周佳蕾，盛海斌，王皓煜，魯 巖，王方方，吳 皓1，2，，華云峰1，2，#

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所，上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200125；3.上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，上海 200125；4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200062

耳蝸核（cochlear nucleus，CN）是哺乳動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)中樞的最低級(jí)核團(tuán)，其對(duì)稱(chēng)分布于腦橋和延髓交界處，接受同側(cè)耳蝸聽(tīng)神經(jīng)投射。既往研究［1］發(fā)現(xiàn)，CN 神經(jīng)元的軸突亦可投射到同側(cè)及對(duì)側(cè)的上橄欖核復(fù)合體（superior olivary complex，SOC）。因此，除能夠?qū)?lái)自耳蝸的聽(tīng)覺(jué)信號(hào)作簡(jiǎn)單中繼外，CN 還可作為雙耳信號(hào)處理的起始核團(tuán)，在聲源定位、雙耳增益校準(zhǔn)及回聲抑制等雙耳功能中發(fā)揮重要作用。

連接耳蝸聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞的聽(tīng)神經(jīng)束在進(jìn)入CN 后會(huì)形成分叉，分別投射至CN 的3 個(gè)亞區(qū)，即前腹側(cè)耳蝸核（anteroventral cochlear nucleus，AVCN）、后腹側(cè)耳蝸核（posteroventral cochlear nucleus，PVCN）以及背側(cè)耳蝸核（dorsal cochlear nucleus，DCN）。研究［2-3］顯示，位于AVCN 中的叢細(xì)胞（bushy cell，BC）是耳蝸聽(tīng)神經(jīng)的主要支配對(duì)象之一，其胞體可與聽(tīng)神經(jīng)形成根蕾狀（endbulb of Held）突觸。且相關(guān)研究［4-6］發(fā)現(xiàn)，根蕾狀突觸可能賦予了叢細(xì)胞與聽(tīng)神經(jīng)放電產(chǎn)生鎖相的特征，從而被認(rèn)為是一種重合檢測(cè)器，用于判斷叢細(xì)胞上多個(gè)聽(tīng)覺(jué)信號(hào)間的相關(guān)性。同時(shí)，相鄰叢細(xì)胞可形成具有同步放電特性的細(xì)胞簇［7-9］，通過(guò)聽(tīng)神經(jīng)上連體的根蕾狀突觸或叢細(xì)胞間的電耦合來(lái)實(shí)現(xiàn)相鄰叢細(xì)胞的同步放電。此外，叢細(xì)胞還可接收來(lái)自AVCN 內(nèi)部衛(wèi)星細(xì)胞及來(lái)自同側(cè)DCN、對(duì)側(cè)CN、SOC 和體感神經(jīng)的直接或間接投射的調(diào)控［1，7，10-13］，而完整的投射至叢細(xì)胞的神經(jīng)突觸支配模式及特異性有待進(jìn)一步明確。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［5，14-15］發(fā)現(xiàn)，耳聾以及異常的聽(tīng)覺(jué)經(jīng)歷均可導(dǎo)致腹側(cè)耳蝸核（ventral cochlear nucleus，VCN）發(fā)生突觸可塑性變化，而這些改變對(duì)VCN 神經(jīng)環(huán)路產(chǎn)生的具體影響尚不清晰。

