馬清艷，劉曉飛，侯莉莉，丁 微，侯永華

(河北省胸科醫(yī)院 1.結(jié)核四科；2.結(jié)核五科；3.內(nèi)分泌科,河北 石家莊050041)

我國(guó)是結(jié)核病的高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，耐藥肺結(jié)核病人治療極其困難，目前世界上仍缺乏敏感性藥物[1]。然而耐多藥肺結(jié)核病人的治療周期長(zhǎng)達(dá)18-24個(gè)月，嚴(yán)重者治療周期達(dá)3年以上，且只有約一半的患者被治愈[2-3]，耐藥肺結(jié)核已成為我國(guó)乃至世界各國(guó)結(jié)核病防治工作的難題。報(bào)道顯示[4-5]，參與肺結(jié)核病耐藥相關(guān)基因較多，而單核細(xì)胞P糖蛋白(Pgp)與多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)等基因在耐藥性中發(fā)揮重要影響。因此，本研究進(jìn)一步探討了Pgp、MRP在肺結(jié)核病中的表達(dá)情況，分析其與多藥耐藥的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選自2019年1月-2020年10月于河北省胸科醫(yī)院就診的肺結(jié)核患者144例，其中耐藥組92例，初治結(jié)核病組52例。男82例，女62例，年齡18-64歲，平均年齡(43.5±5.8)歲，病史1-8年，平均(3.7±1.1)年。同時(shí)健康體檢者50例為對(duì)照組，男28例，女22例，年齡18-65歲，平均年齡(42.4±5.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①近8周內(nèi)痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)呈陽(yáng)性(耐藥者藥敏試驗(yàn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的耐多藥肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn))；②CT檢查提示肺結(jié)核病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?gòu)V泛耐藥的肺結(jié)核病患者；③合并嚴(yán)重心、肝、腎功能異常者；④認(rèn)知功能障礙、孕期或哺乳期女性。兩組在性別、年齡等資料方面組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》中的相關(guān)要求，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1試劑與儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)、Real-time PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海耕欣生物科技有限公司)。PCR儀(ABI7500型)(美國(guó)ABI公司)，恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器廠(chǎng))，核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó)eppendorf公司)。

1.2.2提取樣本RNA 收集研究對(duì)象空腹 8 h 的肘靜脈血 6 ml 于 EDTA 抗凝管中。所有 EDTA 抗凝管收集的全血，采用Trizol法提取樣本總RNA。以260 nm為波長(zhǎng)，加入2 μl樣品，采用核酸定量?jī)x測(cè)定OD260和OD280，調(diào)整樣品體積使得OD260和OD280比值在1.8-2.1之間。

1.2.3目的基因mRNA表達(dá)量檢測(cè) ①將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA：將需要的RNA樣品和反轉(zhuǎn)錄試劑混合均勻。于0.2 ml EP管中加入1 μg模板總RNA、1 μl rand promers、1μl oligo(dT)15 primers，補(bǔ)Nuclease-Free water至10 μl。將EP管置入PCR擴(kuò)增儀中，70℃處理5 min，處理后再次將EP管置入PCR儀中進(jìn)行25℃(5 min)、42℃(60 min)、70℃(15 min)反轉(zhuǎn)錄，獲取產(chǎn)物cDNA。②cDNA擴(kuò)增：以合成的cDNA為模板，按8Strip Caps進(jìn)行基因擴(kuò)增。將體系管置于PCR儀中，反應(yīng)條件95℃預(yù)變性(10 min)、95℃(15 s)，60℃(1 min)為反應(yīng)條件循環(huán)40次。采用ABI7500軟件調(diào)整基線(xiàn)和閾值，每個(gè)上樣孔設(shè)2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，讀取ct值。目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Pgp、MRP在肺結(jié)核病中的表達(dá)

Pgp、MRP在肺結(jié)核病組表達(dá)量及陽(yáng)性率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 Pgp、MRP在肺結(jié)核病中的表達(dá)

2.2 Pgp、MRP在肺結(jié)核病耐藥組與初治結(jié)核病組中的表達(dá)

耐藥組Pgp、MRP表達(dá)量及陽(yáng)性率均高于初治結(jié)核病組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、表3。

表2 Pgp在肺結(jié)核病兩組中的表達(dá)

表3 MRP在肺結(jié)核病兩組中的表達(dá)

