高金秋，王剛強，林怡欣，龍麗君，陳子瑤

（白城師范學院 生命科學學院，吉林 白城137000）

0 引言

植物內(nèi)源激素對植物生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，但其含量極低.內(nèi)源激素測定技術對研究植物生命活動有重要意義［1-2］.植物內(nèi)源激素測定方法主要有生物測定法、理化測定法（色譜測定法和光譜測定法）和免疫檢測法（RIA 和ELISA）.生物測定法簡捷便利，但專一性差、靈敏度低；理化測定法專一性、靈敏度都要優(yōu)于生物測定法，但所用儀器昂貴，樣品處理復雜，操作人員技術要求高，花費時間長.近年來，隨著科技的進步，ELISA測定植物激素技術逐漸成熟，這方面的報道也逐漸增多［3-5］.

籽粒莧（Amaranthus hypochondriacusL.），又名千穗谷，是莧科（Amaranthaceae）莧屬（Amaranthus）一年生糧、飼、菜兼用型作物，其莖葉柔嫩，營養(yǎng)價值高，適口性好，纖維素含量低，是優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)飼料作物［6-7］；籽粒莧種子中礦物質(zhì)含量豐富，既富含大量鉀、鎂、鈉、鈣等元素，又富含微量鐵、鋅、錳、鉻、鎳、鈷、硒等元素.近年來，國內(nèi)關于籽粒莧栽培及功能研究逐漸增多［8-12］，但組織培養(yǎng)方面鮮見報道［13］.本研究通過酶標法比較籽粒莧不同器官內(nèi)源激素含量，為籽粒莧組織培養(yǎng)、品種選育、轉基因操作以及產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供技術支持和前期基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

籽粒莧內(nèi)源激素提取方案篩選以水浸24 h的R104籽粒莧種子為實驗材料；籽粒莧不同器官內(nèi)源激素測定以R104籽粒莧無菌苗為實驗材料.R104籽粒莧種子由白城師范學院劉淑芹副教授惠贈.

1.2 實驗試劑與藥品

瓊脂粉、乙醇、次氯酸鈉、石油醚、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、甲醇（色譜純）、氯化氫、氨水、三氯甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸、乙酸乙酯、氫氧化鈉、正丁醇、冰醋酸、植物激素ELISA檢測試劑盒（購于上海羽凡生物科技公司）等，以上所有試劑與藥品除特殊標注外均為分析純.

1.3 主要儀器設備

Spectra M2 多功能酶儀器（美國Molecular Devices 公司）、光照培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、TG-16臺式高速冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）等.

1.4 實驗方法

1.4.1 籽粒莧處理

1.4.1.1 水浸24 h籽粒莧種子處理

稱取0.5 g籽粒莧種子，放入50 mL 三角瓶內(nèi)，每瓶加蒸餾水10 mL，25 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，用濾紙把種子表面水分吸干，待用.

1.4.1.2 籽粒莧無菌苗制備方法

籽粒莧種子用70%酒精消毒1 min，無菌水沖洗1次，2%次氯酸鈉消毒15 min，無菌水沖洗3次后接種于MS培養(yǎng)基上，放在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng).培養(yǎng)溫度為23～27 ℃，光照16 h/d.14 d后在超凈工作臺內(nèi)切取胚根、胚軸、子葉、莖尖各1 g待用.

1.4.2 籽粒莧內(nèi)源激素提取方案

將1.4.1.1所得種子材料參考陳義、胡曉輝等文獻［14-18］，在不同溫度、鮮材料、干材料、石英砂研磨、玻璃勻漿器研磨和研缽研磨等不同參試因子處理下，設計14 個處理組，如表1 所示.依照表1 進行植物材料預處理與細胞破碎后，按照文獻［15］和文獻［16］等的操作方法進行植物激素液相萃取，按照文獻［17］和文獻［18］的操作方法進行植物激素固相萃取.萃取后得籽粒莧內(nèi)源玉米素（ZT）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、總細胞分裂素（CTK）和總生長素（GH）.

表1 籽粒莧內(nèi)源激素提取處理組合

植物激素粗提液制備方法：依照表1進行相應植物材料預處理與細胞破碎，加入濃度為30 mg/mL二乙基二硫代氨基甲酸鈉5 μL 和5 mL 80%甲醇（-20 ℃預冷），轉移至50 mL 離心管中，充分混勻后，4 ℃浸提24 h，1 000 g/min 4 ℃離心20 min，收集上清液.剩余沉淀加2 mL 80%甲醇（-20 ℃預冷），二次重復操作浸提、離心，收集上清液，棄去殘渣，合并上清液.上清液中含籽粒莧內(nèi)源ZT，ABA，GA，CTK和GH.

