盧 鴻，李新荻，王 宇，羅布白珍，段夢琪，葉幼榮，張 健，商 鵬

（1. 西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2. 西藏特色農牧資源研發(fā)省部共建協同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000；3. 林芝市巴宜區(qū)畜牧獸醫(yī)總站，西藏 林芝 860000）

隨著對食品健康營養(yǎng)安全的重視，人們對肉品質的要求越來越高，脂肪組織是影響豬肉品質的一大因素[1]，直接影響豬生產的經濟效益[2]。因此，對豬脂肪組織的生長發(fā)育及代謝調控研究具有重要意義。

膜聯蛋白是一種與Ca2+和脂質結合密切相關的蛋白質家族[3]，存在于細胞內和細胞外的不同位置[4]，與多種膜脂質和蛋白質相互作用，參與鈣離子通道形成、細胞生長、細胞增殖、細胞分化等細胞生理活動[5?6]。膜聯蛋白家族由12 個進化保守且結構相關的Ca2+和磷脂結合蛋白組成，所有的膜聯蛋白都具有一個高度保守的中心結構域，可以通過Ca2+介導的方式與細胞磷脂可逆的結合[7]。膜聯蛋白A2（Annexin A2，ANXA2）屬于膜聯蛋白（Annexins）家族A 亞家族的成員之一，包含一個中央域和一個N端中央域，其中包含與鈣離子、磷脂等其他物質的結合位點[8?11]。近年來，ANXA2基因對脂肪影響方面的研究逐漸凸顯。付睿倚[12]利用蛋白質組學技術研究北京油雞肌肉發(fā)育和肌內脂肪沉積的分子機制，發(fā)現ANXA2基因是調控脂類代謝的關鍵基因；周揚[13]利用二代高通量測序技術分別對胎牛、成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂肪組織進行轉錄組測序分析發(fā)現，ANXA2基因在脂肪組織內表達量較高。此外，ANXA2基因還在人類和嚙鼠的脂肪組織中表達[14?16]。另有研究表明，在豬的輸卵管中，ANXA2基因與精子結合有關[17]；ANXA2蛋白與豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP9 的相互作用有益于病毒復制[18]。

藏豬是我國特有的能適應高原環(huán)境的一個重要品種[19]，有極強的環(huán)境適應性、抗病力強、耐粗飼、肉嫩味美，素有“高原之珍”的美譽[20]。有研究表明，藏豬和大約克豬的背膘厚、瘦肉率、肌內脂肪含量等存在明顯差異[21?22]。鑒于此，對ANXA2基因進行單核苷酸多態(tài)性（SNP）及組織表達差異分析，探究ANXA2基因對藏豬脂肪沉積的影響，旨在為藏豬的分子育種研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料 以西藏農牧學院教學實習牧場和林芝宇高生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地飼養(yǎng)的藏豬（TP）、大約克豬（YY）為研究對象。采集藏豬和大約克豬的耳組織樣品，置75%乙醇中，-20 ℃保存，用于DNA 提取。屠宰180 日齡的藏豬和大約克豬，分別采集肝臟、腹脂及背脂組織，立即放入RNA保存液，液氮速凍，返回西藏農牧學院動物遺傳育種與繁殖實驗室放于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)RNA提取。

1.1.2 主要試劑與儀器 RNase-Free ddH2O、Fastking cDNA 第 一 鏈 合 成 試 劑 盒、2×PowerTaqPCR Master Mix（Bioteke Gorporation 公 司 生 產）、Super Real PreMix Plus（SYBR Green）等均購自天根生化科技（北京）有限公司；Trizol 試劑購自Thermo Fisher Scientific公司（美國）。

PCR 儀購自北京奧秘佳得醫(yī)藥科技有限公司；實時熒光定量PCR 儀購自上海土森視覺科技有限公司。

1.2 DNA、RNA提取及cDNA制備

采用苯酚-氯仿法從藏豬和大約克豬的耳組織樣品中提取DNA，將其溶解在RNase-Free ddH2O中，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA 的質量，用NanoDrop 2000 分光光度計檢測DNA 的濃度，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Trizol 法提取肝臟、腹脂及背脂組織的RNA，將其溶解在RNase-Free ddH2O 中，用Nano?Drop 2000 分光光度計檢測RNA 的濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA 的質量，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用Fastking cDNA 第一鏈合成試劑盒對RNA進行反轉錄，用NanoDrop 2000 分光光度計檢測cDNA的濃度，所得cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.3 引物設計及合成

