陳 春，郭新亞，王 磊，陳衛(wèi)軍

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 宿遷農(nóng)科所，江蘇 宿遷 223700）

0 引言

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，對保障糧食安全起到至關重要的作用。我國的水稻育種經(jīng)過水稻矮化育種、雜交水稻育種、超級稻育種3次綠色革命，水稻的單產(chǎn)已達到6892.5 kg/hm2的水平［1］。江蘇作為南方的水稻主產(chǎn)區(qū)，品種類型豐富，秈、粳稻亞種并存，每年粳稻的種植面積近200萬hm2，秈稻的種植面積在30萬hm2左右［2］。在過去的相當長一段時間內(nèi)，我國的水稻育種以追求高產(chǎn)為主要方向，忽視了稻米品質(zhì)改良和抗性水平的提升。與國外相比，我國的稻米品質(zhì)研究起步較晚，大體上可以分為以下3個主要階段：第一階段是改革開放以前，國外已經(jīng)開展稻米品質(zhì)性狀的遺傳規(guī)律和遺傳效應研究，同期內(nèi)我國對稻米品質(zhì)的研究還停留在簡單的外觀檢測方面，系統(tǒng)的遺傳學研究［3］還未起步；第二階段是改革開放之后到20世紀末，以稻米品質(zhì)性狀的經(jīng)典遺傳學研究為主要研究方向，初步明確了一些品質(zhì)性狀如粒型、堊白、直鏈淀粉含量等的遺傳規(guī)律，但是基因克隆與功能等方面［4-5］的研究還未開展；第三階段是進入21世紀以來，稻米品質(zhì)性狀相關的分子遺傳研究進入了快速發(fā)展階段［6］。在2001～2010年間，主要利用分子標記對品質(zhì)性狀進行遺傳連鎖、關聯(lián)分析和相關數(shù)量性狀位點（QTLs）的定位分析研究［7-9］；從2010年至今，稻米品質(zhì)性狀相關的重要基因陸續(xù)被定位和克隆，同時功能基因的分子標記輔助選擇和基因編輯技術被用于水稻育種研究，一批具有優(yōu)良性狀或者特殊功能的水稻新品種被選育出來，稻米品質(zhì)的遺傳改良研究進入了快速發(fā)展階段［10］。稻米的品質(zhì)性狀直接決定水稻的商品性。稻米加工企業(yè)需要出米率高的（加工品質(zhì)）品種；優(yōu)質(zhì)的外觀品質(zhì)往往使稻米具備較高的商品附加值；好吃又健康（具有較高的營養(yǎng)品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)）的稻米更受消費者青睞。與東北粳稻相比，江蘇的粳稻具有豐產(chǎn)性好、單產(chǎn)水平高的優(yōu)點，但同時也存在稻米品質(zhì)一般、食味性較差的劣勢，其中外觀品質(zhì)是造成江蘇地區(qū)稻米品質(zhì)一般的主要原因，主要表現(xiàn)為堊白度、堊白粒率較高。隨著大眾生活水平和消費水平的不斷提升，稻米消費已由單純的“吃飽”轉變?yōu)椤俺院谩?，人們對?yōu)質(zhì)稻米的需求越來越多［11］。外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)是衡量優(yōu)質(zhì)稻米的重要指標。外觀品質(zhì)主要包含粒型、透明度、堊白度等指標；食味品質(zhì)常常與直鏈淀粉含量、膠稠度、蛋白質(zhì)含量、糊化溫度等因素相關。粒型與堊白是稻米外觀品質(zhì)的重要構成要素，其中粒型主要指籽粒的長度、寬度、長寬比等，直接決定了稻米的碾磨品質(zhì)和稻米消費的商品性，同時該性狀的遺傳主要由核基因控制；堊白是指稻米胚乳中白色不透明部分，其遺傳調(diào)控較為復雜，受遺傳和環(huán)境等因素共同影響。一般認為，少堊白或無堊白以及長粒型稻米的商品價值高［12］。

