陳紅鳳 馬笑晴 楊榮濤 唐萍 李淑旎 邵世豪 楊靜

摘要：【目的】解析稻瘟菌與水稻互作時(shí)的水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌形態(tài)發(fā)育和水稻防御響應(yīng)的影響，為生產(chǎn)上水稻稻瘟病綠色防控措施的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！痉椒ā坷?種水稻初級(jí)代謝物（多巴胺鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、酪胺、α-品烯、L-色氨酸和半乳糖醇）標(biāo)準(zhǔn)品按一定濃度處理稻瘟病菌株，觀察代謝物對(duì)稻瘟菌菌落生長和菌株形態(tài)發(fā)育（產(chǎn)孢、菌絲生長和附著胞形成等）的影響;在此基礎(chǔ)上，利用相同濃度的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品處理稻瘟菌侵染36和48 h時(shí)的感病水稻麗江新團(tuán)黑谷，進(jìn)行稻瘟病病害調(diào)查、防御基因表達(dá)分析、活性氧（ROS）含量和過氧化物酶（POD）活性等生理指標(biāo)測定?！窘Y(jié)果】除L-谷氨酰胺和L-色氨酸對(duì)生長第9 d的稻瘟病菌菌落生長有顯著影響外（P<0.05，下同），其余4種代謝物對(duì)稻瘟病菌菌落生長無顯著影響（P>0.05，下同）;6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌產(chǎn)孢有抑制作用，其中以酪胺和α-品烯的抑制效果最明顯;多巴胺鹽酸鹽顯著抑制稻瘟菌孢子的萌發(fā)，其余5種代謝物對(duì)稻瘟菌孢子萌發(fā)無顯著影響;6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌芽管生長有顯著的促進(jìn)作用;多巴胺鹽酸鹽和L-色氨酸對(duì)附著胞形成有明顯的促進(jìn)作用，L-谷氨酰胺和酪胺對(duì)附著胞形成具有抑制作用。6種水稻初級(jí)代謝物明顯降低稻瘟菌接種36和48 h時(shí)的水稻稻瘟病癥狀和病情指數(shù)，其中以多巴胺鹽酸鹽、酪胺和半乳糖醇對(duì)稻瘟病的控制效果最佳;6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌接種48 h時(shí)的稻瘟病控制效果高于其對(duì)接菌36 h時(shí)的水稻。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)多巴胺鹽酸鹽和半乳糖醇抑制了稻瘟菌侵染36和48 h水稻中茉莉酸（JA）信號(hào)基因OsCOI1a、OsCOI1b和OsMYC2表達(dá)，但JA抑制子基因OsJAZ9上調(diào)，誘導(dǎo)ROS相關(guān)基因OsRbohB和OsRbohA以及病程相關(guān)基因OsPR10a和OsPR5上調(diào)，其中以2種代謝物誘導(dǎo)稻瘟菌侵染48 h時(shí)水稻中的ROS相關(guān)基因和病程相關(guān)基因的表達(dá)量高于稻瘟菌侵染36 h時(shí)的感病水稻;多巴胺鹽酸鹽誘導(dǎo)稻瘟菌侵染36和48 h時(shí)的水稻中POD活性明顯增加，ROS含量有一定程度的增加。【結(jié)論】水稻初級(jí)代謝物通過影響稻瘟菌形態(tài)發(fā)育、誘導(dǎo)防御相關(guān)基因表達(dá)和POD活性增加等提高水稻抗瘟性，具有作為植物病害綠色防控激發(fā)子的潛力。

關(guān)鍵詞： 水稻;稻瘟病;代謝物;防御相關(guān)基因;綠色防控

中圖分類號(hào)： S511? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）01-0057-11

Effects of six metabolites on rice resistance to blast fungus， Magnaporthe oryzae

CHEN Hong-feng， MA Xiao-qing， YANG Rong-tao， TANG Ping， LI Shu-ni，

SHAO Shi-hao， YANG Jing*

（State Key Laboratory for Conservation and utilization of Bio-resources in Yunnan/Key Laboratory of

Agro-biodiversity and Pest Management of Ministry of Education/College of Plant Protection，

