孫洪玲，雷 培，劉 碩，劉佳琪，董 坤，董 暢，張亞茹，孟凡娟*

（1 東北林業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，哈爾濱 150040；2 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150030；3 西昌學(xué)院，四川西昌 615000）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta[Sieb.et Zucc.]Planch.ex Miq.）屬于獼猴桃科獼猴桃屬植物，為大型落葉藤本植物，分布廣闊，從我國(guó)北方的黑龍江至南方的廣西，廣大山區(qū)均有分布，生態(tài)類型多樣。其果實(shí)鮮美，表皮無毛，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。不同的環(huán)境條件對(duì)其生長(zhǎng)的影響較大。尤其黑龍江地區(qū)，溫度變化較大，直接導(dǎo)致栽培型軟棗獼猴桃的植株受害。因此，了解軟棗獼猴桃對(duì)溫度變化的應(yīng)答機(jī)制較為重要，但此類研究卻較少。當(dāng)前對(duì)軟棗獼猴桃的低溫脅迫研究主要集中在種質(zhì)資源及新品種選育、果實(shí)、抗寒基因的篩選與鑒定，以及抗寒機(jī)制的研究等方面。國(guó)內(nèi)對(duì)主要分布在遼寧、吉林、北京及黑龍江等地的軟棗獼猴桃進(jìn)行低溫脅迫研究。同時(shí)，目前有關(guān)研究也主要集中于某一時(shí)間點(diǎn)或者某一固定溫度對(duì)軟棗獼猴桃生長(zhǎng)的影響。但是室內(nèi)外的條件不一致，通常室外的條件變化較大，然而在室內(nèi)外不同時(shí)間、 不同溫度條件下研究軟棗獼猴桃對(duì)環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制更接近生產(chǎn)實(shí)際。鑒于此，本研究選擇我國(guó)東北地區(qū)哈爾濱軟棗獼猴桃的主要起源地，針對(duì)該地區(qū)11月溫度變化較為劇烈的現(xiàn)象展開研究。這個(gè)季節(jié)主要表現(xiàn)為氣候多變，降溫急劇，且溫度日變化劇烈；另外，此時(shí)還存在0 ℃左右波動(dòng)的日變化特點(diǎn)，有利于我們對(duì)頻繁的溫度變化與軟棗獼猴桃植株生長(zhǎng)之間關(guān)系的研究提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年11月在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院軟棗獼猴桃試驗(yàn)站進(jìn)行，軟棗獼猴桃栽培品種為‘魁綠’‘龍城二號(hào)’‘豐綠’，均為人工培育的品種。栽培方式為溫室和露地，溫室選取‘魁綠’和‘龍城二號(hào)’，露地選取‘魁綠’和‘豐綠’，均選一年生枝條進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.1.1 溫度及濕度

將溫度計(jì)、 濕度計(jì)固定在溫室和露地可有效測(cè)定的地點(diǎn)，選取一天中的7:00、12:00、16:00 記錄溫度和濕度。

1.1.2 組織化學(xué)染色

染色方法參照雷培的方法并做部分修改。使用四唑氮藍(lán)（NBT）和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）對(duì)超氧陰離子（O）和過氧化氫（HO）進(jìn)行組織化學(xué)染色。采集不同時(shí)期的軟棗獼猴桃莖段，分別浸在0.5 mg·mLNBT 溶液和0.5 mg·mLDAB 溶液中，并用錫箔紙包裹避光放置6 h，將染色好的莖段用95%乙醇80 ℃漂洗直至完全去除葉綠素，其間更換乙醇，最后用乳酸∶苯酚∶水（1∶1∶1，v/v）固定，觀察和拍照。

1.1.3 丙二醛（MDA）、可溶性糖、脯氨酸（Pro）含量和水勢(shì)的測(cè)定

丙二醛（MDA）測(cè)定方法采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量測(cè)定采用硫酸蒽酮法；游離脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定采用茚三酮比色法；水勢(shì)利用TPPW-Ⅱ植物水勢(shì)儀對(duì)軟棗獼猴桃枝條進(jìn)行測(cè)定。

1.2 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理，利用Graphpad Prism 6 制圖，采用SPSS 16.0 進(jìn)行相關(guān)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫、濕度的變化

