滕 凱，張清壯，彭鏡先，陳前鋒，田明慧，巢 進，李 鑫*

1.湖南省煙草公司湘西自治州公司，湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市人民南路118號 416000 2.湖南省農業(yè)科學院，長沙市芙蓉區(qū)遠大二路892號 410128 3.湖南省蔬菜研究所，長沙市芙蓉區(qū)遠大二路890號 410128

作物生產過程常伴隨著過度施肥、集約灌溉和單一連作的現象，這會導致土壤品質下降，如土壤酸化、板結以及土傳病害的發(fā)生等［1-2］。為了有效緩解土壤酸化和控制土傳病害，曾嘗試短期淹水［3］、水旱輪作［4］以及使用化學殺菌劑［5］等措施。然而，這些措施對改良土壤的效果并不顯著，且耗費大量時間與費用［6-8］。而且，隨著人們對食品安全和環(huán)境污染的日益關注，傳統(tǒng)的且土壤消毒效果較好的化學殺菌劑也已逐漸被限制使用［9］。因此，尋找一種能夠同時控制土傳病害和克服土壤連作障礙的農業(yè)生產管理措施勢在必行［10］。對此，荷蘭和日本的學者提出了土壤強還原滅菌（Reductive soil disinfestation，RSD）的生物學方法，在土壤-植物-微生物的關系中創(chuàng)造有利于作物生長而不利于病原微生物繁殖的土壤環(huán)境條件，達到減少化學藥劑使用和解決土壤連作問題的目的［11-13］。

與傳統(tǒng)的物理化學方法相比，RSD技術具有環(huán)境友好、成本低廉等優(yōu)點。RSD處理是通過改變NH4+-N和NO3--N的相對比例來調節(jié)土壤pH，減輕土壤酸化問題［14］。此外，RSD處理能增加土壤中的總碳和總氮含量（質量分數），并將添加的有機質通過微生物分解為有機酸和小分子物質而提高土壤肥力，減少養(yǎng)分流失，緩解連作障礙［15-16］。在控制土傳病害方面，目前已有許多研究證實RSD處理能有效防治多種植物土傳病害，如由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的植物立枯病，青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病，疫霉屬（Phytophthora）真菌引起的植物晚疫病等［13］。其中，青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的細菌性青枯病是一種在世界范圍內發(fā)生廣泛的植物病害。近年來，煙草青枯病在我國主要產煙區(qū)的發(fā)病率呈明顯增長趨勢，成為煙草生產上重要的土傳病害，嚴重威脅煙草產業(yè)的安全和可持續(xù)發(fā)展［17］。目前關于植煙前后RSD處理土壤化學性質及微生物群落的變化尚鮮見報道。為此，采用RSD技術，以豆渣為有機物料，研究植煙前后RSD處理土壤化學性質及微生物群落結構及多樣性的變化，并對煙草農藝性狀和青枯病發(fā)病率進行調查，旨在為構建健康和諧的煙田生態(tài)系統(tǒng)以及RSD技術的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗地位于湘西土家族苗族自治州鳳凰縣煙區(qū)千工坪鎮(zhèn)（28°02'N，109°50'E），煙草連作多年且病害發(fā)生較嚴重。田間采用豆渣物料，總碳411.09 g/kg，全氮16.07 g/kg，物料被施入土壤前，已經過干燥、粉碎并過270μm孔徑的篩子。供試烤煙品種為當地主栽品種云煙87。

1.2 試驗設計

采用田間試驗，設置3個處理：CK1處理（原始土壤，不進行任何處理）；CK2處理（覆膜并飽和水分處理）；RSD處理（添加豆渣、覆膜并飽和水分處理）。每個處理3次重復，共9個小區(qū)，每個小區(qū)面積50 m2，各處理用田壟隔斷，總面積共450 m2。厭氧處理時間為冬閑時間段（2019年11月8日實施至2020年3月18日）。處理完成后，揭膜晾曬至無明顯水分時，在每小區(qū)中采用梅花布點法（7點）采集表層土壤樣品（0～20 cm），并將每小區(qū)樣品混合均勻作為1份土壤樣本。土壤取樣完成后種植煙草，其栽培管理和施肥措施均按當地優(yōu)質煙葉生產技術規(guī)范實施。煙葉成熟后，同樣采用梅花布點法（7點）采集煙株根系附近的表層土壤樣品，并將每小區(qū)樣品混合均勻作為1份土壤樣本。每份樣本均勻分成兩份，一份用于土壤化學性質指標的測定，另一份用于土壤微生物群落結構的分析。RSD處理結束時采集的土壤樣品分別標記為CK1、CK2和RSD。煙葉成熟后采集煙株根系周圍的土樣樣本，分別標記為CK1-C、CK2-C和RSD-C。

