姜文霞 趙 燕 杜逸峰

1 上海健康醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，上海市 201318； 2 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)實驗教學(xué)中心 200092

目前，基于醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)實驗之炎癥實驗內(nèi)容豐富，大多數(shù)醫(yī)學(xué)高校和學(xué)院使用傳統(tǒng)的演示性和驗證性實驗手段。本實驗進行綜合性、設(shè)計性和探究性實驗改革，激發(fā)學(xué)生興趣，探索分層次的實驗教學(xué)舉措，嵌入操作性實驗技能，結(jié)合線上線下的實驗教學(xué)平臺，來促進學(xué)生自主性實驗、動腦動手，更好地培養(yǎng)學(xué)生不僅有效地掌握理論知識，更鍛煉實驗操作能力。

1 炎癥實驗教學(xué)改革的理念和設(shè)計思想

炎癥實驗項目涉及的理論知識點包括：炎癥的基本病變有三種：變質(zhì)、滲出和增生。變質(zhì)指炎癥局部的組織細(xì)胞發(fā)生的變性和壞死，有細(xì)胞水腫、脂肪變性、細(xì)胞凝固性壞死和液化性壞死等細(xì)胞變質(zhì)性改變；還有黏液樣變性和纖維素樣壞死等間質(zhì)變質(zhì)性改變；主要認(rèn)識炎癥的各類細(xì)胞，有急性中性粒細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞、過敏反應(yīng)嗜酸性粒細(xì)胞等。滲出指血管內(nèi)的液體成分、蛋白質(zhì)及各種炎細(xì)胞從血管進入組織間、體腔、體表和黏膜表面的過程，滲出是炎癥最具特征性的改變，包含：血管口徑改變和血流量增加(炎性充血)；血管通透性增高(炎性滲出)；白細(xì)胞游出和聚集(炎性浸潤)。增生指在致炎因子、組織壞死的崩解產(chǎn)物或某些理化因子的刺激下，炎癥局部的巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等均可增生，屬于細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的增生，具有限制炎癥擴散和修復(fù)的作用。

炎癥局部聚集的白細(xì)胞能有效殺傷病原微生物，白細(xì)胞的滲出構(gòu)成炎癥防御反應(yīng)中及其重要的一環(huán)。因此，認(rèn)知各種白細(xì)胞/炎癥細(xì)胞是掌握炎癥最重要的特征。

以往驗證性實驗主要認(rèn)知炎癥基本變化中變質(zhì)的變性壞死與急性炎癥細(xì)胞；滲出的各種急性炎癥細(xì)胞和漿液性纖維素性滲出液；增生性炎癥的肉芽腫性病變和慢性炎癥細(xì)胞等，學(xué)生僅停留在驗證性認(rèn)知和觀察水平，通過顯微鏡或電腦圖片觀察各種細(xì)胞形態(tài)特征，只能依靠單純記憶，不能舉一反三，容易遺忘。精品實驗設(shè)計思想從綜合性和設(shè)計性入手，實驗內(nèi)容從探索數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)分析模塊中的體視學(xué)形態(tài)定量分析測量炎癥區(qū)及區(qū)別各種炎癥細(xì)胞；再通過基礎(chǔ)科研免疫組化實驗，進一步明白炎癥相關(guān)因子IL-1β和TNF-α的炎癥損傷作用[1]。使以往的驗證性實驗從只停留在動眼的層次上，轉(zhuǎn)向動手、動眼、動腦的設(shè)計性和綜合性實驗，提高實驗教學(xué)質(zhì)量。

2 炎癥實驗教學(xué)改革的實施

2.1 實驗教學(xué)前的預(yù)習(xí)、引導(dǎo)及準(zhǔn)備工作 應(yīng)用中英文PPT課件，改進炎癥的實驗大綱、實習(xí)指導(dǎo)及實驗計劃書等作為實驗教學(xué)前的預(yù)習(xí)、引導(dǎo)及準(zhǔn)備工作；實驗班分組輪轉(zhuǎn)炎癥實驗的三個模塊：(1)數(shù)字化與實體化的標(biāo)本與切片形態(tài)結(jié)構(gòu)認(rèn)知；(2)體視學(xué)形態(tài)定量分析炎癥細(xì)胞；(3)操作免疫組化實驗，檢測炎癥組織中的炎癥細(xì)胞因子。同時，注重實驗教學(xué)過程中氛圍的營造[2]，學(xué)生積極性的調(diào)動，實踐能力的鍛煉，創(chuàng)新意識的培養(yǎng)，探究性思維的啟發(fā)。

