陳 鳴，張 靖

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院消化科，上海 200233

胃癌是常見的惡性腫瘤，雖然全球胃癌的發(fā)生率和死亡率在下降［1］，但是胃癌在我國(guó)仍位于惡性腫瘤死因的第3 位［2］。研究表明，除手術(shù)及放化療外，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、改善患者預(yù)后等方面也具有一定的作用。血根堿（sanguinarine，SAG）提取自中藥博落回（Macleaya cordata）及白屈菜（Chelidonium majus）等罌粟科植物。它是一種苯并菲啶類生物堿，具有廣譜的生物學(xué)活性，包括抗氧化、抗炎、抗增殖與促凋亡等［3］。此外，SAG 可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抗血管形成及轉(zhuǎn)移等發(fā)揮抗腫瘤作用［4］：其可通過(guò)失活胞內(nèi)磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB 或AKT）信號(hào)通路抑制急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)展和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］，還可通過(guò)抑制SHH（sonic hedgehog）/GLI（gliotactin）/NANOG（Nanog homeobox）通路抗胰腺癌干細(xì)胞特性［6］。我們的前期研究［7-8］亦發(fā)現(xiàn)，SAG 可抑制胃癌的生長(zhǎng)和侵襲。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）甲基化是真核生物中最常見的RNA 修飾方式，對(duì)mRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)、剪切、穩(wěn)定和翻譯具有重要作用［9-11］。m6A 甲基化修飾具有可逆性和動(dòng)態(tài)性，由甲基轉(zhuǎn)移酶［如甲基轉(zhuǎn)移酶3/14（methyltransferase 3/14，METTL3/14）、WT1 相關(guān)蛋白（WT1 associated protein，WTAP）等］起始，去甲基化酶［如肥胖相關(guān) 蛋 白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）、 烷 基 化 修 復(fù) 同 源 物5 （alkylation repair homolog 5，ALKBH5）等］還原及識(shí)別子［YTH 結(jié)構(gòu) 域 家 族 蛋 白1/2/3 （YTH domain family 1/2/3，YTHDF1/2/3） 和 YTHDC1/2 （YTH domain containing 1/2）］ 共同調(diào)控完成［12］。研究表明，METTL14通過(guò)m6A 甲基化修飾抑制造血干/祖細(xì)胞分化和促進(jìn)白血病發(fā)生［13］，以及通過(guò)上調(diào)與PMP-22相關(guān)的P53 效應(yīng)因子（P53 effector related to PMP-22，PERP）mRNA 的m6A 甲基化水平促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［14］。但同時(shí)也有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)METTL14對(duì)部分腫瘤表現(xiàn)出抑制作用。YANG等［15］發(fā)現(xiàn)METTL14可以通過(guò)下調(diào)癌基因長(zhǎng)鏈非編碼RNAXIST（X inactive specific transcript）抑制結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移；另有研究［16］發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白， mammalian target of rapamycin）信號(hào)通路抑制胃癌的增殖、侵襲和遷移。本研究通過(guò)觀察SAG 對(duì)METTL14表達(dá)及胃癌生長(zhǎng)、侵襲的影響，初步探索SAG 抗胃癌的分子機(jī)制，為胃癌的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑和儀器 SAG（純度≥99%）購(gòu)自上海源業(yè)生物科技有限公司，噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公 司， METTL14 的 小 干 擾RNA （si-METTL14）慢病毒載體及其空載對(duì)照si-NC慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master Mixture 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Transwell 試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司，抗METTL14 抗體［CL4254］（貨號(hào)ab220031）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司， 抗甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（貨號(hào)AB-P-R 001）購(gòu)自杭州賢至生物技術(shù)有限公司。PCR 引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)MA-6000）購(gòu)自美國(guó)Kray Technologies 公司，酶標(biāo)分析儀（型號(hào)BS-1101）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。紫外可見分光光度儀（型號(hào)V-5100）購(gòu)自上海元析儀器有限公司。