將14 個處理組（每組三次重復）所得籽粒莧內(nèi)源ZT，ABA，GA，CTK 和GH 按照植物ZT ELISA 試劑盒、植物ABA ELISA 試劑盒、植物GA ELISA 試劑盒、植物CTK ELISA 試劑盒和植物GH ELISA 試劑盒操作說明書，分別進行ELISA測定.

1.4.3 籽粒莧不同器官內(nèi)源激素的ELISA測定

用1.4.2 篩選出的最優(yōu)方案對籽粒莧無菌苗胚根、胚軸、子葉和莖尖進行內(nèi)源激素提取（三次重復）與ELISA測定.

2 結果分析

2.1 籽粒莧內(nèi)源激素提取方案確定

檢測1.4.2各處理下不同內(nèi)源激素含量，比較內(nèi)源激素得率及參試因子得率.

2.1.1 不同處理內(nèi)源激素得率

檢測1.4.2各處理組的各激素含量，統(tǒng)計其平均值繪制堆積柱形圖，如圖1所示.

圖1 實驗處理與激素含量關系

由圖1可知，3號組-80 ℃冷凍4 h，加石英砂研磨，粗提液方案內(nèi)源激素得率最高；4號組40 ℃烘干，加石英砂研磨，液相萃取方案內(nèi)源激素得率最低.

2.1.2 參試因子與激素含量關系

結合2.1.1 實驗結果，為進一步明晰各參試因子對籽粒莧內(nèi)源激素得率的貢獻，整理1.4.2 所得各參試因子單因素數(shù)據(jù)，繪制參試因子與激素含量關系圖，如圖2所示.

圖2 參試因子與激素含量關系

由圖2可知，鮮材料直接提取得率高于其他處理組；石英砂研磨細胞破碎法得率略高于研缽研磨處理；激素提取方式中粗提液檢測效果要優(yōu)于液相萃取和固相萃取.由此得出，籽粒莧內(nèi)源激素的提取最佳方案為：鮮材料，石英砂研磨破碎細胞，制備粗提液用于ELISA檢測.

2.2 籽粒莧不同器官內(nèi)源激素含量的比較

籽粒莧無菌苗胚根、胚軸、子葉和莖尖用石英砂研磨，制備粗提液，ELISA測定其內(nèi)源ZT，ABA，GA，CTK和GH含量，并進行比較.

2.2.1 不同器官ZT含量

ZT 含量檢測結果如圖3所示.由圖3可知，各器官ZT 含量值莖尖＞胚根＞子葉＞胚軸.籽粒莧不同器官ZT 含量差異較大，其中以莖尖含量最高，可達40.43 pg/g，胚軸含量最低，為0.1 pg/g.子葉與胚根兩器官相差最小，為1倍左右；莖尖ZT含量與胚軸、子葉或胚根ZT含量相差較大，是他們的5～400倍.

圖3 籽粒莧各器官ZT含量

2.2.2 不同器官ABA含量

ABA 含量檢測結果如圖4 所示.由圖4 可知，各器官ABA 含量值莖尖＞子葉＞胚根＞胚軸.籽粒莧ABA 含量最高器官為莖尖，可達302.85 ng/g，胚軸含量最低，低至2.44 ng/g.各器官ABA 含量相差較大，莖尖ABA含量是胚軸、胚根和子葉含量的46～124 倍.

圖4 籽粒莧各器官ABA含量

2.2.3 不同器官GA含量

GA 含量檢測結果如圖5 所示.由圖5 可知，各器官GA 含量值莖尖＞子葉＞胚軸＞胚根.籽粒莧GA含量最高器官為莖尖，可達12.388×103nmol/g，胚根含量最低，為0.5 nmol/g.各器官GA含量相差最大，莖尖GA含量是胚根、胚軸和子葉含量的82～25 000倍.

圖5 籽粒莧各器官GA含量

2.2.4 不同器官CTK含量

CTK 含量檢測結果如圖6 所示.由圖6 可知，各器官CTK 含量值莖尖＞子葉＞胚根＞胚軸.籽粒莧CTK含量最高器官為莖尖，可達155.48 ng/g，胚軸含量最低，低至6.61 ng/g.胚根、胚軸與子葉CTK含量差別不大，莖尖CTK含量是子葉、胚軸或胚根含量的14～24倍.

圖6 籽粒莧各器官CTK含量

2.2.5 不同器官GH含量

GH 含量檢測結果如圖7 所示.由圖7 可知，各器官GH 含量值莖尖＞子葉＞胚根＞胚軸.籽粒莧不同器官GH 含量差異較大，其中以莖尖含量最高，可達3.708 1×103pg/g，胚軸含量最低，為179.88 pg/g.胚根與胚軸相差最小，子葉與胚根、胚軸相差稍大，莖尖與胚根、胚軸、子葉相差最大，各器官GH 相差倍數(shù)在13～19倍之間.