2.2 數(shù)字化與實體化的標(biāo)本與切片形態(tài)結(jié)構(gòu)認(rèn)知實驗 根據(jù)理論知識點，基于傳統(tǒng)的顯微鏡下組織切片認(rèn)知以及大體標(biāo)本實體認(rèn)知，從炎癥的基本病理變化，到炎癥局部的組織細(xì)胞發(fā)生的變性和壞死。一系列的病變中，主要認(rèn)識炎癥的各類細(xì)胞。同時，緊扣大綱知識點，識別炎性滲出的液體成分、蛋白質(zhì)以及各種炎癥細(xì)胞從血管進入組織間、體腔、體表和黏膜表面的過程。同時輔以線上“形態(tài)學(xué)數(shù)字化教學(xué)平臺”中的大體數(shù)字標(biāo)本來拓展學(xué)生舉一反三的實驗教與學(xué)體驗，包括360°全景影像數(shù)據(jù)，讓數(shù)字標(biāo)本進行旋轉(zhuǎn)、放大，并可以進行測量和標(biāo)注的病理學(xué)數(shù)字化大體標(biāo)本，采用動態(tài)預(yù)聚焦(DPF)方式掃描，其精度可達0.23μm/pixel(40×)高分辨率模式，學(xué)生可隨時隨地對大體和顯微切片任何區(qū)域進行觀察，在鼠標(biāo)操縱下選擇切片任意位置完成無極變倍連續(xù)縮放瀏覽，并提供切片全景導(dǎo)航，使高倍鏡下的圖像與低倍鏡下的位置形成良好對應(yīng)，資料傳輸不受時間和空間的約束。如闌尾炎數(shù)字大體標(biāo)本圖所示(圖1、2)。

在實驗教學(xué)過程中構(gòu)建形成性評價與反饋體系，使用“形態(tài)學(xué)實驗操作評價互動系統(tǒng)”，使老師動態(tài)檢測實驗教與學(xué)效果，學(xué)生隨時隨地了解自身的實驗學(xué)習(xí)效果，給予實驗教學(xué)過程的形成性和即時性評價。

圖1 闌尾炎大體數(shù)字標(biāo)本放大

圖2 闌尾炎大體數(shù)字標(biāo)本進行旋轉(zhuǎn)

同時，建立炎癥相關(guān)的數(shù)字化考試切片數(shù)據(jù)庫[3]。實驗考試時，隨機抽取數(shù)碼切片，學(xué)生寫出組織切片診斷內(nèi)容，例如闌尾炎[4]數(shù)碼切片從低倍全景到高倍細(xì)節(jié)(圖3、4)。

圖3 數(shù)碼切片—闌尾炎低倍

2.3 應(yīng)用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)分析模塊——體視學(xué)形態(tài)定量分析測量炎癥區(qū) 選擇闌尾炎肌層的中性粒細(xì)胞分布區(qū)作為觀察檢測視場，隨機選擇組織切片中的10個高倍鏡視野(200×)來進行分析測量。根據(jù)目標(biāo)總個數(shù)、目標(biāo)總面積、統(tǒng)計場面積、面密度、數(shù)密度、周密度等指標(biāo)，可對多幅圖像的分析結(jié)果自動合并統(tǒng)計二維和三維體視學(xué)多項結(jié)構(gòu)參數(shù)和光密度參數(shù)測量炎癥區(qū)。學(xué)生從以上分析測量中，不僅從數(shù)碼切片細(xì)胞形態(tài)上認(rèn)知和識別炎癥細(xì)胞，還可通過體視學(xué)形態(tài)定量分析提供測量和統(tǒng)計出的一系列參數(shù)，來甄別中性粒細(xì)胞的真?zhèn)危挥羞x中的細(xì)胞才能計算各種數(shù)值，從數(shù)值的比較上來即時性確定不典型炎癥細(xì)胞，加強學(xué)生掌握炎癥細(xì)胞的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)與特征，使學(xué)生在二年級開始接觸初級科學(xué)研究方法的醫(yī)學(xué)圖像測量分析方法，開啟數(shù)據(jù)研究思維，通過鏡下選定目標(biāo)炎癥區(qū)，根據(jù)步驟，完成分析報告并打印。