2.3 耐藥影響因素的單因素及多因素分析

單因素分析顯示，耐藥組與結(jié)核病組在年齡、性別、居住地、職業(yè)、是否有糖尿病及治療時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。多因素分析顯示，以患者耐藥作為自變量，單因素及Pgp、MRP表達(dá)量作為因變量進(jìn)行非條件Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示年齡、居住地、Pgp、MRP表達(dá)量是肺結(jié)核病患者耐藥的主要影響因素。見(jiàn)表5。

表4 耐藥影響因素的單因素分析

表5 耐藥影響因素的多因素分析

3 討論

2018年WHO發(fā)布的全球結(jié)核病報(bào)告結(jié)果中，2017年全球新發(fā)結(jié)核病者1000萬(wàn)，耐利福平和耐多藥者56萬(wàn)[6-7]。耐藥結(jié)核病治療周期長(zhǎng)、花費(fèi)大，且治愈率低、病亡率高。因此，耐藥結(jié)核病的預(yù)防和控制已成為世界慢性病防治的關(guān)注重點(diǎn)。目前，耐藥結(jié)核病的臨床治療主要通過(guò)患者用藥史及藥敏試驗(yàn)選擇耐受性好、安全性高的二線(xiàn)藥物或療效不明確藥物，未能達(dá)到滿(mǎn)意的治療效果[8]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)顯示[9-10]，初治的結(jié)核病患者約50%-60%的患者多發(fā)生耐藥，醫(yī)療花費(fèi)大，導(dǎo)致患者負(fù)擔(dān)增加，醫(yī)療資源浪費(fèi)。因此，應(yīng)強(qiáng)化對(duì)于肺結(jié)核病耐藥機(jī)制的研究，提高治療有效率，改善預(yù)后。

肺結(jié)核病耐藥機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，而Pgp和MRP是近年來(lái)受廣泛關(guān)注的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MRP是位于細(xì)胞膜上的能量依賴(lài)的溢出泵，能夠?qū)⑦M(jìn)入肺部細(xì)胞內(nèi)的多種藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致多藥耐藥[11-13]。Pgp是由MRP編碼產(chǎn)生，也位于細(xì)胞膜上的能量依賴(lài)溢出泵，同樣可以把細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，使肺細(xì)胞耐藥。本研究顯示，Pgp、MRP在肺結(jié)核病組表達(dá)量及陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P<0.05)。同時(shí)耐藥組Pgp、MRP表達(dá)量及陽(yáng)性率均高于初治結(jié)核病組(P<0.05)。表明Pgp、MRP可能參與了肺結(jié)核病及耐藥性的發(fā)生。何飛歌等[4]報(bào)道顯示，耐多藥肺結(jié)核患者血清Pgp蛋白表達(dá)上調(diào)，而通過(guò)利奈唑胺治療后，血清Pgp蛋白表達(dá)下降，這也說(shuō)明血清Pgp蛋白與肺結(jié)核耐藥相關(guān)。分析可能是由于血清Pgp蛋白表達(dá)陽(yáng)性，可通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸方式將親脂疏水類(lèi)抗菌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外而發(fā)生耐藥[14]。有研究表明[15]，Pgp 的表達(dá)水平與細(xì)胞耐藥性呈正相關(guān)。MRP蛋白能夠刺激細(xì)胞DNA調(diào)控因子或轉(zhuǎn)錄因子的激活，以及通過(guò)配體結(jié)合的信號(hào)通路機(jī)制，促進(jìn)囊泡的釋放，并增強(qiáng)囊泡包裹肺細(xì)胞內(nèi)藥物的能力，促進(jìn)藥物的排出。

在探討不同的臨床特征對(duì)肺結(jié)核病患者耐藥的影響過(guò)程中初步發(fā)現(xiàn)，年齡、農(nóng)村、Pgp、MRP表達(dá)量是影響多藥耐藥的危險(xiǎn)因素，原因可能是，年齡大，機(jī)體抵抗力下降，可能與其易受到外源性感染有關(guān)。而農(nóng)村患者更易發(fā)生耐藥，可能與其防病意識(shí)弱，治療不及時(shí)以及用藥不規(guī)范等因素有關(guān)。而Pgp、MRP表達(dá)陽(yáng)性是肺結(jié)核病患者耐藥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但由于本研究收集例數(shù)相對(duì)較少，上述各因素的相關(guān)影響仍需要進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，Pgp、MRP表達(dá)在肺結(jié)核病患者呈高表達(dá)，是肺結(jié)核患者耐藥的獨(dú)立影響因素。