鄧福金，周國權，李博平，杜學海

（遼寧省農業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧 沈陽 110032）

精液中細菌數(shù)量是衡量牛冷凍精液質量的一項重要指標。我國牛冷凍精液國家標準規(guī)定，每劑量精液中細菌數(shù)不得超過800 個[1]。為達這一標準，必須嚴格把握采精環(huán)節(jié)。精液中產生細菌的主要原因為公牛生殖器官疾病，也與采精、凍精生產過程有關。公牛包皮內含大量腸球菌、葡萄球菌、大腸桿菌等，是公牛精液中細菌的主要來源[2]。精液中細菌數(shù)過多，不僅可造成精子活力降低、生存時間縮短，并且極易造成胚胎早期死亡，甚至引發(fā)母牛繁殖障礙[3]。采精時對公牛陰莖包皮的清洗至關重要[4]，若采精前沖洗包皮，可在一定程度上防止細菌污染[5]。但也有研究顯示，采精前不必為每頭公牛沖洗包皮，清洗不當更可能傳播疾病[6]。因此，本研究在冬春兩季開展采精前沖洗包皮對精液內細菌數(shù)量變化影響的對比試驗，以期為種公牛站精液生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

采精公牛來自遼寧省牧經種牛繁育中心有限公司。

1.2 試劑與儀器

儀器：BCX-200包皮沖洗裝置，購自日本富士平工業(yè)株式會社；IS4 型細管灌封噴碼一體機、ACCUCELL 精液密度測定儀、TMS-160MHS細管精液冷凍儀，均購自法國IMV公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱，購自北京永光明醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D 超凈化工作臺，購自蘇州凈化儀器廠；DZKW-D-5-6 恒溫水浴箱，購自北京永光明醫(yī)療器械廠；YP-B2002 天平，購自江蘇省常州萬得天平儀器廠；LDZX-30KBS 電熱壓力蒸氣滅菌器，購自上海申安醫(yī)療器械廠；細管剪，購自法國IMV 公司。0.25 mL 細管、細管專用推針（自制）、平皿（直徑90 mm）、酒精燈、記號筆等。

試劑：Bioxcell 稀釋液（法國IMV 公司）、02-75營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物科技有限責任公司）、75%酒精。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗時間

選擇冬季（2020 年12 月—2021 年2 月）、春季（2021 年4月—6月）進行。試驗期共6個月。

1.3.2 試驗設計

14 頭種公牛，分對照組和試驗組，每組選擇7 頭采精公牛。冬春兩季各開展1次試驗，每次試驗每頭公牛重復檢測3 次，即每月進行1 次檢測。對照組公牛采精前采用包皮沖洗機，約38 ℃溫水沖洗包皮及陰毛周圍污物，停留20 min，水滴淋干后進行采精；試驗組公牛采精前不沖洗包皮，牽入采精場直接采精。

1.3.3 凍精生產

凍精按照DB21/T 3006—2018 進行[7]。精液采集后分別對其活力、密度、采精量進行檢查；根據精液的活力、密度、每劑量有效精子數(shù)稀釋精液，常溫下灌裝，封口，4～5 ℃低溫柜中降溫、平衡3～4 h，低溫柜中碼簾上架，全自動冷凍儀中冷凍。冷凍完成后，每頭牛抽取2支細管凍精進行檢測。

1.3.4 細菌檢測

超凈化工作臺內點燃酒精燈，平皿標記樣品編號。細管凍精37 ℃水浴解凍，酒精棉球擦拭整支細管，剪掉超聲波封口端，細管推針將整支細管的精液（0.18～0.20 mL）注入平皿；注入10～15 mL 保溫至46～50 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基至平皿，轉動平皿使其與精液混合均勻，并做一空白對照。瓊脂凝固后翻轉平板，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h，平皿內菌落數(shù)計數(shù)法參考國家標準（GB 4143—2008）。

式中：B為細菌數(shù)；n1為第一次試驗樣品中細菌數(shù)；n2為第二次試驗樣品中細菌數(shù)；n3為第三次試驗樣品中細菌數(shù)。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計與分析

數(shù)據采用Excel進行初步處理，采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，組內差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間差異采用獨立樣本t 測驗比較。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冬季采集精液中細菌數(shù)量變化（見表1）

表1 冬季采集精液中細菌數(shù)量變化Tab.1 Changes in the number of bacteria in semen collected in winter 單位：個/支

由表1 可知，對照組細菌數(shù)量為1.7～10.3 個/支，組內個體間細菌數(shù)量差異顯著；樣本2、6細菌數(shù)量顯著高于其他組（P＜0.05）。試驗組細菌數(shù)量為2.0～12.7個/支，組內個體間細菌數(shù)量差異顯著；樣本4的細菌數(shù)量顯著高于其他組（P＜0.05）。

試驗結果表明，公牛沖洗包皮與否，組內個體間細菌數(shù)量均存在較大差異。

2.2 春季采集精液中細菌數(shù)量變化（見表2）

表2 春季采集精液中細菌數(shù)量變化Tab.2 Changes in the number of bacteria in semen collected in spring 單位：個/支

