潘佳靜， 梁焱惠， 張 敏， 劉小潔， 趙世林， 黃雙佳， 靳國(guó)鋒，*

(1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院/北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 湖北 武漢 430070)

細(xì)胞周期是細(xì)胞從一次分裂結(jié)束開始生長(zhǎng)到下一次分裂結(jié)束的過程，它分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)以及分裂期(M期)[1]。細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和衰老離不開細(xì)胞周期的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞周期相關(guān)的調(diào)控因子異常表達(dá)時(shí)，細(xì)胞周期會(huì)發(fā)生紊亂，細(xì)胞增殖失控，從而引起癌癥的發(fā)生[2]。肝細(xì)胞癌是全球第六大最常見的癌癥，也是癌癥導(dǎo)致死亡的第三大主要原因[3]。肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程是復(fù)雜的，肝臟持續(xù)的炎癥損傷，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、再生和纖維化沉積[4]。有研究表明，阻滯癌癥細(xì)胞周期，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]，故把細(xì)胞周期阻滯作為抗癌藥物的主要作用方式是目前的研究熱點(diǎn)之一。有研究者發(fā)現(xiàn)植物中的多糖、生物堿、黃酮和多肽以及動(dòng)物中一些活性蛋白質(zhì)和多肽等天然產(chǎn)物具有抗腫瘤的活性。如Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)花椒提取物可以誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞在G2/M期和S期阻滯，使肝癌細(xì)胞增殖受到抑制。阮之平等[7]研究發(fā)現(xiàn)蟾蜍活性多肽能夠影響周期調(diào)控因子的表達(dá)使結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G2/M期來抑制癌細(xì)胞的增殖。

皮蛋又稱變蛋、松花蛋、卞蛋，是中國(guó)特色傳統(tǒng)食品之一。它是以鮮蛋為原料，經(jīng)用氫氧化鈉(燒堿)、食鹽、茶葉(添加或不添加)、水等輔料和食品添加劑(含食品加工助劑硫酸銅等)配成的料液或料泥腌制、包裝等工藝制成的蛋制品。傳統(tǒng)的皮蛋制作工藝原料中含有氧化鉛，對(duì)人體有一定的毒性作用，但是早在2015年，國(guó)家就規(guī)定皮蛋一律采用無鉛工藝，在皮蛋生產(chǎn)過程中不可添加含鉛的物質(zhì)。

古時(shí)已有醫(yī)書記載，皮蛋具有一定的食療功效，《醫(yī)林篆要》記載皮蛋可“瀉肺熱、醒酒、去腸火、治瀉痢，能散、能斂。”，坊間也有用其治療咽喉痛、聲音嘶啞和便秘的傳聞。目前對(duì)皮蛋功能性的研究大多集中在其清熱和抗炎方面，對(duì)其作用機(jī)制已有整體上的了解。王淑珍[8]用堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶酶解皮蛋制備多肽，利用皮蛋多肽處理誘發(fā)炎癥的Caco- 2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)皮蛋多肽能降低細(xì)胞中的炎癥因子，達(dá)到抗炎的目的。Zhao等[9]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)皮蛋清模擬胃腸道消化物可以抑制IL- 8的分泌，降低TNF- α、IL- 6、IL- 1β、IFN- γ和IL- 17的表達(dá)，上調(diào)IL- 10等抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)來治療腸道炎癥。有研究進(jìn)一步探究了皮蛋蛋白源性多肽抗腸炎的作用途徑，發(fā)現(xiàn)皮蛋蛋白源性多肽通過MAPK信號(hào)途徑發(fā)揮其抗炎的作用，研究認(rèn)為，皮蛋清模擬胃腸道消化物中提取的DR- 10、DF- 9、ML- 7和MF- 7可以作為具有抗炎特性的化合物添加到保健食品中[10-11]。皮蛋胃腸道消化物已被證實(shí)可促進(jìn)人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco- 2細(xì)胞的凋亡[12]。

考慮到持續(xù)的炎癥反應(yīng)是肝癌的重要危險(xiǎn)因素之一，由此推測(cè)，皮蛋的胃腸道消化物可能通過調(diào)控細(xì)胞周期來抑制細(xì)胞增殖，從而對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用。但目前對(duì)于皮蛋的研究主要集中在加工方式、質(zhì)量安全及抗炎方面，而皮蛋發(fā)揮抗癌抗腫瘤功效的途徑與作用機(jī)制尚不清晰。本研究擬使用PESD處理人肝癌HepG2細(xì)胞，采用CCK- 8法研究HepG2細(xì)胞增殖情況，分析細(xì)胞存活率的變化，通過流式細(xì)胞術(shù)研究PI染色后的HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程，同時(shí)用western blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)，探究皮蛋模擬胃腸道消化物抑制人肝癌HepG2細(xì)胞活性的途徑及作用機(jī)制，旨在為皮蛋等傳統(tǒng)食品在抗癌抗腫瘤方面的合理應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皮蛋(來源于鴨蛋)，湖北神丹健康食品有限公司；人肝癌細(xì)胞(HepG2)，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