Yunnan Agricultural University，Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】Analyzing the effect of primary metabolites during interaction of rice and Magnaporthe oryzae on rice blast morphogenesis and defense response， to provide basic data for the formulation of green control measures for rice blast in production. 【Method】The six primary metabolites with a certain concentration （dopamine hydrochloride， L-glutamine， tyramine， α-pinene， L-tryptophan， galactinol） were used to treat the rice blast strains to observe the effects of metabolites on colony growth， strain morphology（sporulation， hypha germination and appressorium formation） of M. oryzae. On this basis， the same concentrations of metabolite standards were used to treat 36 h- and 48 h- infected rice to investigate symptom of rice blast disease， analyze defense gene expression， and detect? reactive oxygen species （ROS） content and peroxidase（POD） activity. 【Result】Except for L-glutamine and L-tryptophan， which had a significant effect on the growth of the rice blast fungus colony on the ninth day of growth （P<0.05， the same below）， the other four metabo-lites had no significant effect on the growth of the rice blast fungus colony （P>0.05）. Six kinds of primary metabolites of rice had inhibitory effect on sporulation of? M. oryzae， among which tyramine and α-pinene had the most obvious inhibitory effect. Dopamine hydrochloride significantly inhibited the spore germination of M. oryzae， while the other five metabolites had no obvious effect on the spore germination of M. oryzae. Six kinds of primary metabolites of rice could significantly promote the growth of germ tube of M. oryzae. Dopamine hydrochloride and L-tryptophan promoted appressorium formation， while L-glutamine and tyramine inhibited appressorium formation. Six kinds of primary metabolites in rice reduced the symptoms and disease index of rice blast at 36 and 48 h after inoculation with M. oryzae， among which dopamine hydrochloride， tyramine and galactitol had the best control effect on rice blast. The control effect of the six kinds of? primary metabolites on rice blast at 48 h was higher than that at 36 h. Further studies found that dopamine hydrochloride and galactitol inhibited the expression of jasmonic acid （JA） signaling genes OsCOI1a， OsCOI1b and OsMYC2 in rice at 36 and 48 h of rice blast fungus infection， but the JA repressor gene OsJAZ9 was up-regulated and induced ROS-related genes OsRbohB， OsRbohA and the disease-related genes OsPR10a， OsPR5 were up-regulated. Among them，the expression levels of ROS-related genes and disease course-related genes in rice induced by the two metabolites at 48 h of M. oryzae infection were higher than those in infected rice at 36 h after M.oryzae. Both metabolites inhibited JA signaling genes. Dopamine hydrochloride induced obvious increase in POD activity and a certain degree of increase in ROS content in rice at 36 and 48 h of M. oryzae infection. 【Conclusion】Metabolites can improve rice blast resistance of susceptible rice variety through affecting the morphological development of rice blast fungus， inducing the expression of defense-related genes and increasing POD activity in susceptible rice. Therefore， the six metabolites have potential applications in the green control of rice blast disease.

Key words： rice; rice blast disease; metabolites; defense-related genes; green control

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（31860483）; Yunnan Fundamental Research Pro-ject （202101AS070038）