從表1可以看出，在11月這幾個(gè)時(shí)間段，7:00露地和溫室的最低溫度均出現(xiàn)在11月10日，分別為-10°C 和1.6°C； 露地和溫室的最高濕度均出現(xiàn)在11月13日，分別為82%和81%。12:00，露地和溫室的最低溫度均出現(xiàn)在11月10日，分別為1°C 和11°C；露地的最高濕度出現(xiàn)在11月15日，為46%，溫室的最高濕度出現(xiàn)在11月10日，為72%。16:00，露地的最低溫度出現(xiàn)在11月2日，為-3°C ，溫室的最低溫度出現(xiàn)在11月2日和11月10日，均為9°C；露地最高濕度出現(xiàn)在11月2日，為58%，溫室最高濕度出現(xiàn)在11月10日，為82%。綜上所述，11月10日，露地和溫室的溫度最低。除11月13日7:00 外，露地濕度均低于溫室濕度，且顯著差異。11月，溫室的最低溫度均在0°C 以上，最高溫度可達(dá)33.1°C，且溫室的濕度和露地濕度差異明顯。因此，本試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)不同種植地點(diǎn)對(duì)軟棗獼猴桃枝條的影響特點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定分析。

表1 11月的溫、濕度變化

2.2 氧化程度

圖1中DAB染色結(jié)果顯示，11月7日各品種的染色程度明顯比后面3個(gè)時(shí)間淺；11月10日和11月13日的12:00，每個(gè)品種較7:00和16:00的染色效果明顯，且11月10日的染色程度更深；11月15日的7:00和16:00，每個(gè)品種的DAB染色程度明顯比前3個(gè)時(shí)間深；11月15日露地‘魁綠’的染色程度低于溫室‘魁綠’。

圖1中NBT 染色結(jié)果顯示，11月15日，各品種的NBT 染色程度高于前3 個(gè)時(shí)間，與DAB 染色結(jié)果一致。而露地‘魁綠’的NBT 染色程度均高于溫室‘魁綠’，說明露地溫濕度導(dǎo)致植株產(chǎn)生更多的活性氧（ROS）。從NBT 染色可以看出，枝條已經(jīng)出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，露地‘魁綠’的褐變現(xiàn)象比溫室嚴(yán)重，且11月15日最為嚴(yán)重。

圖1 枝條DAB 和NBT 的染色

2.3 MDA 的變化

由圖2可知，11月2日，MDA 含量達(dá)到最高值，此時(shí)的最低溫度為-2°C。露地‘豐綠’MDA 含量最高，為4.54 μmol·gFW，且露地‘魁綠’MDA 含量高于溫室，溫室中MDA 含量變化不明顯。11月7日，各品種MDA含量均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。7:00，溫室溫、濕度分別為4.4°C 和73%，其中‘龍城二號(hào)’MDA 含量具有最大值，為2.26 μmol·gFW，且溫室‘魁綠’MDA 含量高于露地‘魁綠’。12:00 和16:00，露地‘豐綠’MDA 含量具有最大值，分別為2.197 μmol·gFW 和2.18 μmol·gFW，且露地‘魁綠’MDA 含量高于溫室‘魁綠’。

圖2 枝條MDA 含量變化

11月10日，溫、濕度差異顯著，露地‘魁綠’、溫室‘魁綠’‘龍城二號(hào)’均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，露地‘豐綠’呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)。16:00，露地‘豐綠’MDA 含量較高，為2.26 μmol·gFW；溫室出現(xiàn)最低溫度9°C，其中‘龍城二號(hào)’MDA 含量較高，為2.13 μmol·gFW。11月13日7:00，露地‘魁綠’和溫室‘龍城二號(hào)’均出現(xiàn)最大值，分別為1.8、2.0 μmol·gFW，此時(shí)濕度差異不顯著。11月15日，露地‘魁綠’、溫室‘魁綠’‘龍城二號(hào)’MDA 含量最大值均出現(xiàn)在16:00，分別為1.83、1.93、2.25 μmol·gFW。7:00 露地‘豐綠’出現(xiàn)最大值，為1.83 μmol·gFW。綜上所述，11月7—15日，露地‘魁綠’MDA 含量低于‘豐綠’，溫室‘魁綠’MDA 含量低于‘龍城二號(hào)’。