1.1.2 胃癌細(xì)胞系 人胃癌細(xì)胞系MGC-803、AGS均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SAG 處理細(xì)胞 用不同濃度SAG（0、10、20 μmol/L）處理胃癌細(xì)胞（MGC-803、AGS）48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 定量PCR TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green Master Mixture 試劑盒進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增。METTL14上、下游引物序列分別為5′-GAACACAGAGCTTAAATCCCCA-3′和5′-TGTCAGCTAAACCTACATCCCTG-3′。以人β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參對(duì)照，上、下游引物序列分別為5′-GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3′和5′-CCTGTAACAACGCATCTCATATT-3′。擴(kuò)增條件：93 ℃2 min預(yù)變性；然后按93 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃7 min 延伸。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.3 Western blotting 將約5×107個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，裂解細(xì)胞，提取蛋白，4 ℃14 170×g離心15 min，上樣20 μL進(jìn)行電泳；電轉(zhuǎn)至PVDF膜后封閉。先后滴加METTL14一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗?；瘜W(xué)發(fā)光底物加于PVDF膜上，凝膠成像系統(tǒng)照像。GAPDH蛋白二次雜交。70 ℃水浴洗膜30 min 后用同法以GAPDH 作為內(nèi)參對(duì)照，用紫外可見分光光度儀測(cè)量METTL14與GAPDH每個(gè)雜交圖像峰面積值，兩者峰面積值的比值代表METTL14蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染 在250 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種約1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后等待細(xì)胞貼壁，按胃癌細(xì)胞的慢病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值100，加入si-METTL14或si-NC 慢病毒載體感染胃癌細(xì)胞，48 h后換用含嘌呤霉素的培養(yǎng)液進(jìn)行抗性篩選7 d，然后以10 μmol/L SAG 或PBS 處理48 h。根據(jù)加入的慢病毒載體和處理的藥物將細(xì)胞分為si-METTL14+SAG組、si-NC+SAG組和si-NC+PBS組。

1.2.5 MTT 增殖實(shí)驗(yàn) 通過(guò)MTT 增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-METTL14+SAG 組、si-NC+SAG 組和si-NC+PBS 組細(xì)胞的增殖水平，具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［17］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) SAG 作用1 周，取si-METTL14+SAG 組、si-NC+SAG 組和si-NC+PBS 組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液，以每孔約1 000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。觀察細(xì)胞增殖情況，當(dāng)6 孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，PBS漂洗2 次。每孔加入4%多聚甲醛2 mL 固定細(xì)胞15 min。棄去固定液，加適量的結(jié)晶紫染液染色15 min，PBS 漂洗2 次，晾干后拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-METTL14+SAG組、si-NC+SAG組和si-NC+PBS組細(xì)胞的侵襲能力，具體實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［17］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SAG對(duì)胃癌細(xì)胞中METTL14表達(dá)的影響

利用不同濃度SAG（0、10、20 μmol/L）處理胃癌細(xì)胞（MGC-803、AGS） 48 h 后，定量PCR 和Western blotting 結(jié)果顯示，與對(duì)照組（0 μmol/L）比較，SAG 明顯上調(diào)METTL14的表達(dá)水平（均P<0.05），且呈一定濃度依賴性，僅AGS 細(xì)胞中20 μmol/L SAG 在蛋白水平未表現(xiàn)出明顯的上調(diào)作用（圖1）。

圖1 不同濃度SAG對(duì)胃癌細(xì)胞中METTL14表達(dá)的影響Fig 1 Effect of different concentrations of SAG on METTL14 expression in gastric cancer cells

2.2 敲減METTL14 對(duì)SAG 抑制胃癌細(xì)胞增殖的影響

si-METTL14載體或si-NC載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞（MGC-803、AGS） 后，定 量PCR 和Western blotting 檢 測(cè)METTL14mRNA和蛋白的表達(dá)水平（圖2A、B），發(fā)現(xiàn)si-METTL14載體顯著抑制了METTL14的表達(dá)（均P<0.01）。

MTT 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-NC+SAG 組胃癌細(xì)胞（MGC-803、AGS）增殖水平與si-NC+PBS 組比較被顯著抑制（均P=0.000），而si-METTL14+SAG組SAG 的抑制作用被部分逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞增殖水平高于si-NC+SAG 組，低于si-NC+PBS 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05，圖2C）。