1.3 土壤化學性質指標的測定

按照文獻［18］描述的方法測定土壤pH、全氮、有效磷、速效鉀、有機質、NH4+-N和NO-3-N含量（質量分數）等理化性質指標：采用pH計測定土壤pH［18］；凱式定氮法測土壤全氮［18］；用0.5 mol/L NaHCO3溶液浸提后，采用鉬銻抗比色測定土壤有效磷［18］；用1 mol/L NH4OAc溶液浸提后，采用火焰分光光度法測定土壤速效鉀，采用重鉻酸鉀滴定法測定土壤有機質［18］；用2 mol/L KCl浸提并采用靛酚藍比色法測定土樣中NH4+-N含量，用飽和CaSO4·2H2O提取，酚二磺酸比色法測定土樣中NO3--N含量［18］。

1.4 土壤DNA提取與群落檢測

使用土壤DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?soil DNA kit（廣州飛揚生物工程有限公司）進行土壤微生物總DNA的提取。選擇16S rRNA基因高變區(qū)序列進行細菌群落測序，測序引物為338F（5'-ACTCC TACGGGAGGCAGCA-3'）/806R（5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'），測序區(qū)域為V3～V4區(qū)；真菌選擇ITS 1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）/ITS 2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）作為基因引物進行真菌群落測序，測序區(qū)域為ITS1區(qū)。然后進行PCR擴增，合并引物接頭，使用瓊脂糖電泳對PCR產物進行純化、定量和均一化并合成測序文庫。對建好的文庫進行質檢，并在Illumina MiSeq 2500平臺完成高通量測序［19］。

1.5 微生物多樣性分析

使用Fastp 0.19.6軟件進行微生物序列質量控制后，以97%序列相似性將剩余序列聚類到OTU中。再使用Qiime軟件將序列與Silva和Unite數據庫比對，并在各分類水平分析樣本的群落物種組成。采用Mothur 1.30.2軟件計算群落多樣性指數香農指數（Shannon）和群落豐富度指數Ace和Chao1?；贠TU豐度表計算微生物群落豐度組成，并用Origin 8.5軟件繪圖。采用Canoco 5軟件完成主坐標分析（PCoA）、主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）并繪圖。

1.6 煙株農藝性狀調查

在各處理中選擇具有代表性的5～10株煙株進行掛牌標記，按YC/T 142—2010［20］標準方法，定點定株在煙株旺長期測定煙株的農藝性狀指標，包括煙株的株高、莖圍、有效葉片數和最大葉面積。

1.7 病害調查

按GB/T 23222—2008［21］標準方法調查煙株青枯病發(fā)病情況，病害調查與烤煙農藝性狀指標測定同步進行。從煙株發(fā)病初期開始調查，每隔6 d調查1次，連續(xù)調查8次。

計算公式：

1.8 數據處理

使用Excel 2019軟件計算平均值與標準差，用SPSS 19.0軟件采用Duncan’s新復極差法進行處理間的差異顯著性檢驗。分別采用Excel及Origin 8.5軟件制表和繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對土壤pH與養(yǎng)分含量的影響

表1顯示：與CK1和CK2相比，RSD處理能顯著提高土壤pH，植煙后各處理土壤pH較植煙前變化不顯著。植煙前RSD處理的土壤NO3--N含量較CK1顯著降低，而土壤NH4+-N含量則增加，其中NO3--N含量RSD處理較CK1減少66.00%，NH4+-N含量RSD處理較CK1增加22.71%。此外，RSD處理土壤有效磷含量也顯著增加。植煙后RSD-C處理的有效磷、速效鉀和NH4+-N含量較CK1-C和CK2-C均有顯著提高，分別比CK1-C提高204.35%、37.57%和65.68%，分別比CK2-C提高70.40%、36.70%和34.60%。