0 引言

【研究意義】據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）報(bào)道，隨著全球人口的持續(xù)增長及對(duì)糧食需求的不斷增加，至2050年，全球糧食增長需達(dá)60%～100%才能滿足100億人口的糧食需求（Fróna et al.，2019）。當(dāng)前全球糧食生產(chǎn)受極端氣候、日益減少的可用耕地以及加劇的生物/非生物脅迫等的限制（Jaganathan et al.，2018;楊敏慎等，2021），而糧食產(chǎn)量和品質(zhì)的保證是實(shí)現(xiàn)糧食安全生產(chǎn)的基礎(chǔ)（張淑華等，2021），為此，2021年4月國務(wù)院新聞辦舉行的糧食和物資儲(chǔ)備發(fā)展情況發(fā)布會(huì)上首次將糧食安全戰(zhàn)略納入國家五年規(guī)劃（劉俊杰和馬鈞巧，2022）。水稻（Oryza Sativa）作為當(dāng)今世界及我國主要的糧食作物之一，每年因稻瘟病造成10%～30%的產(chǎn)量損失（Nalley et al.，2016），而化學(xué)防治帶來的一系列農(nóng)田生態(tài)污染和稻米農(nóng)殘等問題嚴(yán)重影響著稻米品質(zhì)。為保證糧食安全生產(chǎn)，除選育新的廣譜抗（逆）病水稻品種外，施用激發(fā)子進(jìn)行病害防治也是綠色、安全、有效的水稻病害防治方法。【前人研究進(jìn)展】植物在受到各種病原菌侵染時(shí)，除啟動(dòng)病原相關(guān)分子模式引發(fā)的免疫響應(yīng)（Pathogen-associated molecular patterns-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)蛋白引發(fā)的免疫響應(yīng)（Effector-triggered immunity，ETI）等分子機(jī)制抵御病原菌外，還會(huì)在其受侵染部位周圍產(chǎn)生各種特有代謝物，這些代謝物以信號(hào)分子的方式參與植物防御響應(yīng)（Kachroo and Robin，2013;Zaynab et al.，2019;陳燦等，2020，2021）。其中莽草酸、半乳糖醇、海藻糖、D-甘露糖、亞麻酸、多巴胺、酪胺和L-谷氨酰胺等初級(jí)代謝物與植物防御反應(yīng)和抗性增強(qiáng)有關(guān)（Duan et al.，2021）。如蘇氨酸在擬南芥抗病性中作為信號(hào)分子參與擬南芥防御響應(yīng)（Stuttmann et al.，2011）。α-品烯是一種揮發(fā)性芳香化合物，存在于多種食物和芳香植物（如薄荷）的精油中，具有抗氧化和抗真菌特性（Rudba?ck et al.，2012）。酪胺（Tyramine）是一種天然存在的單胺化合物和從氨基酸酪氨酸衍生的微量胺（Dhakal and Macreadie，2020），已有研究發(fā)現(xiàn)根腐病病菌侵染的大麥葉片中積累了酪胺，大麥防御反應(yīng)被激活（Ishihara et al.，2017）。糖信號(hào)分子在植物免疫響應(yīng)中發(fā)揮作用（Bolouri Moghaddam and Van den Ende，2012）。如半乳糖醇是棉子糖家族的合成前體，參與植物對(duì)非生物（干旱和溫度）和生物脅迫的響應(yīng)，在受到病原菌侵染的植物中顯著積累，參與植物對(duì)病原菌的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性（Meyer et al.，2018）。多巴胺是兒茶酚胺途徑的天然產(chǎn)物，植物中的多巴胺具有多種功能，能影響糖代謝，并在應(yīng)對(duì)非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Liang et al.，2018）。如多巴胺鹽酸鹽處理蘋果幼苗，減輕了干旱對(duì)蘋果幼苗生長的抑制作用，提高蘋果苗的光合作用和葉綠素水平;同時(shí)，多巴胺具有重要的抗衰老作用，外源施用100 μmol/L多巴胺鹽酸鹽可延緩干旱誘導(dǎo)的葉片衰老（Liang et al.，2018）。谷氨酰胺是一種重要的氨基酸，是所有生物體合成核苷酸和其他含氮化合物的主要氨基供體，作為信號(hào)分子參與植物防御響應(yīng)（Qiu et al.，2020）。除初級(jí)代謝物外，次生代謝物（酚、多元醇、糖苷和氮化合物等）同樣在植物應(yīng)對(duì)非生物和生物脅迫過程中發(fā)揮作用（Erb and Kliebenstein，2020），許多次生代謝產(chǎn)物如生物堿、酚類和類黃酮等在植物防御響應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Zaynab et al.，2018）。有研究發(fā)現(xiàn)吲哚硫甙生物合成缺陷的擬南芥突變體在Flg22處理后不再產(chǎn)生胼胝質(zhì)防御反應(yīng)，通過添加4-甲氧基-吲哚-3-基甲基硫代葡萄糖酸鹽能恢復(fù)胼胝質(zhì)形成（Clay et al.，2009），表明這種次生代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)防御響應(yīng)產(chǎn)生。此外，尿囊素、谷氨酸鹽、硫胺素、甘氨酸、絲氨酸和天冬酰胺等初級(jí)代謝物也可外源施用于植物，不僅能促進(jìn)植物生長，還能提高植物的抗性（Luo et al.，2018）。Duan等（2021）利用多巴胺鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、酪胺、α-品烯、L-色氨酸和半乳糖醇等6種水稻初級(jí)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品外源處理稻瘟菌侵染72 h時(shí)的感病水稻，可降低水稻稻瘟病癥狀。綜上，代謝物在植物與病原菌互作時(shí)的防御響應(yīng)中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，代謝物處理稻瘟菌對(duì)稻瘟菌形態(tài)發(fā)育（孢子、附著胞和菌絲生長等）的影響，及代謝物處理稻瘟菌侵染早期（36和48 h）的水稻，對(duì)稻瘟病癥狀的影響及其相應(yīng)的分子機(jī)制尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用6種水稻初級(jí)代謝物（多巴胺鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、酪胺、α-品烯、L-色氨酸和半乳糖醇）標(biāo)準(zhǔn)品按一定濃度處理稻瘟菌菌株，觀察水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌菌落生長和菌株形態(tài)發(fā)育（產(chǎn)孢、菌絲生產(chǎn)和附著胞形成等）的影響;進(jìn)一步利用6種水稻初級(jí)代謝物外源處理稻瘟菌侵染36和48 h時(shí)的感病水稻麗江新團(tuán)黑谷，觀察稻瘟病癥狀;在此基礎(chǔ)上，從生理和分子水平解析對(duì)稻瘟病控制效果最佳的代謝物對(duì)水稻防御體系的影響，為生產(chǎn)上水稻稻瘟病綠色防控措施的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試高感粳稻麗江新團(tuán)黑谷（LTH）幾乎對(duì)所有稻瘟病菌株敏感（凌忠專等，2001）。供試菌株為強(qiáng)致病性稻瘟菌95234I-1b，該菌株可引起抗病水稻Ilimibeyo出現(xiàn)稻瘟病病斑（Wang et al.，2019;Duan et al.，2021）。水稻品種麗江新團(tuán)黑谷和稻瘟病菌株95234I-1b均由省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1. 2 水稻育苗及稻瘟病菌接種

