李 巖,李建遠(yuǎn)

(煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺 264005)

腺苷酸激酶(adenylate kinase,AK)是普遍存在于動物、植物及微生物體內(nèi)的單體酶,通過催化可逆的高能磷酰基的轉(zhuǎn)移反應(yīng),維持細(xì)胞內(nèi)腺苷酸組成的穩(wěn)定,并且可實(shí)現(xiàn)能量由生成部位向消耗部位傳遞[1-2]。迄今為止,在高等脊椎動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9種AK家族的同工酶 (AK1—AK9)[3]。AK家族各成員在細(xì)胞內(nèi)的分布、組織表達(dá)特性和底物特異性等方面均有差異。

AK家族成員可廣泛參與細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)。AK4是AK家族中唯一不具有催化活性的應(yīng)激反應(yīng)蛋白,其過表達(dá)可對應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞起到保護(hù)作用,在應(yīng)激條件下如缺氧、H2O2處理,AK4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)[4-6],AK4過表達(dá)的細(xì)胞系在應(yīng)激狀態(tài)下的成活率明顯高于對照組。免疫共沉淀證明,AK4可能是通過與ADP/ATP轉(zhuǎn)化酶(ANT)相互作用來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的保護(hù)作用[6]。此外,AK4基因在耐缺氧、抗腫瘤藥物耐藥、調(diào)節(jié)線粒體活性等方面發(fā)揮重要作用,并且AK4基因的表達(dá)水平在多種疾病中顯著上調(diào)[7-8]。因此,研究AK4在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中的生物學(xué)功能可為疾病的治療提供新的藥物靶點(diǎn)。

睪丸和附睪是高等動物精子發(fā)生、成熟并獲得運(yùn)動和受精能力的重要雄性生殖器官,這些過程需要充足的能量供應(yīng)[9-10]。本研究系統(tǒng)分析了AK4在成年雄性大鼠各組織及在不同周齡大鼠睪丸和附睪中的表達(dá)特點(diǎn),并探究了AK4在雄性大鼠生殖系統(tǒng)中的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制,以期為深入探討雄性生殖系統(tǒng)中AK4在應(yīng)激狀態(tài)下參與的信號通路提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級雄性Sprague-Dawley大鼠(50只,體重均達(dá)到350～400 g)購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司,動物許可證號 SCXK(魯)2019-0003,質(zhì)量合格證流水號:1107261911003748。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)溫度20.0±2.0 ℃,相對濕度為 40%～70%,采用人工照明,且12 h/12 h 明暗交替的條件下適應(yīng)7 d,期間自由飲食飲水。本研究動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過煙臺大學(xué)動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Bouin′s固定液購自sigma公司。RNA提取試劑盒RNAiso Plus購自TaKaRa公司(D9108A)。ReverTra Ace 反轉(zhuǎn)錄酶購自日本TOYOBO公司(FSK-100)。PCR擴(kuò)增試劑盒購自TaKaRa公司(DRR001A)。DL2000 DNA Marker 購于TaKaRa公司(D501A)。AK4抗體購自ProteinTech公司(13206-1-AP)。內(nèi)參抗體GAPDH購自Santa Cruz公司(sc-25778)。阿霉素(注射用鹽酸多柔比星,國藥準(zhǔn)字H20013334)購自輝瑞制藥有限公司。MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所(A003-1)。大鼠β-actin、AK4引物均由primer 5.0軟件設(shè)計,由上海生工生物有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列、Tm值及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取 大鼠處死后迅速分離各組織,于液氮中凍存。各組織總RNA提取嚴(yán)格按照說明書步驟操作。分光光度計測定總RNA濃度及純度。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄及半定量PCR 取1μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板,利用ReverTra Ace試劑盒合成cDNA第一條鏈。以cDNA為模板,使用AK4和β-actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。操作步驟嚴(yán)格按照PCR擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 Western blot 大鼠各組織蛋白質(zhì)提取步驟嚴(yán)格按照BCA蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行。各組織取50 μg上樣,具體操作步驟參照文獻(xiàn)[11]。