表1 不同處理土壤p H和主要養(yǎng)分含量變化①Tab.1 Changes of soil pH and major nutrient contents under different treatments

2.2 不同處理對土壤微生物群落的豐富度和多樣性的影響

從18個土壤樣品中，分別得到885 485和1 026 323條細菌和真菌有效序列，總長度分別為370 370 081 bp和237 294 043 bp，片段平均長度分別為418 bp和231 bp。根據97%的相似度閾值對微生物群落進行聚類與物種注釋，共得到6 692個細菌OTUs和1 556個真菌OTUs。其中，細菌歸屬于44門，140綱，332目，516科，947屬和2 076種；真菌歸屬于14門，45綱，107目，221科，387屬和614種。

基于OTUs對微生物多樣性指數香農指數和豐富度指數Ace、Chao1指數進行估算。結果（表2）顯示，除RSD-C處理真菌群落Chao1顯著低于CK1外，其余土壤微生物群落豐富度指數無顯著差異。植煙前RSD處理土壤的細菌和真菌香農多樣性指數均顯著低于CK1，而植煙后RSD-C處理土壤的真菌香農多樣性指數則顯著降低。

表2 微生物群落多樣性和豐富度指數①Tab.2 Diversity and richness indexes of microbial communities

2.3 不同處理對土壤微生物群落結構的影響

2.3.1 細菌群落組成

不同處理細菌群落在門和屬水平的相對豐度如圖1所示。各處理中豐度大于1%的細菌門為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、Myxococcota、嗜甲基菌門（Methylomirabilota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、Latescibacterota、硝化螺旋菌門（Nitrospirota）（圖1A），表明植煙前后RSD處理土壤細菌門結構組成沒有改變，但優(yōu)勢種群比例發(fā)生明顯變化。在門水平上（圖1A），RSD處理土壤中的變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度與對照（CK1、CK2）相比存在顯著差異。其中，RSD處理土壤中酸桿菌門（Acidobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）的相對豐度顯著高于CK1和CK2，而變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度卻顯著低于CK1和CK2。在屬水平上（圖1B），植煙前RSD處理土壤中Flavisolibacter屬、芽胞桿菌屬（Bacillus）及糞球菌屬（Coprococcus）的相對豐度顯著高于CK1和CK2，而雷爾氏菌屬（Ralstonia）顯著降低。植煙后RSD-C土壤中Flavisolibacter、雷爾氏菌屬（Ralstonia）的相對豐度較CK1-C和CK2-C顯著減少，而芽胞桿菌屬（Bacillus）、糞球菌屬（Coprococcus）顯著增加。

圖1 細菌門（A）和優(yōu)勢菌屬（B）的相對豐度比較Fig.1 Relative abundances of bacterial phyla（A）and dominant genera（B）

2.3.2 真菌群落組成

不同處理真菌群落在門和屬水平的相對豐度如圖2所示。各處理主要真菌門包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）（圖2A）。在屬水平上（圖2B），RSD處理柄孢殼菌屬（Podospora）及被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度顯著增加，鐮刀菌屬（Fusarium）、絲核菌屬（Rhizoctonia）和原隱球菌屬（Saitozyma）的相對豐度顯著降低。植煙后RSD-C處理柄孢殼菌屬（Podospora）、毛殼菌屬（Chaetomium）和被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度顯著增加，而鐮刀菌屬（Fusarium）及原隱球菌屬（Saitozyma）的相對豐度則顯著降低（圖2B）。

圖2 真菌門（A）和優(yōu)勢菌屬（B）的相對豐度Fig.2 Relative abundances of fungal phyla（A）and dominant genera（B）

2.4 土壤微生物群落與土壤環(huán)境因子之間的關系

對環(huán)境因子與主要菌門進行PCoA、PCA和RDA分析，結果見圖3。由圖3a和3b可知，CK1和CK2的群落結構分別在細菌群落和真菌群落中表現相似，而RSD處理土壤菌群較CK1和CK2變化顯著。植煙后土壤處于好氧條件下，土壤中NH4+-N、有機質、速效鉀和有效磷含量顯著影響微生物的群落結構（圖3c和3d）。土壤環(huán)境因子與微生物優(yōu)勢菌門的RDA結果分析表明，微生物群落結構變化與環(huán)境因子間存在一定的相關性。細菌RDA分析（圖3e）發(fā) 現，土 壤NH4+-N與嗜甲基菌門（Methylomirabilota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）的變化呈正相關，土壤有機質、速效鉀、有效磷與放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）的變化呈正相關。真菌RDA分析（圖3f）發(fā)現，被孢霉門（Mortierellomycota）、子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）分別受土壤NH4+-N、全氮和有機質含量的影響較大。