水稻育苗和稻瘟病菌接種方法參照Duan等（2021）的方法。水稻種子經(jīng)1.5%次氯酸鈉溶液消毒5 min，清水沖洗3～5遍，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽至露白后播種于滅菌的基質(zhì)土中。待水稻長至3葉1心期（約14 d）時(shí)用于稻瘟病菌接種。

挑取保存的95234I-1b菌絲塊于PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水1000 mL）上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)，將活化菌絲塊移至PDB液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL）中培養(yǎng)4～5 d有大量菌絲產(chǎn)生。將菌絲涂布于西梅汁培養(yǎng)基（西梅汁40 mL、酵母提取物1 g、 乳糖5 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水定容至1000 mL，pH 6.5）上，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱（12 h黑暗和12 h光照交替）中培養(yǎng)，至培養(yǎng)基表面長滿菌絲，刮去菌絲后再持續(xù)光照培養(yǎng)5 d，即可產(chǎn)生大量分生孢子。

配制孢子懸浮液，使孢子懸浮液濃度達(dá)1.5×105個(gè)孢子/mL，將孢子懸浮液噴霧接種于3葉1心期的水稻葉片上，置于培養(yǎng)箱中黑暗保濕24 h，然后置于28 ℃溫室中保濕培養(yǎng)，至第7 d時(shí)進(jìn)行病害調(diào)查。

1. 3 6種水稻初級(jí)代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度配制

參照Duan等（2021）報(bào)道的6種水稻初級(jí)代謝物酪胺、L-色氨酸、L-谷氨酰胺、半乳糖醇、多巴胺鹽酸鹽和α-品烯標(biāo)準(zhǔn)品外源處理植物時(shí)的濃度進(jìn)行配制，分別為1、0.01、0.35、0.5、0.01和0.0007 mmol/L。

1. 4 代謝物處理稻瘟病菌孢子和菌絲

1. 4. 1 代謝物母液制備 配制6種水稻初級(jí)代謝物酪胺、L-色氨酸、L-谷氨酰胺、半乳糖醇、多巴胺鹽酸鹽和α-品烯母液，濃度分別為146、98、137、110、105和147 mmol/L。

1. 4. 2 代謝物對(duì)稻瘟菌菌落生長的影響 將配制好的代謝物母液按一定體積分別加入冷卻至60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中搖勻倒平板，使6種水稻初級(jí)代謝物濃度達(dá)到Duan等（2021）報(bào)道的濃度。取培養(yǎng)4 d的稻瘟菌菌落邊緣處的菌絲塊放在上述含有相應(yīng)濃度代謝物的PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)3、6和9 d時(shí)測量稻瘟菌菌落直徑。以5塊相同大小的稻瘟菌菌絲塊放置于滅菌水代替代謝物的PDA培養(yǎng)基上作為對(duì)照。

1. 4. 3 代謝物對(duì)稻瘟菌產(chǎn)孢的影響 將配制好的代謝物母液按一定體積分別加入到冷卻至60 ℃左右的西梅汁培養(yǎng)基中搖勻倒平板。將搖好的稻瘟菌菌液均勻涂布于西梅汁上，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后用5 mL無菌水洗下孢子，制備孢子懸浮液并于血球計(jì)數(shù)板（16×25）上取4個(gè)角的中方格（100個(gè)小方格）統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：孢子數(shù)/mL=100個(gè)小方格孢子總數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù)。