1.3.1 SNP 篩選引物設計與合成 登錄GenBank，下載ANXA2基因（登錄號:NC_010443）序列。采用Primer Premier 5.0 軟件和NCBI 在線引物設計相結合的方式設計ANXA2基因5′側翼區(qū)的引物，序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，4 ℃保存。

表1 豬ANXA2基因SNP篩選引物信息Tab.1 The primer information for SNP screening in pig ANXA2 gene

1.3.2 實時熒光定量PCR 的引物設計與合成

首先在NCBI官網（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載豬ANXA2基因的mRNA 序列，選取DRAP1（登錄號：XM_0031225183）作為內參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設計實時熒光定量PCR 引物設計，信息見表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表2 實時熒光定量PCR的引物信息Tab.2 The primer information for real-time fluorescence quantitative PCR

1.4 ANXA2基因PCR擴增

PCR 擴增體系20 μL：DNA 模板1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix 10 μL。

PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共36 個循環(huán)；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。

將PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測合格的PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.5 基因頻率與基因型頻率檢測、轉錄因子預測

選取藏豬和大約克豬各10頭，采用Sanger測序法對ANXA2基因的PCR 產物進行混池測序，采用DNAMAN 6.0、Chromas Pro 軟件相結合的方式對混池測序結果進行分析，篩選SNP 位點；針對所篩選出的SNP 位點擴大個體測序，計算基因型頻率與基因頻率。應用在線預測軟件JASPAR（http://jaspar.genereg.net/）對ANXA2基因的突變位點進行轉錄因子預測。

1.6 實時熒光定量PCR檢測

以ANXA2基因cDNA 為模板，選用DRAP1為內參基因，每個待測的藏豬和大約克豬樣品各設置3個重復。

PCR 反應體系20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 模板1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL。利用實時熒光定量PCR儀進行擴增。采用2-ΔΔCt方法計算ANXA2基因的相對表達量。

1.7 數據處理

利用Sigma plot 軟件對ANXA2基因相對表達量進行雙因素（品種和組織）分析，以平均值±標準差作圖，并利用SPSS 25.0 軟件對ANXA2基因表達量進行差異顯著性分析；運用Excel 軟件計算各個突變位點的基因頻率和基因型頻率，使用卡方檢驗對ANXA2基因的基因型頻率和基因頻率進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 ANXA2基因PCR擴增結果

PCR 擴增結果顯示，有長約915 bp 的清晰條帶（圖1），與目的條帶片段大小相符，PCR 擴增產物滿足后續(xù)測序質量要求。

圖1 藏豬和大約克豬ANXA2基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification products of ANXA2 gene from Tibetan pigs and Yorkshire pigs

2.2 不同組織ANXA2基因相對表達量變化

ANXA2基因在藏豬和大約克豬的肝臟、腹脂、背脂的mRNA 相對表達量結果見圖2。在肝臟中，ANXA2基因在藏豬和大約克豬上的表達量差異不顯著（P>0.05）；在背脂和腹脂中，ANXA2基因在藏豬中的表達量均極顯著低于大約克豬（P<0.01）。

圖2 ANXA2基因在藏豬、大約克豬的肝臟、腹脂和背脂中mRNA相對表達量Fig.2 Relative mRNA expression levels of ANXA2 gene in liver，abdominal fat and back fat of Tibetan pigs and Yorkshire pigs

2.3 ANXA2基因型頻率和等位基因頻率分布

測序結果（圖3）顯示，ANXA2基因共有g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C和g.111574638A>G 4個突變位點。

圖3 ANXA2基因5′側翼區(qū)SNP篩選Fig.3 SNP screening of ANXA2 gene in 5′flanking sequencing

突變位點g.111574291G>A，在藏豬中存在GG型、GA 型，在大約克豬中存在GG 型、GA 型、AA 型，G基因為優(yōu)勢等位基因；突變位點g.111574499C>T，在藏豬中存在CC 型、CT 型，在大約克豬中存在TT型、CT 型、CC 型，C 基因為優(yōu)勢等位基因；突變位點g.111574522G>C，在藏豬和大約克豬中均存在GG型、GC 型，G基因為優(yōu)勢等位基因；突變位點g.111574638A>G，在藏豬中存在GG 型、AA 型和AG型，G 基因優(yōu)勢等位基因，在大約克豬中存在GG型、GA型、AA型，A基因為優(yōu)勢等位基因。