2.4 免疫組化檢測炎癥因子實驗 炎癥最明顯的一個主要癥狀是發(fā)熱，發(fā)熱是外源性和內(nèi)源性致熱原共同作用的結(jié)果。細(xì)菌產(chǎn)物等外源性致熱原，可以刺激白細(xì)胞釋放內(nèi)源性致熱原，例如白細(xì)胞介素1(IL-1)和腫瘤壞死因子(TNF)。IL-1主要由炎癥的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種調(diào)節(jié)自然免疫的細(xì)胞因子，可通過活化其他炎癥介質(zhì)，如前列腺素、白三烯和血小板活化因子等損傷組織。

TNF-α是炎癥時最早升高的細(xì)胞因子，并起到了核心作用，其主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，是重要的炎癥介質(zhì)。TNF-α不但激活自身，還能促進其他因子(如血小板活化因子、一氧化氮、氧自由基等)的產(chǎn)生，引起白細(xì)胞活化和細(xì)胞黏附分子上調(diào)以及大量其他遞質(zhì)爆發(fā)等一系列連鎖反應(yīng)和放大反應(yīng)，造成這種不可逆的促炎癥遞質(zhì)刺激物大量釋放以及效應(yīng)細(xì)胞的活化，即“瀑布樣效應(yīng)”，最終導(dǎo)致重癥患者發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能障礙綜合征(MODS)。

炎癥實驗教學(xué)不僅要從炎癥細(xì)胞的形態(tài)上認(rèn)識，更要從本質(zhì)上、分子蛋白水平更深刻地認(rèn)識。加入基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)免疫組化實驗，開創(chuàng)學(xué)生動手實驗操作技能，更早地接觸基礎(chǔ)科研抗原抗體免疫復(fù)合物檢測基因蛋白的免疫組化實驗，完成實驗報告，有助于學(xué)生創(chuàng)新意識的培養(yǎng)和探究性思維的啟發(fā)。

分別使用Affinity公司對人、小鼠、大鼠反應(yīng)的多克隆兔抗體IL-1β和TNF-α，對闌尾炎肌層內(nèi)的急性炎癥細(xì)胞做定性實驗。實驗步驟從脫蠟及水化→震蕩清洗→阻斷酶活性→抗原熱修復(fù)→滴加封閉液→滴加抗體→滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素→DAB溶液顯色→蘇木素—伊紅復(fù)染→分化→脫水→透明→中性樹膠封片→鏡下觀察。其中，“震蕩清洗”需要用0.1MPBS緩沖液連續(xù)震蕩清洗3次，且在“阻斷酶活性”后、“抗原熱修復(fù)”后、“滴加抗體”后、“滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素”后、“DAB溶液顯色”后都必須進行“震蕩清洗”。另外，需要注意的是，蘇木素—伊紅復(fù)染浸泡的時間根據(jù)染色的結(jié)果進行調(diào)整，切片分化需在鏡下觀察，若分化過度，應(yīng)水洗后重新染色，若分化不足，應(yīng)依具體情況延長分化時間。實驗中的操作細(xì)節(jié)也提高了學(xué)生基礎(chǔ)科研實驗的操作技能基礎(chǔ)。

實驗結(jié)果免疫組織炎癥細(xì)胞因子陽性表達判定：光學(xué)顯微鏡視野下，IL-1的陽性表達結(jié)果為細(xì)胞漿以及炎癥基質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色異染性顆粒，TNF-α的陽性表達結(jié)果為細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色異染性顆粒(圖5、6)。

圖5 IL-1陽性表達細(xì)胞漿(400×，1∶100)

實驗結(jié)束后，學(xué)生完成實驗報告，包括實驗原理、實驗現(xiàn)象、實驗步驟、結(jié)果與分析、實驗總結(jié)以及提出實驗問題。

2.5 構(gòu)建炎癥“小微課群” 梳理炎癥縱向知識結(jié)構(gòu)從病因?qū)W、發(fā)病機制、病理改變與臨床聯(lián)系。從臨床疾病學(xué)有急性炎癥、慢性炎癥等；從知識點有變質(zhì)性炎、漿液性炎、纖維素性炎、化膿性炎、出血性炎、一般慢性炎、各種特異性肉芽腫性炎等；從機制有炎癥介質(zhì)、趨化作用、補體系統(tǒng)等，縱橫交錯，結(jié)合炎癥細(xì)胞的特征，以“小微課群”串聯(lián)知識點嵌入實驗教學(xué)中。