研究［16］顯示，腦組織神經(jīng)環(huán)路的解析需要足夠的尺度及必要的分辨率，才能獲得單個(gè)突觸分辨率的完整神經(jīng)連接圖譜。但目前，針對(duì)CN 神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)學(xué)研究方法僅局限在稀疏熒光標(biāo)記和光學(xué)顯微成像，由于其分辨率的限制，只能行孤立神經(jīng)元的重構(gòu)和分析。而孤立重構(gòu)的神經(jīng)元雖可用于形態(tài)分類(lèi)和功能預(yù)測(cè)，但對(duì)明確神經(jīng)環(huán)路中同類(lèi)神經(jīng)元的分工以及最小功能微環(huán)路的組成貢獻(xiàn)較為有限。近年來(lái)，三維電鏡技術(shù)在通量上的提升使得大尺度、高分辨重構(gòu)生物樣品成為可能，該新技術(shù)已逐漸用于各類(lèi)腦組織和感官器官的神經(jīng)連接組學(xué)研究［17-19］?；谇捌趯?duì)大腦皮層［20-21］和耳蝸神經(jīng)組織［22-24］的三維電鏡研究基礎(chǔ)，本課題組擬制備小鼠完整CN 的電鏡樣品，通過(guò)X 射線(xiàn)顯微鏡和連續(xù)切片三維掃描電鏡對(duì)VCN 神經(jīng)環(huán)路進(jìn)行跨尺度的形態(tài)學(xué)研究嘗試，為系統(tǒng)開(kāi)展CN神經(jīng)連接組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7～8周齡SPF級(jí)正常聽(tīng)力的雄性CBA/Ca小鼠5只［購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2017-0012］，體質(zhì)量為200～250 g。小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（滬）2016-0016。溫度約25 ℃、濕度60%～70%、12 h 光照與黑暗交替條件下，自由進(jìn)食、飲水。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：SH9H-2021-A728-1），所有動(dòng)物的相關(guān)操作均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 CN的固定和取材

小鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛（500 mg/kg）進(jìn)行麻醉后，用微量注射泵（以9 mL/min 的泵速）經(jīng)心臟先后泵入15 mL 二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）和30 mL 混合固定液（2%多聚甲醛、2.5%戊二醛及0.08 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液，pH=7.4）行全身固定。隨后，處死小鼠并進(jìn)行斷頭，快速地從其顱骨中解剖、分離出腦組織（需注意在分離腦組織時(shí)，應(yīng)使用精細(xì)眼科剪切斷內(nèi)聽(tīng)道至腦干間的聽(tīng)神經(jīng)，以免破壞CN組織的結(jié)構(gòu)），并浸沒(méi)在混合固定液中，于4 ℃下靜置24～48 h。取出腦組織后，將其轉(zhuǎn)移至裝有二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）的解剖皿中（冰上）。于解剖顯微鏡下小心剔除部分小腦，暴露出腦干及其表面的CN。最終，從腦干中完整分離出CN。

1.3 CN樣品的重金屬塊染

參照已建立的電鏡樣品制備流程中的染色方法［20］對(duì)采集的CN 樣品進(jìn)行染色，具體步驟如下：①使用二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）清洗CN 樣品2 次，每次30 min；隨后，依次于鋨酸（2%）、亞鐵氰化鉀（2.5%）、鋨酸（2%）中分別浸沒(méi)2、1.5、1 h。②使用二甲胂酸鈉緩沖液（0.15 mol/L）和去離子純凈水清洗樣品各1 次，每次30 min；再將樣品轉(zhuǎn)移至硫代甲肼（1%水溶液）和鋨酸（2%水溶液）中浸泡1、1.5 h，并于每步之后用去離子純凈水清洗2次，每次30 min。③將樣品浸沒(méi)在乙酸鈾（1%水溶液）中，于4 ℃過(guò)夜；次日轉(zhuǎn)移至50 ℃烘箱中靜置2 h，并用去離子純凈水清洗2 次，每次30 min。④再將樣品轉(zhuǎn)移到新鮮配制的天門(mén)冬氨酸鉛溶液（0.03 mol/L）中，于50 ℃浸泡2 h，用去離子純凈水清洗2 次，每次30 min。

1.4 CN核樣品的脫水和樹(shù)脂包埋

采用梯度乙醇（50%、75%、90%和100%）及無(wú)水丙酮對(duì)上述已完成染色的CN 樣品進(jìn)行脫水，具體如下：①樣品于預(yù)冷（4 ℃）的50%、75%、90%乙醇中脫水，每個(gè)梯度浸泡30 min。②將樣品轉(zhuǎn)移至100%乙醇中，于室溫脫水30 min。③于室溫下用無(wú)水丙酮脫水3次，每次45 min。

將脫水后的樣品浸沒(méi)于無(wú)水丙酮與低黏度Spurr樹(shù)脂的混合液（體積比1∶1）中，于旋轉(zhuǎn)儀上（轉(zhuǎn)速為5 r/s）過(guò)夜混勻（離心管蓋保持打開(kāi)，以便丙酮揮發(fā)）。次日，將樣品轉(zhuǎn)移至純樹(shù)脂中靜置8～12 h（離心管關(guān)蓋），而后再置于模具中，70 ℃烘箱（需預(yù)熱）內(nèi)高溫聚合72 h以上，完成包埋。