1.3.4 大鼠睪丸、附睪熱應(yīng)激模型的構(gòu)建 將大鼠隨機(jī)分為兩組,對照組與熱應(yīng)激組各8只。水合氯醛麻醉后,將熱應(yīng)激組大鼠陰囊浸于42 ℃水浴中20 min,擦干后回籠,待恢復(fù)4 h后處死[12]。取睪丸、附睪組織分別用于RNA和蛋白質(zhì)提取。對照組大鼠陰囊浸于室溫水浴中20 min,其余操作步驟同實(shí)驗(yàn)組。

1.3.5 大鼠睪丸、附睪氧化應(yīng)激模型的構(gòu)建 將大鼠隨機(jī)分為3組,分別為對照組、2 mg/kg阿霉素組、3 mg/kg阿霉素組(每組各8只)。實(shí)驗(yàn)組每周腹腔注射阿霉素,對照組注射生理鹽水,連續(xù)處理5周后處死[13]。取兩側(cè)睪丸和附睪組織,一側(cè)睪丸和附睪用Bouin′s固定液固定,用于組織形態(tài)觀察;另一側(cè)睪丸和附睪用于MDA含量的測定及RNA和蛋白質(zhì)的提取。

1.3.6 蘇木素-伊紅(HE)染色 通過HE染色觀察組織形態(tài)。具體操作步驟參照文獻(xiàn)[13]。

1.3.7 MDA檢測 MDA含量測定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。MDA含量計算公式為:MDA含量(nmol/mg)=[(樣本A532-樣本空白管A532)/(標(biāo)準(zhǔn)品A532-標(biāo)準(zhǔn)品空白管A532)]×10 nmol/mg樣品蛋白含量。

1.3.8 統(tǒng)計方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用EXCEL 2019、SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計和初步分析。統(tǒng)計結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。未配對t檢驗(yàn)用于表示組間的差異,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AK4在成年雄性大鼠各組織中的表達(dá)譜

通過半定量RT-PCR方法檢測AK4 mRNA在成年雄性大鼠(18周齡)心、肝、脾、肺、腎、睪丸及附睪組織中的表達(dá)譜。如圖1(a)所示,AK4 mRNA在各組織中呈泛在表達(dá)模式,且在心臟組織中表達(dá)量較其他組織低。如圖1(b)所示,AK4 蛋白水平與mRNA表達(dá)譜一致,即在心臟組織中表達(dá)略低于其他組織。

圖1 AK4在成年雄性大鼠各組織中的表達(dá)譜

2.2 AK4在大鼠睪丸與附睪中的發(fā)育時序表達(dá)譜

通過半定量RT-PCR方法檢測AK4 mRNA在2周齡、3周齡、4周齡、5周齡、7周齡、9周齡及18周齡大鼠睪丸、附睪組織中的表達(dá)譜,如圖2所示,在睪丸組織中,AK4 mRNA水平從2周齡到4周齡逐漸上調(diào),5周齡后表達(dá)趨于穩(wěn)定;在附睪組織中,AK4 mRNA在2周齡大鼠中不表達(dá),從3周齡到4周齡表達(dá)逐漸上調(diào),5周齡后表達(dá)基本趨于穩(wěn)定。如圖3所示,Western 結(jié)果表明,在睪丸組織中,AK4蛋白從2周齡到4周齡逐漸上調(diào),5周齡后表達(dá)趨于穩(wěn)定;在附睪組織中,AK4蛋白在2周齡大鼠中不表達(dá),從3周齡到4周齡表達(dá)逐漸上調(diào),5周齡后表達(dá)基本趨于穩(wěn)定,與AK4 mRNA表達(dá)時序相吻合。

2.3 AK4在大鼠睪丸、附睪熱應(yīng)激模型中的表達(dá)變化

采用半定量RT-PCR方法檢測AK4 mRNA和蛋白質(zhì)在大鼠睪丸、附睪熱應(yīng)激模型中的表達(dá)水平,結(jié)果表明,與對照組相比,熱應(yīng)激大鼠模型中AK4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均在睪丸、附睪組織中顯著上調(diào)(圖4)。

