuStandard公司。4種OCPs同位素內(nèi)標(biāo)13C6-γ-HCH、13C12-p,p′-DDE、13C12-p,p′-DDD、13C12-p,p′-DDT和18種13C12-PCBs同位素內(nèi)標(biāo)均購(gòu)自美國(guó)CIL公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液:用正己烷稀釋17種OCPs和18種PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成1 μg/mL的35種OCPs和PCBs混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液,于-20 ℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確量取一定量混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液,用正己烷稀釋,配制成50、20、10、5、2、1、0.50、0.20、0.10 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

每份血清樣本取100 μL,加入10 μL質(zhì)量濃度為100 ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)溶液,渦旋混勻后置于4 ℃過(guò)夜;取出樣本,用100 μL純凈水稀釋,加入100 mg尿素,渦旋混勻,超聲25 min;依次用3 mL二氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL純凈水活化平衡Oasis?HLB小柱;將樣品全部過(guò)柱,并用1 mL純凈水潤(rùn)洗樣品管兩次,將液體全部導(dǎo)入HLB小柱,流速0.5～1 mL/min;用6 mL純凈水淋洗HLB小柱,真空抽干45 min;用5 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液(1∶1, v/v)洗脫,收集全部洗脫液。洗脫液氮吹近干,用正己烷定容至100 μL,進(jìn)樣測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜條件:DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國(guó)Agilent公司);以高純氦氣(99.999%)作為載氣,柱流量1.0 mL/min,恒流模式;不分流進(jìn)樣模式,進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣口溫度250 ℃。色譜柱升溫程序:初始溫度60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至180 ℃,保持1 min,以3 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:三重四極桿質(zhì)譜儀,配備電子轟擊離子源,電離電壓70 eV;離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;定量分析采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,內(nèi)標(biāo)法定量。

1.5 血清樣本采集

2018～2019年在武漢市同濟(jì)醫(yī)院體檢中心采集武漢市普通人群血清樣本共4 132份,依據(jù)采樣時(shí)間(2018年秋季、2019年春季)、年齡(10個(gè)年齡組:≤30歲;31～35歲;36～40歲;41～45歲;46～50歲;51～55歲;56～60歲;61～65歲;66～70歲;>70歲)和性別將血清樣本混合為40個(gè)樣本池。本研究得到華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),招募志愿者均簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

按1.4節(jié)分析條件建立全掃描方法,根據(jù)化合物信息確定母離子后運(yùn)行子離子掃描,選擇豐度最高的兩對(duì)離子對(duì)作為目標(biāo)化合物的定量離子對(duì)和定性離子對(duì),并確定每對(duì)離子對(duì)的最佳碰撞能量。優(yōu)化后各目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 35種目標(biāo)物與22種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1線性范圍、方法檢出限與定量限

按1.3節(jié)前處理流程處理空白胎牛血清之后,向其中加入不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制質(zhì)量濃度為0.01～50.0 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用上述分析條件,以?xún)?nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)及方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)見(jiàn)表2。35種OCPs和PCBs在0.05～50.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)在0.989～0.999之間;以3倍信噪比相對(duì)應(yīng)的濃度作為方法的檢出限,以10倍信噪比確定方法的定量限,35種OCPs和PCBs的檢出限在1.2～71.4 ng/L之間,定量限在4.1～238.1 ng/L之間。

2.2.2方法的準(zhǔn)確度與精密度

采用胎牛血清進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),分別向胎牛血清中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每一組濃度做6個(gè)平行樣,計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。在檢測(cè)樣本的同時(shí)檢測(cè)空白胎牛血清和超純水基質(zhì),監(jiān)測(cè)儀器性能是否穩(wěn)定并控制實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能存在的污染情況。35種OCPs和PCBs的加標(biāo)回收率在72.6%～142%之間,RSD小于25%(見(jiàn)表3)。

表 3 35種分析物在胎牛血清中3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.3 方法學(xué)比較

血清樣本珍貴,不易獲取,其他文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法的樣本使用量一般不少于500 μL[23-26],本研究檢測(cè)血清用量只需要100 μL。Wittsiepe等[27]和Stubleski等[22]的方法樣本使用量少,分別為200 μL和150 μL,但檢測(cè)的OCPs組分少,加標(biāo)回收率不甚理想(見(jiàn)表4),本研究檢測(cè)組分多,檢出限低,準(zhǔn)確度與精密度高。同時(shí),本方法操作簡(jiǎn)便,經(jīng)過(guò)固相萃取就能有效去除雜質(zhì)和富集痕量待測(cè)組分,簡(jiǎn)化了繁瑣的前處理步驟,在大樣本人群監(jiān)測(cè)中能節(jié)約大量人力物力。