2.5 不同處理對煙草農藝性狀和發(fā)病率的影響

不同處理煙草農藝性狀和發(fā)病率如表3所示。RSD處理土壤煙株株高、有效葉片數和最大葉面積均顯著高于CK1和CK2，分別較CK1增加3.6%、9.4%和9.3%，分別較CK2增加2.9%、8.0%和1.2%。RSD處理煙株發(fā)病率均顯著低于CK1和CK2，分別較CK1、CK2降低59.0%、49.6%。

表3 不同處理煙草農藝性狀和發(fā)病率比較①Tab.3 Agronomic traits and incidence rate of tobacco under different treatments

3 討論

長期連作會導致土壤養(yǎng)分含量減少以及土傳病原菌的發(fā)生，而對土壤進行單一淹水的物理消毒法所創(chuàng)造的厭氧環(huán)境下的微生物代謝活動較弱，不能有效改良土壤品質和抑制土傳病害［22］。研究表明，通過在厭氧環(huán)境中添加適量有機物料，不僅能夠在短時間內改善酸化土壤，而且還增加土壤養(yǎng)分含量［23］。本研究中RSD處理創(chuàng)造的強還原環(huán)境能使土壤pH顯著增加，表明RSD處理可緩解土壤酸化，與前人研究結果基本一致［24］。RSD處理土壤NH4+-N含量顯著增加，NO3--N含量顯著降低。其中，土壤NH4+-N含量的增加可歸因于RSD處理中有機物料的礦化導致NH4+-N的產生［24］，土壤中NO3--N含量降低則歸因于RSD處理創(chuàng)造的強還原土壤環(huán)境，促進NO3-的還原進而導致NO3--N含量降低［15，25］。RSD處理還可顯著提高土壤中有效磷含量，這可能是因為在RSD處理的土壤厭氧環(huán)境下，添加的有機物料被厭氧微生物分解，促進了有機磷向無機磷的轉化，從而增加土壤中磷的有效性［26-27］，這與劉亞男等［23］的研究結果相似。本研究中RSD處理的植煙土壤中的有效磷、速效鉀和NH4+-N含量較未處理和僅淹水覆膜處理土壤有所增加，同時，煙草的農藝性狀也得到了改善，其原因可能是土壤恢復好氧環(huán)境，經過RSD處理已經改變的土壤微生物群落對土壤中有機質的分解能力及養(yǎng)分活化能力增強［24，28］，從而增加土壤養(yǎng)分含量并改善煙草的農藝性狀，這與Huang等［28］在黃瓜上的研究結果一致。

本研究中PCoA分析結果表明，RSD處理后土壤微生物群落發(fā)生顯著變化，這一方面歸因于RSD處理在較短的時間內創(chuàng)造的強還原、厭氧和高溫等土壤環(huán)境［29］，另一方面是由于添加外源的有機物料所致。根據土壤環(huán)境因子與微生物群落之間的關聯分析（PCA、RDA）結果，RSD處理后土壤中養(yǎng)分含量發(fā)生變化也促進土壤微生物群落的改變。此外，RSD處理創(chuàng)造的特殊的強還原土壤環(huán)境還可殺滅土壤中一些病原微生物，這主要歸因于RSD處理土壤產生的一些有機酸和揮發(fā)性氣體等物質，他們對于病原微生物有顯著抑制作用［29］。在本研究中，雷爾氏菌屬（Ralstonia）的相對豐度及煙草青枯病發(fā)病率在RSD處理后顯著降低，這表明RSD處理有效抑制了雷爾氏菌屬（Ralstonia）的生長，這與Mowlick等［30］和劉亞男等［23］的研究結果相似。同時，RSD-C處理創(chuàng)造的厭氧土壤環(huán)境使煙株青枯病的發(fā)病率顯著低于未處理土壤以及僅淹水覆膜的土壤，這再次證明了RSD處理對土壤青枯病的顯著滅菌效果。