1. 4. 4 代謝物對(duì)附著胞形成的影響 取10 μL經(jīng)6種代謝物處理后的孢子懸浮液均勻涂布于玻璃紙上，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、4、6、8和10 h后于顯微鏡下觀察孢子形態(tài)并拍照，然后分別統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢數(shù)、2 h的芽管萌發(fā)率和6 h的附著胞形成率。

1. 5 代謝物處理稻瘟菌接種36和48時(shí)的水稻

將配置制好濃度的6種水稻初級(jí)代謝物噴施到經(jīng)稻瘟菌95234I-1b接種36和48 h的麗江新團(tuán)黑谷水稻葉片上，以無菌水噴施的水稻葉片為對(duì)照，于接種第7 d時(shí)進(jìn)行水稻稻瘟病調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，稻瘟病病害調(diào)查和統(tǒng)計(jì)參照Duan等（2021）的方法。代謝物處理稻瘟菌接種36 h時(shí)的水稻，于接菌36、48、72、96和120 h取樣水稻葉片;代謝物處理稻瘟菌接種48 h時(shí)的水稻，于接菌48、72、96和120 h取樣水稻葉片。

1. 6 水稻防御基因表達(dá)分析

基因表達(dá)分析參照Wang等（2019）的方法，引物序列見表1。先將所取樣品根據(jù)TransZol UP試劑盒進(jìn)行總RNA提取，然后利用GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit TSK301M逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后利用2XTSINGKE? MasterqPCR Mix （SYBR Green I） TSE201（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。反應(yīng)體系20.0 μL：上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板0.5 μL，熒光染料10.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。65 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。試驗(yàn)重復(fù)3次。用2-△△Ct法對(duì)表1中所列基因的表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算分析，即基因的相對(duì)表達(dá)量=2-（Ct1-actinCt1）-（Ct2-actinCt2）。

1. 7 代謝物處理稻瘟菌侵染的水稻活性氧（ROS）和過氧化物酶（POD）測定

利用ELISA檢測試劑盒（上海極威生物科技有限公司）對(duì)經(jīng)代謝物處理的稻瘟菌接種水稻葉片進(jìn)行POD活性和ROS含量測定。利用液氮研磨水稻樣品，取0.1 g研磨后的樣品粉末放入1.5 mL離心管中，加入500 μL 1XPBS劇烈振蕩后4 ℃下10000 r/min離心20 min，取200 μL上清液備用。

加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品于標(biāo)準(zhǔn)品孔，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品3個(gè)重復(fù)，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線;樣品孔中加入10 μL上清液和40 μL樣品稀釋液，每種樣品3個(gè)重復(fù)，然后加入100 μL HRP，于37 ℃恒溫箱孵育60 min后洗板，加入反應(yīng)底物A和底物B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min后，加入終止液50 μL，置于波長450 nm酶標(biāo)儀（Varioskan LUX，美國）測定樣品OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行處理，運(yùn)用GraphPad Prism 8.0.2作圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟病菌菌落生長的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)酪胺、L-色氨酸、L-谷氨酰胺、半乳糖醇、多巴胺鹽酸鹽和α-品烯處理稻瘟菌接種72 h時(shí)的水稻能有效減輕水稻稻瘟病癥狀（Duan et al.，2021）。本研究進(jìn)一步利用上述6種水稻初級(jí)代謝物處理稻瘟病菌菌落，于處理后不同時(shí)間點(diǎn)（3、6和9 d）測量稻瘟病菌菌落直徑。結(jié)果（圖1）顯示，經(jīng)6種水稻初級(jí)代謝物處理的稻瘟菌在處理后3和6 d時(shí)菌落直徑與對(duì)照基本一致，差異不顯著（P>0.05，下同）;至處理后9 d時(shí)，除L-谷氨酰胺和L-色氨酸處理的菌落直徑顯著小于對(duì)照外（P<0.05，下同），其余4種代謝物處理的菌落直徑與對(duì)照差異不顯著。表明除L-谷氨酰胺和L-色氨酸對(duì)生長第9 d的稻瘟病菌菌落生長有顯著影響外，其余4種代謝物對(duì)稻瘟病菌菌落生長無明顯影響。