圖2 AK4 mRNA在大鼠睪丸與附睪中的發(fā)育時序表達(dá)譜

圖3 AK4 蛋白在大鼠睪丸與附睪中的發(fā)育時序表達(dá)譜

與對照組相比,*P<0.05。

2.4 AK4在大鼠睪丸、附睪氧化應(yīng)激模型中的表達(dá)變化

通過腹腔注射阿霉素建立大鼠睪丸、附睪的氧化應(yīng)激模型。HE染色對睪丸和附睪組織的氧化損傷程度進(jìn)行了初步判斷。如圖5(a)所示,HE染色結(jié)果表明,與對照組相比,以2 mg/kg和3 mg/kg劑量連續(xù)腹腔注射阿霉素五周后,大鼠的睪丸組織形態(tài)受到嚴(yán)重破壞,且隨著注射劑量的增加，損傷程度增強(qiáng)。對照組大鼠睪丸精曲小管排列緊密,管壁有5～7層細(xì)胞,從管外側(cè)到中央分別為精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、圓型精子細(xì)胞和長型精子細(xì)胞等不同發(fā)育期的生精上皮細(xì)胞,且細(xì)胞排列緊密,成熟精子豐富,間質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞無異常。隨著注射劑量的加大,睪丸廣泛性精曲小管生精細(xì)胞排列松散,結(jié)構(gòu)紊亂,呈條索狀,僅剩2或3層細(xì)胞;部分精曲小管內(nèi)見大量脫落細(xì)胞,且成熟精子數(shù)目減少。而附睪組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化(圖片不顯示)。

與對照組相比,*P<0.05。

脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA也可反映睪丸、附睪組織的氧化損傷程度。如圖5(b)、(c)所示,與對照組相比,2 mg/kg劑量組大鼠睪丸和附睪組織MDA含量增加近2倍,與對照組相比差異顯著(P<0.05);當(dāng)注射劑量增加到3 mg/kg時,睪丸和附睪組織中MDA含量均升高2倍以上,與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

半定量RT-PCR及Western結(jié)果表明,與對照組相比,AK4 mRNA和蛋白在睪丸組織中的表達(dá)量隨注射劑量增加而顯著上調(diào)(P<0.05)(圖6),而在附睪組織中表達(dá)無明顯差異(圖片不顯示)。

與對照組相比,*P<0.05。

3 討 論

睪丸和附睪作為精子發(fā)生和成熟的場所，必須需要充足的能量來保證功能性精子的產(chǎn)生和正常的激素分泌。然而迄今為止,有關(guān)AK家族的成員在睪丸、附睪中的研究卻很少有文獻(xiàn)報道。因此系統(tǒng)地開展AK家族各成員在睪丸、附睪中的研究將有助于闡明其在精子發(fā)生和成熟過程中的生物學(xué)功能。本研究結(jié)果表明,AK4 mRNA和蛋白質(zhì)在雄性成年大鼠各組織中呈泛在表達(dá)模式,推測AK4可能在各組織中起到一定的保護(hù)作用。AK4在大鼠睪丸與附睪中的表達(dá)水平隨發(fā)育過程的進(jìn)行呈現(xiàn)出規(guī)律性變化:在睪丸組織中,AK4 mRNA和蛋白質(zhì)從2周齡開始表達(dá),至5周齡后表達(dá)趨于穩(wěn)定;在附睪組織中,AK4 mRNA和蛋白質(zhì)從3周齡開始表達(dá),至5周齡后表達(dá)趨于穩(wěn)定,推測激素水平是影響發(fā)育進(jìn)程中AK4表達(dá)趨勢變化的主要因素,有待深入研究。