1.5 CN 樣品的X 射線(xiàn)顯微成像及其目標(biāo)區(qū)域的定位和修樣

利用TRIM2 修塊機(jī)（Leica，美國(guó)）將脫水、包埋后的CN 樣品修成橫斷面約為2.0 mm×2.0 mm 的長(zhǎng)方體，并用強(qiáng)力膠將其固定于鋁釘?shù)鬃?，通過(guò)X射線(xiàn)顯微鏡進(jìn)行掃描、成像。使用圖像處理軟件Dragonfly（Objective Research Systems，加拿大）對(duì)獲得的圖像進(jìn)行三維重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)三維體積數(shù)據(jù)的可視化，用于對(duì)樣品染色效果和均一度的初步評(píng)估以及CN目標(biāo)區(qū)域的定位。

使用修塊機(jī)去除CN 目標(biāo)區(qū)域周?chē)嘤嗟臉?shù)脂，利用UC7 超薄切片機(jī)（Leica，德國(guó)）對(duì)其表面進(jìn)行拋光處理，再用Ted Pella-208C 離子濺射儀（Ted Pella，美國(guó)）對(duì)其做噴碳（厚度10 nm）處理后，用Gemini300 掃描電鏡（Zeiss，德國(guó)）進(jìn)行低分辨率快速預(yù)掃描（像素為1.59 μm，駐留時(shí)間為1.0 μs），用于和X射線(xiàn)顯微成像后重構(gòu)的圖像進(jìn)行比對(duì)，確定樣品表面在CN的具體位置。

1.6 目標(biāo)區(qū)域的三維電鏡圖像采集、三維重構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)分析

將預(yù)掃的電鏡圖像與X射線(xiàn)顯微成像后重構(gòu)的三維圖像進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)，進(jìn)一步確定目標(biāo)區(qū)域（VCN的叢細(xì)胞簇區(qū)域）位置，必要時(shí)可通過(guò)超薄切片機(jī)進(jìn)行再次修樣，原則上樣品橫斷面大小不大于600 μm×600 μm。而后，利用EM ACE600 高真空鍍膜儀（Leica，德國(guó)）對(duì)修樣拋光后的CN 樣品表面行真空噴金處理（厚度30 nm），采用連續(xù)切片掃描電鏡——Gemini300 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Zeiss，德國(guó)）［內(nèi)置了3ViewXP 超薄切片機(jī)（Gatan，美國(guó)）和Onpont背散射電子探測(cè)器（Gatan，美國(guó)）］對(duì)VCN 目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行三維圖像采集。

利用本課題組編寫(xiě)的MATLAB（Mathworks，美國(guó)）腳本對(duì)連續(xù)切片掃描電鏡采集的原始圖像的對(duì)比度與亮度進(jìn)行匹配、三維對(duì)齊重構(gòu)，并將數(shù)據(jù)集上傳至開(kāi)源圖像標(biāo)記工具WEBKNOSSOS以實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)瀏覽和標(biāo)記［25］，包括對(duì)叢細(xì)胞樹(shù)突的追蹤標(biāo)記以及支配于叢細(xì)胞胞體表面各類(lèi)神經(jīng)末梢突觸的體積標(biāo)記。所標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的三維可視化和量化均使用MATLAB 腳本完成。

2 結(jié)果

2.1 CN樣品的顯微觀察及其三維成像信息

在解剖顯微鏡下觀察到，小鼠CN 位于腦橋和延髓交界處的兩側(cè)，呈現(xiàn)橢圓狀隆起，其長(zhǎng)軸自前下方至后上方依次為VCN 和DCN，而AVCN 和PVCN 分別位于耳蝸聽(tīng)神經(jīng)殘端的前背側(cè)和后背側(cè)區(qū)（圖1）。通過(guò)進(jìn)一步解剖分離，我們獲得了包括完整CN 在內(nèi)的腦干組織，尺寸約為2.0 mm×2.0 mm×3.0 mm。最終，共制備了5 個(gè)CN 樣品用于后續(xù)的成像分析，X射線(xiàn)顯微鏡及連續(xù)切片掃描電鏡三維成像信息見(jiàn)表1。