2. 2 6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟病菌菌株形態(tài)發(fā)育的影響

為明確水稻代謝物對(duì)稻瘟病菌菌株形態(tài)發(fā)育的影響，利用6種水稻初級(jí)代謝物處理稻瘟病菌，分析代謝物對(duì)稻瘟菌產(chǎn)孢、萌發(fā)率、芽管長度和附著胞形成等形態(tài)發(fā)育的影響。與對(duì)照相比，6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌產(chǎn)孢有抑制作用，其中酪胺和α-品烯顯著抑制了稻瘟菌產(chǎn)孢，其余4種代謝物均抑制了稻瘟菌產(chǎn)孢，但與對(duì)照未達(dá)顯著差異水平（圖2-A）;多巴胺鹽酸鹽顯著抑制稻瘟菌孢子的萌發(fā)，其余5種代謝物對(duì)稻瘟菌孢子萌發(fā)無顯著影響（圖2-B）;6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌芽管生長有顯著的促進(jìn)作用（圖2-C）;多巴胺鹽酸鹽和L-色氨酸對(duì)附著胞形成有明顯的促進(jìn)作用，L-谷氨酰胺和酪胺對(duì)附著胞形成具有抑制作用（圖2-D）。表明6種水稻初級(jí)代謝物均能影響稻瘟菌形態(tài)發(fā)育，其在稻瘟菌形態(tài)發(fā)育過程中起促進(jìn)或抑制作用。

2. 3 6種水稻初級(jí)代謝物處理稻瘟菌接種不同時(shí)間點(diǎn)的水稻對(duì)其稻瘟病癥狀的影響

為明確6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)感病水稻麗江新團(tuán)黑谷稻瘟病癥狀的影響，利用6種水稻初級(jí)代謝物處理稻瘟菌接種36和48 h時(shí)的麗江新團(tuán)黑谷，分析其對(duì)稻瘟病的控制效果。結(jié)果（圖3）顯示，與對(duì)照相比，6種水稻初級(jí)代謝物處理稻瘟菌接種48 h時(shí)的麗江新團(tuán)黑谷的稻瘟病癥狀明顯減輕、病情指數(shù)顯著降低，稻瘟病癥狀由急性型轉(zhuǎn)變成慢性型，其中以多巴胺鹽酸鹽和酪胺處理的控病效果最佳;6種水稻初級(jí)代謝物處理稻瘟菌接種36 h時(shí)的麗江新團(tuán)黑谷的稻瘟病癥狀減輕、病情指數(shù)顯著降低，稻瘟病癥狀由急性型轉(zhuǎn)變成慢性型，其中以半乳糖醇處理的控病效果最佳。表明6種水稻初級(jí)代謝物處理對(duì)稻瘟菌接種48 h時(shí)的感病水稻控病效果高于對(duì)接菌36 h時(shí)的感病水稻。

2. 4 多巴胺鹽酸鹽和半乳糖醇對(duì)稻瘟菌侵染的水稻防御相關(guān)基因表達(dá)的影響

依據(jù)6種水稻初級(jí)代謝物處理稻瘟菌侵染36和48 h時(shí)的水稻稻瘟病癥狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果，進(jìn)一步選取多巴胺鹽酸鹽和半乳糖醇處理稻瘟菌侵染36和48 h時(shí)的感病水稻，分析2種代謝物對(duì)水稻茉莉酸（JA）信號(hào)基因OsCOI1a、OsCOI1b、OsMYC2和JA抑制子基因OsJAZ9、ROS相關(guān)基因OsRbohA和OsRbohB及病程相關(guān)基因OsPR10a和OsPR5 表達(dá)的影響。

多巴胺鹽酸鹽處理稻瘟菌侵染36 h的感病水稻，分析接菌后36、48、72、96和120 h時(shí)的水稻防御相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsJAZ9在各測定時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)或顯著上調(diào)，OsCOI1b和OsMYC2 除96 h時(shí)顯著上調(diào)外，其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量與對(duì)照相近或顯著低于對(duì)照，OsCOI1a則被抑制（圖4-A）;OsRbohA在36和72 h時(shí)顯著上調(diào)，其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)被抑制或與對(duì)照相近，OsRbohB僅在36 h時(shí)顯著上調(diào)，其余4個(gè)時(shí)間點(diǎn)被抑制（圖4-B）;OsPR10a和OsPR5在36、72和96 h時(shí)顯著上調(diào)，在48和120 h時(shí)表達(dá)量被抑制或小幅上調(diào)（圖4-C）。多巴胺鹽酸鹽處理稻瘟菌侵染48 h的感病水稻，分析接菌48、72、96和120 h時(shí)的水稻防御相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsCOI1b在接菌48、96和 120 h顯著上調(diào)，OsCOI1a、OsMYC2和OsJAZ9在96 h時(shí)顯著上調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化不大（圖4-D）;OsRbohA在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量顯著上調(diào)，OsRbohB在48和96 h時(shí)顯著上調(diào)，72和120 h時(shí)的表達(dá)量被抑制或與對(duì)照相近（圖4-E）;OsPR10a和 OsPR5在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)（圖4-F）。