胃蛋白酶(3 000 U/mg)和胰蛋白酶(250 U/mg)，上海源葉生物有限公司；氯化氫、碳酸氫鈉、聚乙二醇辛基苯基醚(triton X- 100)、碘化丙啶(propidium iodide, PI)、無水乙醇(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、細(xì)胞裂解液(RIPA)、核糖核酸酶A(RNase A)、TBST緩沖液(pH=7.6)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK- 8試劑盒，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，美國(guó)HYCLONE公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、雙抗(10 000 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素)，北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；兔源細(xì)胞周期蛋白A(cyclin A)、兔源細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)、兔源細(xì)胞周期依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2, CDK2)、兔源毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變因子重組蛋白(ATM)、兔源細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2(checkpoint kinase 2, chk2)、兔源細(xì)胞分裂周期蛋白25A(cell division cyclin 25A, CDC25A)、鼠源β-actin抗體，美國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HPR)標(biāo)記山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗，美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

胰蛋白酶- EDTA溶液：將胰蛋白酶與EDTA溶于PBS溶液中，使胰蛋白酶和EDTA最終質(zhì)量濃度分別為2.5 g/L及0.2 g/L，4 ℃過夜后調(diào)節(jié)pH值至7.4，過濾除菌并于-20 ℃下保存；PI染液：將PI溶于含trition X- 100的PBS溶液(其中trition與PBS溶液的體積比為1∶1 000)中，使其終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，再加入RNase使其質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL，避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha1- 4LSC型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；85- 2型磁力攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；R301型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪高科儀器廠；DYY- 12型電泳儀，北京六一儀器廠；DYCZ- 24DN型垂直電泳槽，北京六一儀器廠；IX71型熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；DL- CJ- 2ND型超凈工作臺(tái)，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；HERAcell 1501型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Scientific公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；DYCA- 40型電轉(zhuǎn)儀，北京六一儀器廠；TS- 1型水平搖床，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；MμLtiskan MK3型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；Sigma3- 30N型冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；XHF- DY型高速分散器，中國(guó)寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1皮蛋模擬胃腸道消化物的制備

皮蛋模擬胃腸道消化物(preserved eggs simulated gastrointestinal digests，PESD)的制備方法如下。將皮蛋剝殼，用高速分散器將其打碎并置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干(-40 ℃，50 h，1.0 Pa)。取10 g凍干粉與100 mL蒸餾水于燒杯中混合均勻，常溫下將燒杯置于磁力攪拌器上(200 r/min，30 min)攪拌。用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0后加入0.125 g的胃蛋白酶，于37 ℃下水浴振蕩2 h完成模擬胃消化過程。將盛有溶液的燒杯置于磁力攪拌器上攪拌，用1 mol/L的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0后加入0.2 g的胰蛋白酶，37 ℃水浴振蕩2 h，模擬腸道消化的過程。將溶液放到沸水中滅酶15 min，冷卻后在4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，取上清液凍干，于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3.2HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)

將80 mL的α-MEM培養(yǎng)基，1 mL的雙抗和10 mL的FBS混合均勻，經(jīng)1 mol/L的碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4后，加入α-MEM培養(yǎng)基定容至100 mL，用0.45 μm膜過濾。將HepG2細(xì)胞接種于配置好的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后將其置于培養(yǎng)箱(溫度37 ℃、相對(duì)濕度95% 、CO2體積分?jǐn)?shù)5%)中進(jìn)行培養(yǎng)。

在熒光倒置顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞分布達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代。除去舊培養(yǎng)液，用PBS(pH=7.4)洗滌細(xì)胞兩次，加入1 mL配置好的胰蛋白酶- EDTA溶液(預(yù)先于37 ℃下水浴30 min)，混合均勻后放入培養(yǎng)箱(37 ℃)內(nèi)消化3 min。在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞飄起后加入2 mL的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入3 mL的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞重懸。分裝細(xì)胞并添加3 mL左右α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.3.3HepG2細(xì)胞存活率的測(cè)定