圖1 顯微鏡下觀察小鼠CN的解剖位置Fig 1 Observation of anatomical location of CN in mice under microscope

表1 小鼠CN樣品的三維成像信息Tab 1 Three-dimensional imaging information of mouse CN samples

2.2 CN樣品的X射線(xiàn)顯微圖像及其解剖分區(qū)

采用X 射線(xiàn)顯微鏡對(duì)CN 樣品進(jìn)行斷層掃描，對(duì)所得圖像進(jìn)行三維重構(gòu)，得到具有細(xì)胞分辨率的CN三維圖像。CN 樣品尺寸為1.3 mm×1.5 mm×2.6 mm、體素0.7 μm。根據(jù)聽(tīng)神經(jīng)的特征分布和細(xì)胞密度，我們對(duì)CN 樣品的各個(gè)亞區(qū)進(jìn)行了劃分，其中VCN、DCN 以及聽(tīng)神經(jīng)（auditory nerve，AN）的空間分布如圖2A 所示。從樣品的矢狀面（圖2B）和冠狀面（圖2C）來(lái)看，聽(tīng)神經(jīng)主干和CN 神經(jīng)元胞體清晰可見(jiàn)；相比于其神經(jīng)氈，由髓鞘包裹的聽(tīng)神經(jīng)束經(jīng)鋨酸染色后呈現(xiàn)出較高的染色密度（即亮信號(hào)），而細(xì)胞胞體的染色密度相對(duì)較低（即暗信號(hào)），且樣品的解剖分區(qū)清晰可辨：AVCN 位于聽(tīng)神經(jīng)束較短的分支處，PVCN 位于長(zhǎng)分支的起始端；而DCN 則位于長(zhǎng)分支的末端，與PVCN由細(xì)胞密度較低的顆粒細(xì)胞亞區(qū)間隔。

圖2 CN樣品的X射線(xiàn)顯微成像Fig 2 X-ray microscopic imaging of CN samples

2.3 X射線(xiàn)顯微圖像和掃描電鏡圖像的結(jié)構(gòu)比對(duì)

在正式采集連續(xù)切片掃描電鏡的數(shù)據(jù)之前，本研究將修樣后CN 樣品表面的電鏡預(yù)掃描圖像與已采集的X射線(xiàn)顯微成像圖像進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，樣品表面的電鏡預(yù)掃描圖像（圖3A）與X 射線(xiàn)顯微成像的相應(yīng)層面圖像（圖3B）在特征結(jié)構(gòu)上（胞體及聽(tīng)神經(jīng)的特征分布）可完全吻合。繼而說(shuō)明，通過(guò)X射線(xiàn)顯微成像可精確定位目標(biāo)區(qū)域；同時(shí)，在其引導(dǎo)下可進(jìn)一步優(yōu)化連續(xù)切片掃描電鏡采集的目標(biāo)區(qū)域（VCN的叢細(xì)胞簇區(qū)域）。

2.4 VCN叢細(xì)胞及根蕾狀突觸的三維重構(gòu)

采用連續(xù)切片掃描電鏡采集并三維重構(gòu)的VCN 叢細(xì)胞簇區(qū)域的高分辨三維圖像數(shù)據(jù)集（圖4A），所 采集的CN 體積為114.3 μm×105.0 μm×105.0 μm，三維分辨率為10 nm×10 nm×50 nm。在此成像條件下，突觸的特征結(jié)構(gòu)（包括神經(jīng)遞質(zhì)囊泡、突觸后致密物）清晰可辨（圖4B），可作為突觸識(shí)別的依據(jù)。隨后，對(duì)叢細(xì)胞的樹(shù)突結(jié)構(gòu)進(jìn)行追蹤標(biāo)記，結(jié)果（圖4C）顯示叢細(xì)胞有1 個(gè)樹(shù)突，樹(shù)突末端有豐富的分支，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道相一致。從叢細(xì)胞胞體上各類(lèi)突觸的體積標(biāo)記（圖4C、4D）和三維重構(gòu)（圖4E、4F）來(lái)看，該細(xì)胞胞體受5 個(gè)大小相當(dāng)?shù)母贍钔挥|支配，共形成了348 個(gè)獨(dú)立的突觸活躍區(qū)（active zone）；此外，其還受來(lái)自59 個(gè)非聽(tīng)神經(jīng)來(lái)源的神經(jīng)末梢的97 個(gè)突觸支配。