引入粒型調(diào)控基因，采取分子標記輔助選擇，定向改良籽粒的粒型，是一種行之有效的育種手段。近年來與水稻粒型相關的功能基因的克隆與遺傳研究迅速開展，一批具有重要功能性狀的基因被發(fā)現(xiàn)和利用，如GS3、GW2、GW5、GS5、AGG3和qGL3等［13］。這些粒型調(diào)控主效基因在粒長、粒寬、粒厚等方面控制籽粒形狀。例如：GS3粒型調(diào)控基因，其突變體導致G蛋白的γ亞基功能的缺失，促進細胞伸長，進而產(chǎn)生長粒性狀［14］；GW2通過將其底物錨定在蛋白酶體進行降解，負調(diào)控細胞分裂，該基因的突變使得本應降解的底物不能被特異性識別，從而促使穎花外殼細胞分裂，增加穎花外殼寬度，因而胚乳變大，最終粒寬增加，粒重和產(chǎn)量水平相應提高［15］。Zhao等［16］利用圖位克隆在水稻第9染色體上精細定位到控制粒長的新基因GS9。過表達GS9導致形成圓形籽粒，該基因的功能缺失突變體gs9籽粒細長，但不影響植株的生長發(fā)育、粒重及最后產(chǎn)量；這種粒型可以顯著減少堊白的產(chǎn)生，從而減少米粒堊白。GS9編碼1種沒有已知保守功能域的蛋白質(zhì)，它通過改變細胞分裂來調(diào)節(jié)籽粒形狀。GS9和卵形家族蛋白OsOFP14、OsOFP8之間的相互作用受OsGSK2激酶（1種油菜素類固醇信號通路的關鍵調(diào)節(jié)因子）的調(diào)節(jié)。遺傳互補分析結果表明，GS9的功能獨立于其他已知籽粒粒型調(diào)控基因，例如：GW5和GS3是2個已經(jīng)報道的可以控制水稻粒型的基因，為了分析它們與GS9之間的調(diào)控關系，將NIL-gs9分別和GW5、GS3的NIL雜交，后代在一定程度上表現(xiàn)出更為細長的粒型，表明GS9、GW5和GS3對粒型的調(diào)控具有加性效應，但對其他粒型調(diào)控基因沒有影響，表明GS9是獨立于其他粒型決定基因、新發(fā)現(xiàn)的1種粒型調(diào)控基因。

泗稻17號是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院宿遷農(nóng)科所新育成的水稻品種，于2019年通過了江蘇省審定（審定編號：蘇審稻20190011）。該品種產(chǎn)量水平高,穩(wěn)產(chǎn)性較好，生育期適中，綜合抗性強，抗倒伏能力好，熟期轉色快。目前，泗稻17號已被大面積示范推廣，但是由于該品種的外觀品質(zhì)一般，不能滿足目前江蘇稻米消費市場對優(yōu)質(zhì)、高端大米的需求，勢必會制約該品種長久的推廣應用。本研究利用日本晴背景的NIL-gs9作為供體親本，以泗稻17號作為受體和輪回親本，利用分子標記輔助選擇的方法，將粒型調(diào)控基因GS9定向轉入泗稻17號中，以期實現(xiàn)粒型的快速遺傳改良，提高泗稻17號的外觀品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

日本晴（NIL-gs9），屬中長粒型，作為供體親本。泗稻17號，屬橢圓粒型，作為受體親本和輪回親本。將這2個親本材料雜交配組，標記檢測GS9/gs9單株，并將其與泗稻17號回交。對每個回交世代進行分子標記檢測，篩選含有GS9/gs9的雜合基因型群體，并與輪回親本回交3次。通過農(nóng)藝性狀調(diào)查，選擇主要農(nóng)藝性狀與泗稻17號類似的后代材料，進行1次自交，獲得BC3F2分離群體。

1.2 單株選擇和粒型考察

于2018～2020年在海南三亞南繁基地和江蘇泗陽育種基地進行大田種植。改良材料采取單苗栽插，單穗收獲；利用圖像分析系統(tǒng)，檢測籽粒的長度、寬度、長寬比等。在田間篩選主要農(nóng)藝性狀優(yōu)于或接近泗稻17號的改良材料，主要考察生育期、株高、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)、千粒重、結實率、稻瘟病抗性等指標。本研究篩選到3株中長粒型、植株健壯、生育期適中、豐產(chǎn)性較好的改良后代，并以此為研究對象分析改良效果。