2.4 武漢市普通人群體內(nèi)OCPs和PCBs的濃度分布特征研究

采用所建立的方法檢測(cè)血清樣本池中35種OCPs和PCBs濃度,從表5的結(jié)果發(fā)現(xiàn):①武漢市普通人群血清中OCPs和PCBs的污染普遍存在,且以O(shè)CPs為主,其濃度水平依次為:p,p′-滴滴伊>β-六六六>γ-六六六>p,p′-滴滴涕>狄氏劑,其中p,p′-滴滴伊、p,p′-滴滴滴和甲氧滴滴涕檢出率達(dá)100%; ②本研究武漢市普通人群中OCPs的濃度水平與北京市普通人群暴露水平一致,低于江蘇普通人群OCPs暴露水平[28,29]。p,p′-滴滴伊/p,p′-滴滴涕比值通常作為p,p′-滴滴涕歷史累積的指標(biāo),該比值小于10表明p,p′-滴滴伊主要來(lái)源于滴滴涕的近期暴露,比值大于10表明p,p′-滴滴伊來(lái)源于滴滴涕的歷史暴露[30],本研究中p,p′-滴滴伊/p,p′-滴滴涕比值為58,推斷武漢市普通人群血清中p,p′-滴滴伊的蓄積可能主要來(lái)自于滴滴涕的歷史殘留; ③從PCBs同系物組成來(lái)看,武漢市普通人群血清中主要以PCB-28、PCB-153和PCB-52為主,非類(lèi)二噁英PCBs是主要成分,與國(guó)內(nèi)其他人群體內(nèi)PCBs的組成特征基本一致[31]。

2.5 血清中OCPs和PCBs濃度水平與年齡、性別的關(guān)系

血清中OCPs濃度隨年齡增加呈升高趨勢(shì)(見(jiàn)圖1a), 66歲以上人群血清中OCPs濃度顯著高于66歲以下人群(p<0.05),與我國(guó)萊州灣地區(qū)、吉林伊通等地人群血清樣本池中OCPs濃度變化趨勢(shì)一致,這可能是由于隨著時(shí)間推移,經(jīng)由各種途徑暴露的OCPs在人體中出現(xiàn)累積效應(yīng),提示年齡是影響人體OCPs負(fù)荷水平的重要因素[32,33]。46～55歲以及61～65歲人群血清中PCBs濃度水平略高于其他年齡組,但無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖1b),與Meng等[34]的研究結(jié)果一致,這可能是因?yàn)殡m然我國(guó)從20世紀(jì)80年代開(kāi)始禁止生產(chǎn)使用PCBs,但工業(yè)焚燒和廢舊電器的泄漏使得我國(guó)居民處于PCBs的持續(xù)暴露中[35,36]。

表 5 血清樣本中OCPs和PCBs的質(zhì)量濃度(n=40)

圖 1 不同年齡、性別血清樣本池中OCPs和PCBs的濃度分布(n=40)Fig. 1 Concentration distributions of OCPs and PCBs in pooled serum by age and gender (n=40)

60歲以下女性血清中OCPs濃度水平和相同年齡段男性血清中OCPs濃度水平無(wú)顯著性差異,而60歲以上女性血清中OCPs濃度水平較高,是相同年齡段男性血清中OCPs濃度的2～3倍(p<0.05,見(jiàn)圖1a),與Thomas等[37]、Porta等[38]的研究結(jié)果基本一致,這可能與男女飲食習(xí)慣的差異有關(guān)。與男性相比,女性偏向于攝入更多的蔬菜水果,而蔬菜水果中往往含有較高的OCPs殘留[39]。男性和女性血清中PCBs濃度水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)圖1b),與Zheng等[40]、Du等[41]的研究結(jié)果一致。不同季節(jié)(2018年秋季、2019年春季)收集的血清樣本池OCPs和PCBs濃度水平也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能是因?yàn)榇呵飪杉救巳荷攀衬Ｊ胶褪澄飦?lái)源無(wú)明顯變化。

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)人血清中35種OCPs和PCBs的方法,該方法檢出限低、回收率及精密度良好,且樣本用量少,操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)組分多,適用于環(huán)境健康研究中大樣本人群的生物監(jiān)測(cè),為OCPs和PCBs的人體內(nèi)暴露水平與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支持。利用建立的方法檢測(cè)了武漢市普通人群血清樣本中OCPs和PCBs的濃度水平,武漢市普通人群廣泛暴露于OCPs和PCBs,且以O(shè)CPs為主,非類(lèi)二噁英PCBs是PCBs的主要成分。血清中OCPs濃度隨年齡增長(zhǎng)呈升高趨勢(shì),OCPs濃度在60歲以上存在性別差異,不同性別血清中PCBs濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。