圖4 VCN叢細(xì)胞簇的三維電鏡圖像數(shù)據(jù)集及相關(guān)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記與重構(gòu)Fig 4 Labeling and reconstruction of three-dimensional electron microscopic image dataset of VCN bushy cell cluster and related neural structures

3 討論

聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)具有持續(xù)、高頻、高保真?zhèn)鬟f信號(hào)的特點(diǎn)，這與一系列具有特殊結(jié)構(gòu)和生理功能的突觸緊密相關(guān)，其中包括耳蝸帶狀突觸、CN 根蕾狀突觸以及斜方體內(nèi)側(cè)核（medial nucleus of the trapezoid body，MNTB）的花萼狀巨突觸（calyx of Held），因此對(duì)各類(lèi)聽(tīng)覺(jué)突觸的超微結(jié)構(gòu)及電生理特性的研究對(duì)理解突觸傳遞的機(jī)制具有重要的意義。對(duì)于聽(tīng)覺(jué)突觸超微結(jié)構(gòu)的研究，既往主要是通過(guò)透射電鏡對(duì)手動(dòng)收集的連續(xù)超薄切片進(jìn)行成像及重構(gòu)。由于受到切片質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響，其重構(gòu)體積（如厚度）非常有限，常常僅有1～2 個(gè)完整細(xì)胞。近年來(lái)，高通量三維電鏡技術(shù)的發(fā)展大大提高了神經(jīng)組織三維圖像采集的效率，已在不同腦組織神經(jīng)連接組學(xué)的研究中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。如：SCHMIDT 等［26］利用三維電鏡成像量化分析大鼠內(nèi)側(cè)嗅皮層中局部單個(gè)軸突的突觸前突觸類(lèi)別，揭示了軸突徑路長(zhǎng)度依賴(lài)的突觸分類(lèi)現(xiàn)象；KARIMI 等［27］利用三維電鏡成像量化小鼠大腦皮層不同層梭形細(xì)胞頂樹(shù)突接受不同類(lèi)型突觸的獨(dú)特輸入圖譜，揭示不同梭形細(xì)胞在其頂樹(shù)突上所接受調(diào)控的神經(jīng)連接組學(xué)規(guī)則；GOUR 等［21］利用三維電鏡成像量化并揭示發(fā)育過(guò)程中小鼠體感皮層抑制性中間神經(jīng)元突觸產(chǎn)生的環(huán)路模式。同時(shí)，在神經(jīng)環(huán)路超微結(jié)構(gòu)的解析方面，光學(xué)成像的空間分辨率有限，電生理記錄局限于單個(gè)腦組織切片中的少量連接，傳統(tǒng)電鏡則受限于成像尺寸；而高通量三維電鏡成像具備大尺寸、高分辨率以及可三維成像等優(yōu)勢(shì)，可以獲得樹(shù)突徑路上不同部位和不同類(lèi)別的突觸密度、軸突徑路上所形成的突觸分布圖譜以及神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)等超微結(jié)構(gòu)的定量信息，因而能達(dá)到光學(xué)成像、電生理記錄以及傳統(tǒng)電鏡等成像手段無(wú)法實(shí)現(xiàn)的目的。在聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)研究領(lǐng)域，三維電鏡也越來(lái)越多地被應(yīng)用于耳蝸毛細(xì)胞和NMTB 中花萼狀巨突觸的形態(tài)及發(fā)育研究［28-31］，但將其應(yīng)用于CN 的研究尚未有報(bào)道，其瓶頸之一即為相關(guān)組織電鏡樣品的制備。而本研究在前期工作［20］的基礎(chǔ)上，首次實(shí)現(xiàn)了小鼠完整CN 三維電鏡樣品的制備，相比之前的工作其具有更大的體積以及組織的特異性。同時(shí)，本研究利用X射線(xiàn)顯微成像，對(duì)其染色效果進(jìn)行評(píng)估并對(duì)其目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行初步定位；成功采集了VCN 叢細(xì)胞簇區(qū)域的三維電鏡圖像，并在突觸分辨率下實(shí)現(xiàn)了VCN 中叢細(xì)胞及其表面的根狀蕾突觸和非聽(tīng)神經(jīng)來(lái)源突觸的追蹤和重構(gòu)。因此，本研究不僅證實(shí)了對(duì)小鼠CN 開(kāi)展三維電鏡研究的可行性，還提供了具體的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，包括CN 樣品的制備流程、X 射線(xiàn)顯微成像輔助的目標(biāo)區(qū)域定位以及三維電鏡的成像條件。