用CCK- 8法進(jìn)行HepG2細(xì)胞增殖分析，測(cè)定HepG2細(xì)胞存活率。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶- EDTA溶液消化細(xì)胞并用α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，在1 000 r/min下離心3 min，棄上清液，使細(xì)胞重懸。用α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至1×104個(gè)/mL后，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。用移液槍吸去舊α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置空白組(α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)和PESD實(shí)驗(yàn)組(含0、1、2、3、4、5 mg/mL PESD的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)，其中含0 mg/mL PESD的組別為對(duì)照組(經(jīng)體外模擬胃腸道消化，含α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞，不含PESD)，每組設(shè)置3個(gè)平行，每孔加入100 μL溶液，培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，用PBS(pH=7.4)洗滌兩次后加入含有CCK- 8的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液[V(α-MEM培養(yǎng)液)∶V(CCK- 8試劑)=9∶1]，每孔100 μL，培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)下列公式計(jì)算HepG2細(xì)胞的存活率。

細(xì)胞存活率=(AS-Ab)/(Ac-Ab)×100%

(1)

式(1)中：As為試驗(yàn)孔吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK- 8溶液和PESD溶液)；Ac為對(duì)照孔吸光度(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK- 8溶液，不含PESD)；Ab為空白吸光度(含培養(yǎng)基、CCK- 8溶液，不含細(xì)胞、PESD)。

1.3.4HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程的測(cè)定

采用PI染色標(biāo)記并通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶- EDTA溶液消化細(xì)胞并用α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，在1 000 r/min下離心3 min，棄上清液，使細(xì)胞重懸。用α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至5×105個(gè)/mL后，接種于6孔板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。用PBS(pH=7.4)洗滌細(xì)胞兩次，每孔加2 mL不同濃度(0、1、2、4 mg/mL)的PESD培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用移液槍吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入1 mL胰蛋白酶- EDTA溶液消化細(xì)胞，移至離心管中于1 000 r/min下離心5 min，用預(yù)冷的PBS(pH=7.4)洗滌沉淀兩次，加入同體積預(yù)冷的70%乙醇于-20 ℃固定。在1 500 r/min下離心5 min收集底部細(xì)胞，用1 mL的PBS(pH=7.4)洗滌細(xì)胞，加入500 μL的PI染液，于4 ℃避光30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用FL2- w和FL2- A通道顯示，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.3.5HepG2細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)量的測(cè)定

采用western bolt法檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)量。在熒光倒置顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)到80%時(shí)，用胰蛋白酶- EDTA溶液消化細(xì)胞后加入α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，在1 000 r/min下離心3 min，棄上清，使細(xì)胞重懸。用α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至5×105個(gè)/mL后，接種于6孔板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。按照設(shè)置的組別加入PESD(4 mg/mL)，對(duì)照組(0 mg/mL的PESD)加入等體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，加入含蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

吸取40 μg的蛋白進(jìn)行電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉的封閉液(TBST)中封閉2 h，稀釋后的一抗4 ℃封閉過夜，HPR標(biāo)記的二抗(以1∶5 000的體積比稀釋于pH=7.4的PBS中)37 ℃下孵育2 h，TBST洗滌PVDF膜5次。以1∶1的比例混合ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液，滴加至PVDF膜上，待熒光帶明顯后用濾紙吸去多余的液體，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次顯影、定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用Image-pro plus軟件分析膠片灰度值。

一抗為相應(yīng)的蛋白抗體：cyclin A(以1∶2 000的體積比稀釋于pH=7.4的PBS中，下同)、cyclin E(1∶2 000)、CDK2(1∶2 000)、ATM(1∶2 000)、chk2(1∶2 000)、CDC25A(1∶2 000)和β-actin(1∶5 000)抗體；二抗為HPR標(biāo)記的山羊抗兔二抗和HPR標(biāo)記山羊抗鼠二抗；以β-actin為內(nèi)參，用樣品與β-actin的灰度值之比來表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”來表示。使用鄧肯多重范圍檢驗(yàn)來比較平均值之間的差異；通過SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用Image-pro plus對(duì)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析；采用Origin8.5軟件繪制實(shí)驗(yàn)柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PESD對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的抑制作用

不同濃度的PESD處理HepG2細(xì)胞24 h后，用CCK- 8法進(jìn)行癌細(xì)胞增殖分析，其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用見圖1。在相同的處理時(shí)間下，相比于未加入PESD的對(duì)照組而言，PESD處理對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。且不同濃度的PESD對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響明顯不同，隨著PESD濃度增加，HepG2細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05)，呈劑量依賴關(guān)系。1 mg/mL的PESD處理后的癌細(xì)胞存活率相比于0 mg/mL的對(duì)照實(shí)驗(yàn)組降低了8.91%(P<0.05)。當(dāng)PESD濃度增加至2 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，即癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖被明顯抑制。當(dāng)PESD濃度為4 mg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率接近50%。通過回歸擬合分析得到PESD處理HepG2細(xì)胞24 h后IC50值為4.17 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PESD對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖有顯著抑制作用，且呈劑量依賴性的方式。