1.3 分子標記鑒定

采集幼嫩的水稻葉片，采取CTAB法［5］提取DNA，利用合成的Indel標記IN0919對親本材料進行多態(tài)性檢測和后代材料的目標基因篩選。IN0919標記序列為IN0919-F（5′-CGTTTAGGCTGGCTGC-3′）和IN0919-R（5′-CAGTTGGTGGTTT CGTAGAG-3′）。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共循環(huán)33次；最后在72 ℃下再延伸5 min。在PCR擴增完畢后，吸取20 μL PCR產(chǎn)物，點樣于3%的瓊脂糖凝膠，置于裝有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，在100 V穩(wěn)壓下電泳1 h左右，最后在凝膠掃描成像系統(tǒng)下記錄結果。

2 結果與分析

2.1 親本和后代群體間的標記多態(tài)性和檢測效果

利用GS9基因的功能性標記對供體親本、受體親本進行多態(tài)性檢測，結果（圖1）顯示：IN0919在供體親本和受體親本間存在明顯的多態(tài)性；在雜交的后代群體中，IN0919的擴增片段呈現(xiàn)出3種帶型，即1號供體親本帶型（A）、2號受體親本帶型（C）和3號雜合帶型（B），表明利用IN0919功能標記能夠有效地篩選符合目標性狀的后代材料。

圖1 標記IN0919在受體與供體親本間的多態(tài)性

2.2 選育的主要過程和功能標記輔助選擇

于2018年夏季在宿遷正季以泗稻17號為母本，與含有gs9基因的日本晴進行雜交配組；同年冬天在海南開展南繁加代；從F1代開始以泗稻17號為輪回親本，進行連續(xù)回交3次。對每一個世代材料開展主要農(nóng)藝性狀的鑒定和篩選，選擇劍葉挺舉、株高適中（90～100 cm）、生育期適中（145～150 d）、稻瘟病抗性水平較高（達5級以上）、抗倒伏能力強的后代材料。對符合育種目標的后代材料，利用功能標記開展基因型鑒定。在3次回交之后，得到了 BC3F1代材料；篩選主要農(nóng)藝性狀與泗稻17號相近、含有粒型調(diào)控基因gs9、中長粒型的后代材料，并進行1次自交；在BC3F2代分離群體中進行農(nóng)藝性狀的篩選和標記檢測，選擇中長粒型、主要農(nóng)藝性狀良好的單株18株（圖2）。

圖2 選育系譜圖

2.3 F2群體的粒長分離情況

分析NIL-gs9與泗稻17號的F2代分離群體中單株的粒長、粒寬。短粒單株數(shù)量與長粒單株數(shù)量分別為317和112株，短粒與長粒的比例為2.83∶1，經(jīng)卡方檢測，符合1對基因3∶1的理論分離比。分析分離群體的粒寬變化，粒寬的變化范圍為2.3～2.6 mm，無明顯規(guī)律。表明在回交群體背景下GS9能夠表現(xiàn)出單個主效基因的效應，有效地提高后代材料的粒長，但對粒寬無明顯的改良效應。

2.4 粒型基因的改良效應

在泗稻17號和NIL-gs9的后代分離群體中（圖3），篩選出1個符合育種預期目標且為中長粒型的優(yōu)良單株SC104。將SC104的籽粒脫粒后隨機抽取100粒種子，統(tǒng)計粒長、粒寬和長寬比，其粒長的變化范圍為5.45～5.78 mm，平均值為5.61 mm，與輪回親本泗稻17號（平均粒長5.10 mm）相比平均增長了0.51 mm，增長幅度較大；粒寬的變化范圍為2.76～2.84 mm，平均值為2.78 mm，與輪回親本（平均粒寬2.81 mm）相比無顯著變化；籽粒長寬比的變化范圍為1.94～2.10，平均值為2.01，與輪回親本泗稻17號的長寬比（1.80）相比，變化顯著，增加幅度很大（圖4）。上述結果表明：水稻粒型功能基因GS9能夠有效地延長稻米粒長，保持粒寬基本不變，顯著提高籽粒的長寬比，達到改良稻米粒型的目的。