3 炎癥實驗教學(xué)改革的效果與評價

炎癥實驗的設(shè)計以綜合性和操作性為特色[5]，優(yōu)于以往單純的演示性和驗證性實驗手段，將學(xué)生僅依靠單純記憶、容易遺忘的靠眼看的實驗，轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鲂?、探索性、操作性實驗，同時結(jié)合線上線下的數(shù)碼切片的形態(tài)學(xué)綜合實驗。首先，學(xué)生在鞏固炎癥理論知識點的基礎(chǔ)上，對炎癥的基本病理變化，在實驗觀察中有了感性認(rèn)識：急性炎癥以中性粒細(xì)胞為主；慢性炎癥以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主；過敏性反應(yīng)以嗜酸性粒細(xì)胞為主；慢性肉芽腫性炎癥以巨噬細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞及慢性炎癥細(xì)胞為主等。通過數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)的體視學(xué)形態(tài)定量分析測量炎癥區(qū)的不同細(xì)胞，更加直觀認(rèn)識各種炎癥細(xì)胞。第二，通過動手操作免疫組化實驗，對炎癥的機制、炎癥介質(zhì)的作用等，不僅從基因蛋白水平認(rèn)知炎癥的本質(zhì)，從理論上扎實了基礎(chǔ)知識，更能通過實驗原理、實驗過程、實驗步驟、實驗結(jié)果分析、實驗報告撰寫等一系列的實驗過程，鍛煉了低年級醫(yī)學(xué)生的實驗操作和科研能力，實驗中遇到的問題也激發(fā)了學(xué)生查文獻、提高解決問題的動腦動手能力。第三，通過構(gòu)建單個知識點的“小微課群”，學(xué)生隨時隨地應(yīng)用移動端自由學(xué)習(xí)，結(jié)合線下實體炎癥不同病變的大體疾病標(biāo)本和顯微鏡下組織切片的實驗，輔以“形態(tài)學(xué)數(shù)字化教學(xué)平臺”的數(shù)字大體標(biāo)本全景影像數(shù)據(jù)，進行旋轉(zhuǎn)、放大觀察，同時，在鼠標(biāo)操縱下選擇切片任意位置完成無極變倍連續(xù)縮放瀏覽，提高了學(xué)習(xí)自主性，達到了高效、主動、積極的學(xué)習(xí)效果。第四，不斷積累改進中英文課件，改進炎癥的實驗大綱、實習(xí)指導(dǎo)及實驗計劃書，建立炎癥相關(guān)的數(shù)字化考試切片數(shù)據(jù)庫。實驗考試時，隨機抽取數(shù)碼切片，讓學(xué)生寫出組織切片診斷內(nèi)容，杜絕了實驗考試交頭接耳的弊端，提高實驗教學(xué)質(zhì)量。同時，運用“形態(tài)學(xué)實驗操作評價互動系統(tǒng)”反饋學(xué)生在實驗中的問題，批改學(xué)生實驗作業(yè)，使老師動態(tài)檢測實驗教與學(xué)的效果，使學(xué)生隨時隨地了解自身的實驗學(xué)習(xí)效果，給予實驗教學(xué)過程的形成性和即時性評價。實驗考試成績由形成性評價的實驗過程占70%(體視學(xué)形態(tài)定量分析報告占30%，免疫組化實驗報告占40%)，終結(jié)性評價的切片考試成績占30%。在充分調(diào)動學(xué)習(xí)積極性的同時，也讓學(xué)生達到大綱要求的知識點掌握程度。相比以往同類實驗中僅單純的大體標(biāo)本和切片觀察，學(xué)生反映設(shè)計性、綜合性實驗的手段豐富、有趣味性，運用“小微課群”的方式更加靈活，節(jié)約了實驗中講授的時間，同時，實驗的考核注重實驗思維和能力，對所需要掌握的實驗要點更能達成目標(biāo)。

4 結(jié)語

通過炎癥實驗教學(xué)改革推陳出新，醫(yī)學(xué)生在初期不僅熟知相關(guān)理論知識點和顯微鏡下變質(zhì)、滲出、增生的炎癥基本病理變化以及各種炎癥細(xì)胞的識別，更是探索與掌握這些炎癥細(xì)胞對損傷組織的意義和機制，夯實了這部分知識點的掌握，同時培養(yǎng)了動手能力，在實驗過程中，鍛煉了實驗技巧和過程設(shè)計以及實驗報告的撰寫能力。切實有效的提高實驗教學(xué)質(zhì)量和醫(yī)學(xué)生的理論結(jié)合實踐的能力，為培養(yǎng)復(fù)合型、高水平的未來卓越醫(yī)師打下堅實的基礎(chǔ)。