不同字母表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組研究結(jié)果之間的差異在P<0.05的檢驗(yàn)水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 PESD對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of PESD on survival rate of HepG2 cells

2.2 PESD對(duì)HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程的抑制作用

細(xì)胞增殖的過程中通常有細(xì)胞周期的調(diào)控參與。當(dāng)細(xì)胞周期運(yùn)行受到影響或干擾時(shí)，就會(huì)在相關(guān)因子的調(diào)控下暫?；蚪K止，進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以保證細(xì)胞周期的順利運(yùn)行[13]。為了研究PESD對(duì)細(xì)胞毒性作用機(jī)制是否與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的PESD處理了HepG2細(xì)胞后，用PI進(jìn)行染色標(biāo)記，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期。

不同濃度的PESD處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞周期占比的變化情況見圖2和圖3。隨著PESD濃度的增加，G0/G1期和G2/M期的HepG2細(xì)胞占比隨之減少，S期的細(xì)胞占比則顯著增加(P<0.05)。4 mg/mL的PESD處理細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，G0/G1期和G2/M期細(xì)胞百分比分別降低了19.43%和96.43%(P<0.05)，相反，S期細(xì)胞占比則從30.4%增加至52.33%(P<0.05)。由此可知，PESD誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞阻滯于S期。S期是細(xì)胞完成DNA復(fù)制以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)組裝的時(shí)期，可以影響細(xì)胞的增殖[14]。Ahmed等[15]的研究中，芥末籽的乙醇提取物誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞周期阻滯于S期和G2/M期。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)蟲草素可以使胰腺癌細(xì)胞阻滯于S期。因此推測(cè)，PESD可通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞于S期阻滯從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

圖2 PESD處理后HepG2細(xì)胞的流式細(xì)胞周期變化Fig.2 Changes of HepG2 cells cycle of flow cytometry assay after PESD treatment

*、**和***分別表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組研究結(jié)果之間的差異在P<0.05、P<0.01和P<0.001的檢驗(yàn)水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖3 PESD對(duì)HepG2細(xì)胞周期占比的影響Fig.3 Effect of PESD on cycle percentage of HepG2 cells

2.3 PESD對(duì)HepG2細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)量的影響

2.3.1對(duì)cyclin A、cyclin E和CDK2的影響

細(xì)胞周期受周期調(diào)控蛋白的影響，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期蛋白有九大類，分別是cyclin A～H以及T。細(xì)胞周期蛋白會(huì)隨著細(xì)胞周期進(jìn)程合成和降解，在相應(yīng)的時(shí)間達(dá)到活性峰值，特異性地與相應(yīng)的細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)結(jié)合，形成復(fù)合物，介導(dǎo)CDK激活參與細(xì)胞周期調(diào)控[17]。cyclin A是啟動(dòng)DNA復(fù)制所必需的，cyclin A- CDK2是細(xì)胞周期S期的最主要的復(fù)合物，主要參與S期DNA的復(fù)制，阻止已復(fù)制的DNA再次被復(fù)制，即保證S期的DNA只復(fù)制一次[18]。Cyclin E- CDK2復(fù)合物是調(diào)節(jié)細(xì)胞從G0/G1期轉(zhuǎn)變到S期的關(guān)鍵激酶復(fù)合物，能促使細(xì)胞跨過G1/S期限制點(diǎn)，調(diào)節(jié)DNA相關(guān)復(fù)制基因的表達(dá)，從而合成與DNA復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)[17,19]。為探究PESD誘導(dǎo)的S期阻滯的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了與S期阻滯相關(guān)的調(diào)控因子cyclin A、cyclin E和CDK2的表達(dá)。前期實(shí)驗(yàn)已得出PESD處理HepG2細(xì)胞24 h后的IC50值為4.17 mg/mL，故將實(shí)驗(yàn)分成兩組，用0和4 mg/mL的PESD處理HepG2細(xì)胞，用western blot法測(cè)定了細(xì)胞中控制細(xì)胞周期的相關(guān)因子cyclin A、cyclin E和CDK2的蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中cyclin A與cyclin E蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，而CDK2蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。Xie等[20]實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草乙醇提取物通過上調(diào)cyclin A 與cyclin E蛋白表達(dá)，下調(diào)CDK2蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在S期阻滯。Nani等[21]研究中也是通過cyclin E的上調(diào)和CDK2的下調(diào)來達(dá)到細(xì)胞周期于S期阻滯的目的。由此可推測(cè)，PESD通過上調(diào)cyclin A 與cyclin E蛋白的表達(dá)，下調(diào)CDK2蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的S期阻滯。