RSD處理后細菌的優(yōu)勢菌屬包括芽胞桿菌屬（Bacillus）、糞球菌屬（Coprococcus）和Flavisolibacter。已有研究證實了芽胞桿菌屬（Bacillus）在作物生長過程中具有拮抗病原真菌的作用［31］，且芽胞桿菌屬（Bacillus）作為一種可還原Fe3+和Mn4+的細菌，其代謝物（H2S、NH3、Fe2+和Mn2+）也具有殺滅病原體的效果［28，32］。同時，這些代謝物在土壤恢復有氧狀態(tài)時，H2S和NH3將被分解和硝化，而Fe2+和Mn2+將被轉化，因此不會對植物產生毒害作用［28，32］。糞球菌屬（Coprococcus）是有機酸的生產者，如乙酸、丁酸和丙酸［33］，這些酸類物質的產生也是RSD處理期間發(fā)揮消滅病原菌作用的關鍵因素［34］。此外，有研究表明Flavisolibacter在利用易分解有機碳源時能夠釋放多種功能酶，如葡β-萄糖苷酶（β-glucosidase）和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl-β-glucosaminidase），能夠輔助有機質的降解［35-36］。

此外，RSD處理顯著影響了真菌群落結構，其中柄孢殼菌屬（Podospora）及被孢霉屬（Mortierella）的相對豐度顯著增加。柄孢殼菌屬（Podospora）是健康土壤中含量最高的真菌屬之一［37］，可抑制植物黃萎病的發(fā)生［38］。被孢霉屬（Mortierella）對土壤養(yǎng)分轉化和有效性具有重要貢獻。例如，被孢霉屬（Mortierella）具有通過釋放多種有機酸來溶解土壤磷的潛力［39］，在果園土壤中添加被孢霉（Mortierellasp.）可顯著增加有效磷、鉀、鈣、鎂和硼含量［40］。這表明RSD處理能促進有益微生物群落的構建，降低土壤中的病原菌數量，增加土壤肥力從而為作物生長創(chuàng)造良好的土壤生態(tài)環(huán)境。

土壤滅菌處理完成后，隨著煙草的種植土壤微生物群落再次發(fā)生顯著變化，一是因為好氧環(huán)境的恢復以及高溫環(huán)境的消除［13］；二是因為在植物的生長過程中，植物根系釋放的分泌物具有一定能力驅動及選擇特定的微生物［14，41］。在本研究中，植煙后RSD-C處理中毛殼菌屬（Chaetomium）相對豐度顯著增加。毛殼菌屬（Chaetomium）作為一種需氧微生物，對許多植物病原菌具有潛在的生物防治作用，可作為土傳和種傳病原菌的拮抗物［42-43］，在生命活動過程中產生抗真菌化合物（如四氫呋喃）［44］，還可以通過重寄生作用、胞外酶溶菌作用、次生代謝產物的抑菌作用、誘發(fā)植物的保衛(wèi)反應等方式殺死病原菌［45-46］。本研究中還發(fā)現，RSD技術的關鍵在于有機物料與厭氧環(huán)境同時存在才能起到良好的滅菌效果，降低青枯病的發(fā)病率，同時改善煙草的農藝性狀。單純的淹水覆膜處理（CK2）創(chuàng)造的厭氧環(huán)境并不能起到改良土壤的效果，這與朱同彬等［24］的研究結果相似。

4 結論

①應用RSD技術可顯著影響植煙土壤pH及養(yǎng)分含量，即RSD處理可增加土壤NH4+-N及有效磷養(yǎng)分含量，提高土壤pH。②RSD技術可顯著影響植煙土壤的微生物群落結構組成，RSD處理后的土壤中Flavisolibacter、芽胞桿菌屬（Bacillus）、糞球菌屬（Coprococcus）、柄孢殼菌屬（Podospora）和被孢霉屬（Mortierella）等功能微生物菌屬的相對豐度顯著提高，而青枯病致病菌屬如雷爾氏菌屬（Ralstonia）的相對豐度顯著降低。植煙后土壤中有益微生物群落豐度仍然維持較高水平。③RSD處理植煙土壤可通過改善土壤理化性質及土壤微生物群落結構來改善煙株農藝性狀從而降低煙株青枯病的發(fā)病率。