由表2 可知，對照組細菌數(shù)量為0.3～3.3 個/支，組內個體間細菌數(shù)量差異不顯著（P＞0.05）。試驗組細菌數(shù)量為2.0～8.3 個/支，組內個體間細菌數(shù)量差異顯著（P＜0.05）；樣本1、3細菌數(shù)量顯著低于其他組（P＜0.05）。

2.3 不同季節(jié)種公牛包皮沖洗與否對精液中細菌數(shù)量的

影響（見表3）

由表3可知，不同季節(jié)采精，對照組與試驗組細菌數(shù)量均無顯著差異（P＞0.05）。試驗組平均細菌數(shù)量大于對照組，即不沖洗包皮采集精液中細菌數(shù)量多于沖洗包皮，但兩組的細菌數(shù)量均低于國家標準要求。

表3 不同季節(jié)種公牛包皮沖洗與否對精液中細菌數(shù)量的影響Tab.3 Influence of washing foreskin of bulls in different seasons on the number of bacteria in semen 單位：個/支

3 討論

公牛包皮內含大量細菌，采精時對公牛包皮沖洗與否可影響細菌的混入程度。本試驗結果表明，種公牛采精前包皮沖洗與否對精液中細菌數(shù)量無顯著影響，與康年登等[8]、郝愛玲等[9]研究結果不一致。組內個體間差異極顯著，但同一頭牛不同批次間差異不大，原因可能是不同的牛其包皮、陰筒、牛體衛(wèi)生等條件不同，而同一頭牛不同批次間在正常情況下其衛(wèi)生條件是相對穩(wěn)定的，此結果與陸漢希[10]研究結論一致。試驗組與對照組比較無顯著差異，說明公牛包皮內衛(wèi)生環(huán)境相對穩(wěn)定，與包皮是否沖洗無顯著影響。公牛沖洗包皮與否，應根據氣候環(huán)境、牛體衛(wèi)生、個體健康等情況考慮[11]。在氣候適宜的春、秋季節(jié)（夏季炎熱季節(jié)停采），公牛主要在室外活動，在保證環(huán)境衛(wèi)生和牛體衛(wèi)生的情況下，不必沖洗所有公牛包皮；在氣候寒冷的冬季，公牛大部分時間在舍內飼養(yǎng)，通風條件差，空氣濕度大、有害氣多，牛體衛(wèi)生不便清潔，包皮和陰毛附著糞尿易滋生細菌，此時對公牛包皮的清洗至關重要。

自然交配時細菌可在公牛和母牛之間傳播，人工采集精液也不可能完全避免細菌污染。國家要求每頭牛每季度至少做一次凍精質量檢測，細菌數(shù)是主要檢查項目之一。通過凍精質量檢測報告，可動態(tài)監(jiān)測精液中細菌數(shù)變化情況；精液中細菌數(shù)量顯著增多、接近800個時，應考慮沖洗公牛包皮。遼寧省牧經種牛繁育中心日常檢測結果中，2/3 的樣品細菌數(shù)為0，可能與稀釋液中加入過多抗生素有關；極個別樣品中細菌數(shù)超過800 個/支，原因為采精過程中公牛陰莖觸及不潔臺牛后軀，與公牛是否沖洗包皮無關。除非存在特別污染問題，一般情況下不必對所有精液樣品作細菌培養(yǎng)，每隔4～6 個月隨機抽取20～30 個精液樣品作細菌檢查是適宜的做法，不僅保證精液質量，還能夠發(fā)現(xiàn)公牛是否患病，改進采精技術，改善衛(wèi)生條件。

公牛衛(wèi)生狀況好，精液污染的風險也隨之降低。因此，應保持日常的環(huán)境與牛體衛(wèi)生。牛舍保持清潔干燥；堅持每天刷拭牛體，夏季結合水刷，冬季干刷。定期修剪公牛陰毛，長度以1.5～2.0 cm 為宜。若部分公牛包皮容易藏垢，則每次采精時必須沖洗干凈。采精前保持采精場所衛(wèi)生，地面灑水降塵，清潔公牛和臺牛體表的浮塵、污物，尤其對公牛下腹部、臺牛臀部進行清洗，刷刨，達到全身被毛無污染、無灰土，保證牛群處于最佳采精的狀態(tài)。為需要沖洗包皮種公牛沖洗時，噴嘴不應直接接觸陰毛和包皮，更不可將噴嘴伸入包皮內，引起公牛包皮炎癥。無沖洗條件或清洗達不到要求的養(yǎng)殖場，則不提倡沖洗包皮；若沖洗不干凈反而會破壞包皮屏障功效，造成污染[12]。

4 結論

試驗僅對公牛一個月內不沖洗包皮采集的精液中細菌數(shù)變化進行研究，但更長時間的情況還需進一步試驗驗證。本次試驗選擇14頭公牛，檢驗樣本84頭份，精液中所含細菌數(shù)均遠低于國家標準要求的800 個/支。試驗結果表明，在保證環(huán)境衛(wèi)生和牛體衛(wèi)生的條件下，種公牛采精前沖洗包皮與否對精液中細菌數(shù)無顯著影響。除非特殊需要，采精前不必為每頭公牛沖洗包皮，操作不當可能增加傳播疾病的風險。