*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組研究結(jié)果之間的差異在P<0.05的檢驗(yàn)水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4 PESD對(duì)HepG2細(xì)胞中cyclin A、cyclin E和CDK2 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of PESD on expression of cyclin A, cyclin E and CDK2 proteins in HepG2 cells

2.3.2對(duì)ATM、chk2和CDC25A的影響

細(xì)胞周期阻滯還與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)控有關(guān)，G1/S檢查點(diǎn)是重要的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，確保DNA正常復(fù)制以及損傷修復(fù)。毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變基因(ataxia telangiectasia mutated gene,ATM基因)編碼產(chǎn)物- ATM蛋白激酶作為磷酸肌醇3激酶相關(guān)激酶家族的成員，涉及多個(gè)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，可以調(diào)控DNA損傷修復(fù)和凋亡，是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的關(guān)鍵激酶[22]。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2(checkpoint kinase 2, chk2)是ATM蛋白激酶的下游關(guān)鍵檢查點(diǎn)底物，可以通過調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)使分裂中的細(xì)胞阻滯在G2/M或S期[23]，而活化的ATM蛋白激酶又能使其磷酸化從而影響其激活與表達(dá)。細(xì)胞分裂周期蛋白25(cell division cyclin 25, CDC25)家族包含CDC25A、CDC25B及CDC25C這3種亞型，其中CDC25A是chk2的下游底物，可以激活CDK并與cyclin結(jié)合，形成復(fù)合物，從而促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化[24]，故ATM、chk2和CDC25A之間的聯(lián)系可以調(diào)控S期關(guān)卡。為進(jìn)一步探究PESD使HepG2細(xì)胞在S期阻滯的機(jī)制，本研究采用western blot法來測(cè)定HepG2細(xì)胞經(jīng)4 mg/mL 的PESD處理后，ATM、chk2和CDC25A在細(xì)胞中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)過4 mg/mL的PESD處理后，ATM、chk2和CDC25A蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05)。Li等[25]的報(bào)道中補(bǔ)骨脂酚(bakuchiol)可以上調(diào)ATM、chk2等蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞在S期阻滯。先前也有報(bào)道，低濃度的3-羥基三苯基林(3-hydroxyterphenyllin)可以通過增加人卵巢癌細(xì)胞中ATM、chk2和CDC25A的表達(dá)，來誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞S期周期阻滯[26]。Saiko等[27]研究發(fā)現(xiàn)一種白藜蘆醇的類似物同樣通過上調(diào)ATM、chk2和CDC25A蛋白的表達(dá)，激活A(yù)TM- chk2- CDC25A信號(hào)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞S期阻滯，抑制癌細(xì)胞的增殖。由此可推測(cè)，PESD可能通過ATM- chk2- CDC25A的途徑影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞在S期阻滯。

*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組研究結(jié)果之間的差異在P<0.05的檢驗(yàn)水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5 PESD對(duì)HepG2細(xì)胞中ATM、chk2和CDC25A蛋白 表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of PESD on expression of ATM, chk2 and CDC25A proteins in HepG2 cells

3 結(jié) 論

本研究通過CCK- 8法測(cè)定PESD對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行PI染色標(biāo)記后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析PESD對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響，又進(jìn)一步采用western blot法測(cè)定了細(xì)胞周期的調(diào)控蛋白表達(dá)，從而探究了PESD通過影響細(xì)胞周期來抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。

結(jié)果表明，PESD可以激活細(xì)胞周期G1/S檢查點(diǎn)相關(guān)激酶，通過ATM- chk2- CDC25A信號(hào)通路作用，上調(diào)cyclin A和cyclin E的表達(dá)，下調(diào)CDK2的表達(dá)使得HepG2細(xì)胞阻滯于S期，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，且以劑量依賴性的方式來抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，希望研究結(jié)果可為皮蛋作為抗癌功能性食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。但皮蛋模擬胃腸道消化物發(fā)揮其抗癌功效是否與其他信號(hào)通路存在協(xié)同或拮抗作用，對(duì)其他癌癥細(xì)胞活性是否有類似效果以及消化物中主要抗癌活性物質(zhì)的種類仍需進(jìn)一步研究。