作為VCN 的主神經(jīng)元，叢細(xì)胞可通過(guò)根蕾狀突觸接受來(lái)自耳蝸聽(tīng)神經(jīng)的信號(hào)，然而具有不同自發(fā)放電速率以及蛋白表達(dá)的耳蝸聽(tīng)神經(jīng)在叢細(xì)胞上的整合方式目前仍不明確［8，32-33］。當(dāng)外周聽(tīng)力受到損傷，叢細(xì)胞上的根蕾狀突觸會(huì)發(fā)生一系列顯著的結(jié)構(gòu)改變并伴隨有突觸支配力度的下降，而這樣的改變是否具有聽(tīng)神經(jīng)亞型的特異性、如何影響叢細(xì)胞對(duì)聽(tīng)覺(jué)信號(hào)的響應(yīng)等有待深入的探索分析。已有證據(jù)表明，在成年正常聽(tīng)力以及老年性聾的小鼠CN叢細(xì)胞上，特異表達(dá)鈣視網(wǎng)膜蛋白（calretinin）和非表達(dá)該蛋白的聽(tīng)神經(jīng)可支配不同的叢細(xì)胞，但后者的占比在老年性聾小鼠中有大幅下降［34］。而在本研究中，我們對(duì)叢細(xì)胞的三維電鏡重構(gòu)不僅可以提供更具體的量化指標(biāo)，包括單個(gè)叢細(xì)胞上根蕾狀突觸和活躍區(qū)的數(shù)量以及非聽(tīng)神經(jīng)來(lái)源的突觸支配信息，同時(shí)其更大的重構(gòu)體積還可以將突觸的量化擴(kuò)展到叢細(xì)胞的樹(shù)突結(jié)構(gòu)或是可在叢細(xì)胞簇層面上開(kāi)展進(jìn)一步的研究。未來(lái)，如能將其他研究手段（如免疫金染色等）與三維電鏡成像技術(shù)結(jié)合，將有望回答更多的關(guān)于CN神經(jīng)環(huán)路的未解之疑。

耳鳴、耳聾、異常的聽(tīng)覺(jué)經(jīng)歷常伴隨有CN 突觸可塑性的改變［35-38］。利用三維電鏡量化這一改變并在神經(jīng)環(huán)路層面揭示其對(duì)聽(tīng)功能的影響，將有助于對(duì)相關(guān)疾病病理機(jī)制的研究。目前，對(duì)于因耳蝸嚴(yán)重畸形或蝸神經(jīng)發(fā)育不良而無(wú)法接受人工耳蝸植入的患者，聽(tīng)性腦干植入是聽(tīng)覺(jué)重建的唯一手段［39］，即可通過(guò)植入電極直接刺激CN 組織產(chǎn)生人工聽(tīng)覺(jué)。由于當(dāng)前研究者們對(duì)相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)、聽(tīng)神經(jīng)損傷后引起的CN 神經(jīng)環(huán)路可塑性改變等都缺少足夠的認(rèn)識(shí)，使得精準(zhǔn)刺激CN 神經(jīng)元、對(duì)聲信號(hào)進(jìn)行有效編碼的能力極為有限。但隨著三維電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，其或?qū)⑼苿?dòng)CN 神經(jīng)環(huán)路的相關(guān)研究，從而填補(bǔ)這一空白。