半乳糖醇處理稻瘟菌侵染36 h的感病水稻，分析接菌36、48、72、96和120 h時(shí)的水稻防御相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsJAZ9在各時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)，OsMYC2在接菌48、72、 96和120 h顯著上調(diào)，OsCOI1a和OsCOI1b在72 h略上調(diào)，其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量與對(duì)照相似或被抑制（圖4-G）;OsRbohA在72 h時(shí)顯著上調(diào)，其余4個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照相近或被抑制，OsRbohB僅在48和120 h時(shí)顯著上調(diào)，其余3個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照相近或被抑制（圖4-H）;OsPR10a在各時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)，OsPR5在36、72和96h時(shí)顯著上調(diào)，其余2個(gè)時(shí)間點(diǎn)被抑制（圖4-I）。半乳糖醇處理稻瘟菌侵染48 h時(shí)的感病水稻，分析接菌48、72、96和120 h時(shí)的水稻防御相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsJAZ9在接菌72、96和120 h時(shí)顯著上調(diào)，OsCOI1a和OsCOI1b在接菌72和96 h時(shí)顯著上調(diào)，其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化不大;OsMYC2在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與對(duì)照相近被抑制或（圖4-J）;OsRbohA和OsRbohB在48和96 h時(shí)表達(dá)量顯著上調(diào)，72 h時(shí)被抑制（圖4-K）;OsPR10a在72、96和120 h時(shí)顯著上調(diào)，OsPR5在72和96 h時(shí)顯著上調(diào)（圖4-L）。

綜上所述，OsRbohA和OsRbohB介導(dǎo)ROS產(chǎn)生及OsPR10a和OsPR5上調(diào)在2種代謝物處理稻瘟菌侵染48 h時(shí)的感病水稻中發(fā)揮作用，但JA防御響應(yīng)被抑制，其中2種代謝物誘導(dǎo)稻瘟菌侵染48 h時(shí)感病水稻中的OsRbohA、OsRbohB、OsPR10a和OsPR5的上調(diào)幅度高于2種代謝物誘導(dǎo)稻瘟菌侵染36 h時(shí)感病水稻，2種代謝物均抑制了JA信號(hào)基因表達(dá)。

2. 5 多巴胺鹽酸鹽對(duì)稻瘟菌侵染的水稻中ROS含量和POD活性的影響

在明確多巴胺鹽酸鹽顯著降低感病水稻稻瘟病癥狀和誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生相關(guān)基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，鑒于ROS清除與積累間的動(dòng)態(tài)平衡在植物與病原菌互作中能發(fā)揮重要作用（Tian et al.，2013），進(jìn)一步檢測多巴胺鹽酸鹽處理對(duì)稻瘟菌侵染36和48 h時(shí)的水稻中ROS含量及POD活性。與對(duì)照相比，多巴胺處理稻瘟菌侵染36 h的水稻中POD活性顯著上升（圖5-A），而ROS含量在36、72和96 h時(shí)增加（圖5-B）;多巴胺鹽酸鹽處理稻瘟菌侵染48 h的水稻中POD活性增加（圖5-C），而ROS含量僅在48 h時(shí)增加，其余時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照相近（圖5-D）。表明多巴胺鹽酸鹽通過誘導(dǎo)POD活性增加提高水稻抗瘟性。

3 討論

前期研究表明供試6種水稻初級(jí)代謝物多巴胺鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、酪胺、α-品烯、L-色氨酸和半乳糖醇能有效減輕稻瘟菌侵染72 h的抗病水稻的稻瘟病病斑數(shù)量（Duan et al.，2021），在此基礎(chǔ)上，本研究繼續(xù)深入分析6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌形態(tài)發(fā)育的影響及對(duì)感病水稻稻瘟病的控制效果。本研究發(fā)現(xiàn)6種水稻初級(jí)代謝物能有效抑制稻瘟菌產(chǎn)孢，而孢子是稻瘟病發(fā)生的要素之一，同時(shí)也是初侵染源之一，表明6種水稻初級(jí)代謝物在抑制稻瘟菌產(chǎn)孢以減少初侵染源方面發(fā)揮作用。