AK4作為應(yīng)激調(diào)節(jié)蛋白可廣泛參與應(yīng)激反應(yīng)過程。小鼠ATDC5細(xì)胞在缺氧條件下,AK4 mRNA的表達(dá)量上調(diào)[4]。另外通過cDNA陣列分析發(fā)現(xiàn),AK4 mRNA的表達(dá)量上調(diào)的現(xiàn)象也同樣存在于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的血管平滑肌細(xì)胞中[14]。此外有文獻(xiàn)報道四種肝臟毒性藥物(撲熱息痛、胺碘酮、四環(huán)素,氯仿)可導(dǎo)致AK4蛋白表達(dá)水平上調(diào)[3]。越來越多的數(shù)據(jù)表明,AK4在惡性腫瘤中過表達(dá),雖然其表達(dá)特點(diǎn)與大多數(shù)腫瘤的分期尚無明確關(guān)系,但AK4的過表達(dá)可顯著促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和遷移,并且改變腫瘤對治療的敏感性,且過表達(dá)多提示預(yù)后不良和生存期較短。故AK4可以作為判斷惡性腫瘤預(yù)后的指標(biāo)并有望成為治療腫瘤的潛在靶點(diǎn),其臨床價值值得深入研究[15]。

在雄性生殖系統(tǒng)中存在著眾多嚴(yán)重影響精子質(zhì)量的應(yīng)激狀態(tài),如氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激等。在氧化應(yīng)激條件下,高水平的自由基可以直接氧化損傷精子的質(zhì)膜,大大降低精子的運(yùn)動及精卵結(jié)合能力,并破壞精子頭部DNA的完整性,引起遺傳缺陷,最終將會導(dǎo)致雄性不育[16]，而長期暴露于高溫環(huán)境中可造成精子數(shù)目減少、活力降低且畸形精子數(shù)目增多[17-18]。為了確定AK4是否是雄性生殖系統(tǒng)中的應(yīng)激狀態(tài)下的標(biāo)志蛋白,本研究選擇高溫和阿霉素作為引起生殖系統(tǒng)應(yīng)激狀態(tài)的誘導(dǎo)因素,分別建立了雄性大鼠睪丸和附睪的熱應(yīng)激模型和氧化應(yīng)激模型。在熱應(yīng)激模型中,與對照組相比,AK4 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量在睪丸和附睪組織中明顯上調(diào)。阿霉素是一種蒽環(huán)類抗腫瘤類藥物,在消滅腫瘤細(xì)胞的同時具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,特別是對于睪丸組織,因其含有大量細(xì)胞分裂旺盛的精原細(xì)胞和各級精母細(xì)胞等。已有文獻(xiàn)報道阿霉素造成生殖系統(tǒng)毒性主要是通過產(chǎn)生大量氧自由基導(dǎo)致,而大量的自由基可導(dǎo)致生殖系統(tǒng)嚴(yán)重的氧化損傷[19-20]。在氧化應(yīng)激模型中,睪丸組織形態(tài)受到嚴(yán)重破壞,且隨注射劑量的增加損傷程度增強(qiáng)。另外,脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA也可反映組織的氧化損傷程度。在模型中,睪丸和附睪組織中MDA水平均顯著增加。與此同時,AK4 mRNA和蛋白在睪丸組織中的表達(dá)量隨注射劑量的增加而明顯上調(diào)。而附睪組織的形態(tài)和AK4的表達(dá)水平與對照組相比未發(fā)生明顯變化。因此推測在大鼠雄性生殖系統(tǒng)中,熱應(yīng)激及氧化應(yīng)激條件下AK4的過表達(dá)可降低外界不利因素對睪丸中生殖細(xì)胞的有害影響,對生殖細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。應(yīng)激狀態(tài)下AK4參與保護(hù)細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制有待于深入研究。

本研究對AK4在大鼠雄性生殖系統(tǒng)中的表達(dá)特點(diǎn)及應(yīng)激反應(yīng)中的表達(dá)變化進(jìn)行了系統(tǒng)性研究,為闡明AK4在雄性生殖系統(tǒng)中功能以及在應(yīng)激狀態(tài)下參與的信號通路提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。