2.4 水勢(shì)的變化

由圖3可以看出，隨著脅迫時(shí)間增加，各品種的水勢(shì)7:00 呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)，說明水勢(shì)與溫、濕度具有較大相關(guān)性。11月7日7:00，各品種出現(xiàn)水勢(shì)最低值，但差異不顯著。露地‘魁綠’‘豐綠’、溫室‘魁綠’‘龍城二號(hào)’的水勢(shì)值分別為-3.30、-3.57、-3.64、-3.81 MPa。從11月2—13日，各品種的水勢(shì)值差異不顯著。僅11月15日，各品種的水勢(shì)值差異顯著，此時(shí)的水勢(shì)值分別為-2.70、-2.93、-2.21、-3.44 MPa。16:00，各品種的水勢(shì)值逐漸降低，與溫度密切相關(guān)。從11月10日開始，水勢(shì)下降明顯，水勢(shì)值均在-3.5 MPa 左右波動(dòng)，此時(shí)露地和溫室溫度分別為0°C 和9°C，濕度分別為38%和82%。11月2—7日，露地‘魁綠’的水勢(shì)值高于溫室‘魁綠’；而11月10—15日，露地‘魁綠’的水勢(shì)值低于溫室‘魁綠’。由此看出，11月10日之后的溫濕度變化對(duì)植株水勢(shì)影響明顯。

圖3 枝條水勢(shì)變化趨勢(shì)

2.5 可溶性糖和脯氨酸的變化

由圖4可知，隨著脅迫時(shí)間增加，可溶性糖含量呈現(xiàn)先降低后上升再下降趨勢(shì)，這與溫度密切相關(guān)。除11月2日外，露地‘魁綠’的可溶性糖含量均高于溫室‘魁綠’。11月10日，各品種呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，露地‘魁綠’和溫室‘龍城二號(hào)’16:00 出現(xiàn)最大值，分別為19.29、13.68 mg·g；露地‘豐綠’和溫室‘魁綠’7:00 出現(xiàn)最大值，分別為18.16 、14.41 mg·g。經(jīng)過11月10日的最低溫度和最高濕度脅迫后，各品種的可溶性糖含量在11月13日7:00 出現(xiàn)最大值，分別為30.06、26.71、20.76、25.36 mg·g。與11月13日數(shù)據(jù)相比，11月15日露地軟棗獼猴桃的可溶性糖含量降低，此時(shí)的溫度相對(duì)較低、濕度相對(duì)較高。

圖4 枝條可溶性糖含量變化

由圖5可以看出，隨著脅迫時(shí)間增加，溫室‘魁綠’脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，露地‘魁綠’脯氨酸含量變化不明顯。11月7日，露地‘魁綠’‘豐綠’脯氨酸含量無明顯差異；溫室‘魁綠’‘龍城二號(hào)’脯氨酸含量達(dá)到最大值，分別為0.90、0.80 μg·gFW。11月10日，各品種的脯氨酸含量差異不顯著，露地‘魁綠’脯氨酸含量均高于溫室‘魁綠’。其中12:00，露地‘豐綠’含量最低，為0.06 μg·gFW，此時(shí)露地和溫室最低溫度分別為-10°C 和1.6°C，最高濕度均為82%。11月7日后，各品種的脯氨酸含量差異不顯著。

圖5 枝條脯氨酸含量變化

3 討論

本文選取溫度在0 ℃上下波動(dòng)的日期，通過不同環(huán)境對(duì)不同軟棗獼猴桃品種的影響，記錄其DAB 和NBT 染色情況，以及MDA、水勢(shì)、可溶性糖及脯氨酸含量的變化，為探究溫、濕度變化對(duì)不同軟棗獼猴桃品種的影響，以及是否主要受溫度影響提供理論依據(jù)。