6種水稻初級(jí)代謝物能有效降低稻瘟菌侵染36和48 h時(shí)感病水稻麗江新團(tuán)黑谷稻瘟病癥狀，體現(xiàn)在其將稻瘟病病斑由急性型轉(zhuǎn)變成慢性型。急性型病斑發(fā)展快，是稻瘟病流行的先兆，而急性型病斑經(jīng)藥劑防治后轉(zhuǎn)變成慢性型病斑，使得病情發(fā)展趨向緩慢。為明確代謝物是否誘導(dǎo)水稻防御響應(yīng)，本研究依據(jù)OsRbohA和OsRbohB介導(dǎo)ROS含量增加來提高水稻抗瘟性（Shi et al.，2020），病程相關(guān)基因PR10a和OsPR5的高表達(dá)意味著植物抗性增強(qiáng)（Gravot et al.，2012;Lemarié et al.，2015）檢測了ROS相關(guān)基因和病程相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)以多巴胺鹽酸鹽和半乳糖醇為代表的代謝物確實(shí)可誘導(dǎo)OsRbohA和OsRbohB、OsPR10a和OsPR5上調(diào)，因此，本研究結(jié)果進(jìn)一步表明水稻初級(jí)代謝物可作為信號(hào)分子參與植物防御響應(yīng)（Stuttmann et al.，2011）。6種水稻初級(jí)代謝物誘導(dǎo)OsJAZ9高表達(dá)，卻抑制JA信號(hào)基因表達(dá)，表明代謝物抑制了JA防御響應(yīng)。H2O2和POD等在植物防御響應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Xu et al.，2016），但過量ROS積累會(huì)加速細(xì)胞衰老和死亡，而ROS解毒對(duì)活性氧動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要，POD在過量ROS解毒中發(fā)揮重要作用（Mittler et al.，2004;Tian et al.，2013）。本研究檢測到多巴胺鹽酸鹽代謝物誘導(dǎo)高的POD活性、誘導(dǎo)ROS含量早期增加、后期下降，表明代謝物可使感病水稻內(nèi)的ROS處于動(dòng)態(tài)平衡。

稻瘟菌是半活體寄生真菌，當(dāng)其孢子接觸水稻葉片表面后，在適宜條件下孢子會(huì)發(fā)芽，形成附著胞，16～20 h是附著胞穿透寄主角質(zhì)層侵入第1個(gè)細(xì)胞的時(shí)間，20～36 h是初生菌絲長滿侵入的第1個(gè)細(xì)胞的時(shí)間;36～48 h是次生菌絲長出并向臨近細(xì)胞擴(kuò)展的時(shí)間（Bhadauria et al.，2011;Nalley et al.，2016），此時(shí)為稻瘟菌活體營養(yǎng)期。本研究發(fā)現(xiàn)6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌侵染48 h的水稻稻瘟病控制效果顯著高于其對(duì)稻瘟菌侵染36 h的水稻，同時(shí)結(jié)合6種水稻初級(jí)代謝物對(duì)稻瘟菌菌落直徑無明顯影響，推測6種水稻初級(jí)代謝物可能對(duì)稻瘟菌活體營養(yǎng)期的次生菌絲有抑制作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)以多巴胺鹽酸鹽和半乳糖醇為代表的代謝物誘導(dǎo)稻瘟菌侵染48 h的水稻中ROS相關(guān)基因和病程相關(guān)基因表達(dá)量高于稻瘟菌侵染36 h的水稻中4個(gè)基因表達(dá)量，證實(shí)植物防御響應(yīng)在半活體寄生真菌的活體營養(yǎng)期激活是控制植物病害發(fā)生的關(guān)鍵（Chowdhury et al.，2017）。綜上，6種水稻初級(jí)代謝物可有效控制抗病和感病水稻稻瘟病癥狀，具有作為生產(chǎn)上植物病害綠色防控的潛在激發(fā)子的特性。

4 結(jié)論

水稻初級(jí)代謝物通過影響稻瘟菌形態(tài)發(fā)育、誘導(dǎo)防御相關(guān)基因表達(dá)和POD活性增加等提高水稻抗瘟性，具有作為植物病害綠色防控激發(fā)子的潛力，為安全、高效、綠色防治水稻稻瘟病提供了新思路。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）