圖2 敲減METTL14對(duì)SAG抗胃癌細(xì)胞增殖作用的影響Fig 2 Effect of knocking down METTL14 on the anti-proliferation activity of SAG in gastric cancer cells

2.3 敲減METTL14 對(duì)SAG 抑制胃癌細(xì)胞克隆形成的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與si-NC+PBS 組比較，si-NC+SAG 組胃癌細(xì)胞克隆形成能力被顯著抑制（均P<0.01）；而與si-NC+SAG 組比較，si-METTL14+SAG 組SAG 的抑制作用被部分逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞克隆數(shù)顯著增加（均P<0.05，圖3）。

圖3 敲減METTL14對(duì)SAG抗胃癌細(xì)胞克隆形成的影響Fig 3 Effect of knocking down METTL14 on the anti-colony formation capability of SAG in gastric cancer cells

2.4 敲減METTL14 對(duì)SAG 抑制胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與si-NC+PBS 組比較，si-NC+SAG 組胃癌細(xì)胞的侵襲能力被顯著抑制（ 均P<0.01）； 而 與si-NC+SAG 組 比 較， si-METTL14+SAG 組SAG 的抑制作用被部分逆轉(zhuǎn)，穿過(guò)基底膠（Matrigel） 的細(xì)胞數(shù)顯著增多（均P<0.05，圖4）。

圖4 敲減METTL14對(duì)SAG抗胃癌細(xì)胞侵襲潛能的影響Fig 4 Effect of knocking down METTL14 on the anti-invasion potential of SAG in gastric cancer cells

3 討論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后不良的主要原因之一。m6A甲基化修飾異常與胃癌預(yù)后及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。METTL3 和METTL14 都是m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶的主要構(gòu)成部分，但兩者對(duì)胃癌卻顯現(xiàn)出相反的作用。METTL3 可介導(dǎo)肝癌衍生生長(zhǎng)因子（hepatomaderived growth factor，HDGF）的m6A 甲基化修飾或通 過(guò) METTL3/ZMYM1 （zinc finger MYM-type containing 1）/E-cadherin（上皮鈣黏素）信號(hào)促進(jìn)胃癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成和轉(zhuǎn)移，而且是胃癌的一個(gè)潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［18-19］。m6A去甲基化酶FTO 通過(guò)抑制β1 整合素（integrin subunit β1，ITGB1）的m6A 甲基化修飾促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移［20］，且高表達(dá)FTO 和ALKBH1 與胃癌不良預(yù)后密切相關(guān)，是胃癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物［21］。我們前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，識(shí)別子YTHDF1 以m6A 依賴的方式介導(dǎo)去泛素 化 酶14 （ubiquitin-specific proteases 14，USP14）的翻譯，促進(jìn)胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移［22］。這些研究闡述了m6A甲基化修飾與胃癌之間的關(guān)系。

我們前期研究［7］還發(fā)現(xiàn)，SAG 通過(guò)調(diào)節(jié)雙特異性 磷 酸 酶4 （dual specificity protein phosphatase 4，DUSP4）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）通路抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。ZHU 等［23］人發(fā)現(xiàn)SAG 通過(guò)WNT/β-catenin 信號(hào)通路抑制與EMT 相關(guān)結(jié)腸癌的遷移和轉(zhuǎn)移。另有研究［24］揭示了SAG通過(guò)上調(diào)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3 （insulin like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。SAG 在多種消化系統(tǒng)腫瘤中均顯示出良好的抗癌潛力，但是其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度SAG對(duì)2種胃癌細(xì)胞株中的METTL14表達(dá)具有上調(diào)作用，且濃度越高，上調(diào)作用越明顯；同時(shí)SAG 可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性、克隆形成及侵襲潛能，但是敲減METTL14對(duì)SAG 的這些效果具有部分逆轉(zhuǎn)作用；由此推測(cè)，SAG 可能通過(guò)上調(diào)METTL14抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。后續(xù)本課題組將進(jìn)一步分析METTL14在人體胃癌及癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)水平，以及METTL14的表達(dá)量與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期及預(yù)后的關(guān)系。