植物在受到低溫脅迫后，最直觀的表現(xiàn)就是形態(tài)變化，生理生化方面的改變。在本試驗(yàn)中溫濕度對(duì)植物的生理指標(biāo)影響較大，且溫度較低時(shí)更加明顯。當(dāng)植株遭受最初的低溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)開始生成大量的有害物質(zhì)MDA，利用可溶性糖和脯氨酸等起保護(hù)作用的物質(zhì)來抵御低溫脅迫；之后其生成的MDA、可溶性糖和脯氨酸含量均有所下降。說明溫濕度對(duì)植株進(jìn)行冷馴化，使其具有耐受性。林苗苗指出，軟棗獼猴桃在低溫脅迫過程中，MDA 出現(xiàn)累積現(xiàn)象，但是可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)會(huì)起到不同程度的保護(hù)作用。軟棗獼猴桃在越冬過程中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) （其中包括可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸）含量升高，但抗寒性不同的軟棗獼猴桃，其滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量也存在明顯差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時(shí)間的增加，16:00 軟棗獼猴桃各品種的染色程度普遍濃于7:00 和12:00，說明16:00 較7:00 和12:00 對(duì)軟棗獼猴桃枝條傷害大。露地‘魁綠’NBT 染色程度都要高于溫室，說明露地溫、濕度對(duì)植物的脅迫傷害高于溫室，主要受溫度影響較大。低溫脅迫條件下，植物枝條的皮層、韌皮部、木質(zhì)部和形成層會(huì)失水，導(dǎo)致枝條內(nèi)部發(fā)生褐變現(xiàn)象。因此，可以根據(jù)枝條的褐變程度判斷植物的抗寒性強(qiáng)弱。鐘海霞指出，多年生枝條的抗寒性強(qiáng)于一年生枝條，但在低溫脅迫嚴(yán)重時(shí)多年生枝條也會(huì)出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。從NBT 染色中可以看出，枝條已經(jīng)出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，說明枝條遭受低溫脅迫，但露地‘魁綠’的褐變現(xiàn)象比溫室‘魁綠’的嚴(yán)重，說明露地的低溫脅迫更嚴(yán)重，且在11月15日尤為嚴(yán)重。

MDA 為過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，可用來表現(xiàn)植物的損傷程度。11月2日的MDA 含量達(dá)到最高值，溫室‘魁綠’和‘龍城二號(hào)’的MDA 含量變化不明顯，說明溫室溫、濕度對(duì)品種的影響不顯著。11月7—15日，露地‘魁綠’的MDA 含量低于‘豐綠’，溫室‘魁綠’的MDA 含量低于‘龍城二號(hào)’，表明‘魁綠’具有較強(qiáng)的耐寒性。7:00和16:00，每個(gè)品種的MDA 含量升高，此時(shí)對(duì)軟棗獼猴桃的傷害最大，說明MDA 含量與溫度呈負(fù)相關(guān)。

經(jīng)過11月10日的最低溫和最高濕度脅迫后，水勢(shì)具有明顯的下降趨勢(shì)，脯氨酸含量變化不明顯，MDA和可溶性糖含量從11月13日開始呈上升趨勢(shì)。嚴(yán)岳華指出，當(dāng)溫度降低時(shí)，會(huì)直接或者間接地對(duì)植物造成水分脅迫，使細(xì)胞脫水，膜系統(tǒng)受害，透性加大，滲透勢(shì)降低，水勢(shì)也降低。該結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果相近。當(dāng)植株受到逆境脅迫時(shí)，通過可溶性糖的滲透調(diào)節(jié)作用來抵抗逆境脅迫。在本研究中，隨著脅迫時(shí)間增加，可溶性糖含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說明溫、濕度對(duì)軟棗獼猴桃影響較大。脯氨酸在植物抗逆境脅迫中起著多重作用，可作為滲透調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的穩(wěn)定劑。植物受脅迫后合成親水的脯氨酸，以維持細(xì)胞膨脹狀態(tài)。脯氨酸含量逐漸增加。在本研究中，11月7日，溫室 ‘魁綠’和‘龍城二號(hào)’脯氨酸含量達(dá)到最大值，說明在一定的溫、濕度范圍內(nèi)，溫、濕度有利于溫室品種的脯氨酸積累。

4 結(jié)論

露地條件下，適當(dāng)?shù)牡蜏卦谝欢ǔ潭壬峡梢蕴岣哕洍棲J猴桃的耐寒性。隨著低溫脅迫的增加，DAB 和NBT 染色程度加深，MDA（丙二醛）、可溶性糖和脯氨酸呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，水勢(shì)呈下降趨勢(shì)。在本研究中，露地的溫、濕度對(duì)軟棗獼猴桃生長(zhǎng)影響較大，可溶性糖和脯氨酸在不同程度上起到保護(hù)作用，導(dǎo)致露地軟棗獼猴桃在一定程度上對(duì)低溫的抵御性更強(qiáng)。