圖7 籽粒莧各器官GH含量

2.3 內(nèi)源激素比值與籽粒莧各器官的關系

內(nèi)源激素比值與籽粒莧各器官關系如圖8所示.由圖8可知，各激素比值除ABA/GH 最高為莖尖外，其他幾組比值皆是胚根最高；ABA/GA，ZT/GA 和CTK/GA 都是莖尖最低；ABA/GH，ZT/GH 和CTK/GH 都是胚軸最低.這也從另一個側面證明，莖尖旺盛生長能進行芽的分化與其有超高濃度的GA 有關，胚根盡管也生長旺盛，但不進行芽的分化，各激素比值都與莖尖相反.

圖8 內(nèi)源激素比值與籽粒莧各器官關系

3 討論

植物內(nèi)源激素提取方法較多，多在比較單一提取方式下研究參試因子之間相互關系，本研究中涉及提取方法相互間比較的研究還未見報道.鮮材料制備激素檢測效果好，可能與激素易對環(huán)境條件產(chǎn)生反應、性質(zhì)不穩(wěn)定有關；添加助研物的檢測效果要優(yōu)于不添加助研物，其原因是助研物使細胞研磨更充分，有利于內(nèi)源激素的釋放；玻璃勻漿器研磨檢測效果劣于直接研磨，其原因可能是研磨過程中產(chǎn)熱，玻璃勻漿器沒有研缽易于散發(fā)；粗提液要優(yōu)于固相萃取與液相萃取，其原因可能是固相、液相萃取過程繁瑣，損失所致.

植物各分化器官的形成是內(nèi)源激素調(diào)控的結果［19］.莖尖ZT 含量最多可能與其進行芽的分化有關，而胚軸不進行芽分化故而含量較少.子葉與胚根雖然也不進行芽的分化，但生長方向縱橫，類似芽分化，故而含量多于胚軸少于莖尖.ABA 的生理功能是能引起芽休眠、葉子脫落和抑制細胞生長等［20］.莖尖ABA 含量過多可能發(fā)揮其抑制細胞生長作用，以利于代謝物質(zhì)累積，一旦其作用被GA 拮抗，則促進芽的分化.GA的主要作用是促進細胞伸長、分裂，側芽休眠，莖尖含量最多，與其生長速度高于其他器官的特性相一致；從生長速度來看，子葉的生長速度要高于胚軸、胚根，所以子葉GA 含量也高于胚軸、胚根.CTK 的生理作用主要是引起細胞分裂，誘導芽的形成和促進芽的生長.莖尖CTK 含量最高與其進行芽的分化生長特性相吻合.GH有促進細胞分裂，抑制花朵脫落和側芽生長與葉片衰老的能力，這與莖尖旺盛生長具有頂端優(yōu)勢特性相符合.子葉生長較旺盛，胚軸、胚根長勢低于子葉、莖尖，所以子葉GH 含量低于莖尖，高于胚軸、胚根.

植物各器官的分化與內(nèi)源激素比值相關.CTK/GH比值高，有利于促進芽的分化，比值低有利于根的分化［21］.本研究所得各激素比值中胚根、莖尖處于兩個極端最多.除ABA/GH外，以ABA，ZT，CTK為分子的比值都是胚根高，說明植物在根系生長過程中，雖然這幾個激素需要量少，但比值要高，這與未曉?。?2］的研究結果根中ABA 含量多于葉中相一致；GA 做分母的幾個比值都是莖尖最低，說明植物在進行芽分化過程中需要高濃度的GA.

4 結論

本實驗結果表明用石英砂研磨破碎籽粒莧鮮材料細胞后制備粗提液的ELISA 檢測效果最佳.本方法優(yōu)于-80 ℃處理鮮材料或40 ℃烘干鮮材料，也優(yōu)于用研缽研磨或玻璃勻漿器研磨后的固相萃取或液相萃取方法.用最佳方法測定14 d籽粒莧無菌苗胚根、胚軸、子葉與莖尖的各激素含量，莖尖各激素含量最多，胚軸的ABA，CTK 與GH 含量最少，子葉激素含量都高于胚軸.籽粒莧各器官內(nèi)源激素ABA，CTK與GH 的含量從高到低順序都是莖尖、子葉、胚根與胚軸；各器官內(nèi)源激素中GA 相差倍數(shù)較大、CTK 和GH相差倍數(shù)都較小；用GA做分母的各激素比值都是莖尖最低.

通過本研究，推測對籽粒莧進行離體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中適量添加GA 要好于不添加，說明植物在進行芽分化過程中需要高濃度的GA.