圖3 標記對BC3F2群體部分單株的基因型檢測結果

圖4 親本和改良單株的水稻粒型對比

3 小結與討論

江蘇省作為南方地區(qū)最大的粳稻種植區(qū)，從2000年開始，在品種選育和新品種審定過程中重視稻米品質(zhì)改良，目前對外觀品質(zhì)未達到國標3級優(yōu)質(zhì)稻谷標準的品種不予以審定，這有力地促進了江蘇粳稻品質(zhì)性狀的改良和提升，選育了一批稻米品質(zhì)達1級的優(yōu)質(zhì)稻谷品種。同時在食味品質(zhì)研究方面更是形成了江蘇特色，以“南粳”系列為代表的半糯性品種，以其獨特的“香、糯、軟、彈”特性，多次在全國優(yōu)良食味品評中獲獎；宿遷農(nóng)科所選育的“泗稻301”在2019年全國優(yōu)良食味品評中斬獲第1名。但是由于水稻的品質(zhì)是由多種性狀組成的綜合性狀，與環(huán)境存在較為復雜的互作關系，這也導致在稻米性狀的改良過程中難以兼顧所有品質(zhì)性狀。例如南粳9108［17］具有優(yōu)良的食味品質(zhì)，但是其暗胚乳影響稻米的外觀。同時江蘇水稻在灌漿結實期常常遭遇高溫天氣，這也會導致稻米的堊白粒率和堊白度的增加，從而影響外觀品質(zhì)。一般認為稻米的堊白與粒型密切相關，細長籽粒的堊白度和堊白粒率較低。借助分子標記輔助選擇的手段，定向改良籽粒的粒型，增加粒長，能夠選育出具有優(yōu)良外觀品質(zhì)的水稻新品種。例如：方珊茹等［18］利用連鎖標記進行回交導入和農(nóng)藝性狀選擇，將GS3長粒等位基因及其他外觀品質(zhì)性狀基因注入目標親本，獲得了粒長、長寬比和粒重均得到改良的株系。張劍霞［19］利用SF28標記將GS3長粒等位基因和Xa23聚合到珍汕97和II-32B中，獲得了粒長性狀得到改良的株系。因此，通過借助分子標記輔助選擇技術定向?qū)肓Ｐ驼{(diào)控基因，從而改變籽粒粒型，提高外觀品質(zhì)，是迅速改良品質(zhì)的行之有效的方法。

GS9是最新被克隆的控制水稻粒型的主效QTL，具有延長粒長、改良品質(zhì)、提高粒重的功能。通過分子標記輔助選擇和常規(guī)育種相結合的方式，將GS9定向?qū)肽繕擞H本，可顯著提高籽粒的粒長和長寬比，從而改良稻米的外觀品質(zhì)，因此該基因極具應用價值。本研究利用最新克隆的粒型主效基因GS9，采用IN0919標記輔助選擇技術，對水稻粒型進行了定向改良，延長了粒長，顯著增加了籽粒的長寬比，改良單株的粒型為中長粒型，長寬比約為2.0，與常規(guī)粳稻籽粒的長寬比（約為1.8）比較，改良效果顯著。但是由于GS3供體親本材料日本晴（NIL-gs9）的劍葉細長披散，穗型松散，因此，后代材料在株型、劍葉夾角、穗型等農(nóng)藝性狀方面與目前主流的選育目標差異較為顯著。擬在后續(xù)的改良過程中適當降低株高，提高籽粒的結實率，篩選株型更為緊湊的后代材料，以期能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)應用的目的。

4 展望

種子是農(nóng)業(yè)的“芯片”，育種水平和技術的迅速提升，以及特異性種質(zhì)資源的發(fā)掘與利用，為我國種質(zhì)持續(xù)創(chuàng)新提供了有力保障，也為我國的糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供了重要保障。伴隨著分子生物學的快速發(fā)展，一大批具有重要功能性狀的基因被發(fā)掘和利用，稻米品質(zhì)性狀的調(diào)控網(wǎng)絡也日趨清晰。目前分子標記輔助選擇與常規(guī)育種相結合的方法已成為江蘇水稻育種界采取的主要方法。但是常常是針對某一性狀開展定向改良，而水稻的一些性狀往往屬于綜合性狀，對單一基因的改良往往達不到預期目標。因此，未來應在綜合豐富的優(yōu)勢基因遺傳效應的基礎上，開展分子設計育種，對稻米的品質(zhì)性狀進行精準改良，從而實現(xiàn)外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)的同步提升。