基因型頻率、基因頻率及卡方檢驗結果如表3所示，ANXA2基因4 個突變位點（g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C 和g.111574638 A>G）均符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡，在藏豬和大約克豬中，g.111574291G>A 突變位點存在顯著差異（P<0.05），g.111574499C>T、g.11157452 2G>C 和g.111574638A>G 這3 個突變位點存在極顯著差異（P<0.01）。

表3 ANXA2基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率Tab.3 ANXA2 gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

2.4 ANXA2基因轉錄因子預測結果

通過在線預測軟件JASPAR 分析可知，ANXA2基因g.111574291G>A 位點突變前存在6 個轉錄因子，突變后存在1 個轉錄因子，有5 個轉錄因子消失；g.111574638A>G 位點突變前存在1 個轉錄因子，突變后消失；g.111574522G>C 位點突變前后轉錄因子無變化；g.111574499C>T 位點突變前存在3個轉錄因子，突變后有2 個轉錄因子消失，新增3個轉錄因子，為Arid3a、CUX1和CUX2。

3 結論與討論

本研究在ANXA2基因5′側翼區(qū)篩選到4 個新的SNP 位點（g.111574291G>A、g.111574499C>T、g.111574522G>C和g.111574638A>G）。轉錄因子預測發(fā)現，g.111574499C>T 位點堿基突變后出現了新的轉錄因子Arid3a、CUX1、CUX2。其中，Arid3a 蛋白為ARID 家族的一員，是序列特異性的轉錄因子，有靶向結合啟動子的功能，在細胞生長發(fā)育和分化中有重要作用[23]。CUX 又稱為Cut-like（CUTL），屬于轉錄因子同源結構域CCAAT 置換蛋白（CCAAT displacement protein，CDP）家族的成員，常常作為轉錄激活因子或轉錄抑制因子發(fā)揮作用[24]。在高等脊椎動物體內，CUX 存在CUX1 和CUX2 兩種基因[25]。CUX1 是一種轉錄抑制因子，參與許多細胞基因的轉錄抑制[26]，可以調節(jié)與脂肪質量相關基因的表達[27]。還有研究表明，Arid3a與CUX相互作用，通過結合促進劑和增強子相關基質附著區(qū)域（MARS）來調節(jié)免疫球蛋白重鏈（IGH）基因轉錄[28]。推測Arid3a 與CUX 也有可能相互作用，通過某種機制調控ANXA2基因的表達，從而影響豬的脂肪代謝。

本研究中，ANXA2基因在藏豬背脂和腹脂中的表達量均極顯著低于大約克豬（P<0.01），推測ANXA2基因促進豬的脂肪代謝。有研究表明，在白色脂肪組織的內皮細胞和脂肪細胞中，ANXA2蛋白能結合抑制素和脂肪酸轉運體CD36，從而提高機體對脂肪酸的攝取，而且還能使脂肪酸從內皮細胞運輸到脂肪細胞，ANXA2基因的表達與脂肪沉積有關[29]，與本研究結果一致。另有研究表明，ANXA2基因在奶牛脂肪組織代謝調節(jié)中起著關鍵作用[30?31]。藏豬是脂肪型豬種，大約克豬是瘦肉型豬種。本研究中，ANXA2基因在藏豬背脂和腹脂中的表達量均極顯著低于大約克豬，可能是因為大約克豬作為非高原豬種，長期處于高原環(huán)境下，由于體力活動的變化增加了所需的Ca2+水平，促進了ANXA2基因的表達，有利于ANXA2 蛋白與其他分子結合[32]。據此推測，g.111574499C>T 位點可能是調控ANXA2基因表達的關鍵功能位點，突變導致ANXA2基因負向調控脂肪沉積。與本研究中ANXA2基因在藏豬的腹脂和背脂中的表達情況一致，但具體調控機制和功能仍需進一步研究。

綜上，ANXA2基因在藏豬和大約克豬的背脂和腹脂的表達量存在極顯著差異，對篩選出的突變位點進行轉錄因子預測，發(fā)現突變后產生了新的轉錄因子，新的轉錄因子在細胞生長發(fā)育和分化中發(fā)揮重要作用。推測ANXA2基因可能是調控脂肪沉積和脂肪代謝的重要候選基因。