周 雙，孫 偉，楊 光，焦奎寶，王明潔，唐 克，吳雨蹊，孫毅民，高 媛

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄉(xiāng)村振興科技研究所，哈爾濱 150027）（2 黑龍江工商學(xué)院）

內(nèi)源激素是植物體中重要的活性物質(zhì)，它參與并調(diào)控植物整個生長發(fā)育過程。植物體中有多種內(nèi)源激素，且每種激素的調(diào)控作用不盡相同[1-3]。吲哚乙酸（IAA）具有促進生長的作用，通過不同濃度調(diào)整其在植物不同的部位產(chǎn)生的發(fā)育效應(yīng)，并且不同的組織對IAA 濃度的反應(yīng)差異很大。此外，吲哚乙酸與其他激素相互作用，從而刺激或抑制各種發(fā)育過程，在各種酶反應(yīng)、細胞分化至形態(tài)建成都起到至關(guān)重要作用[4]。赤霉素（GA）的典型生理作用就是促進細胞的伸長從而促進生長，并在種子萌發(fā)到開花結(jié)果等植物的各種生理現(xiàn)象中發(fā)揮重要作用。赤霉素在果樹上應(yīng)用廣泛，可誘導(dǎo)無核果實，打破芽休眠，防止落果，調(diào)控植株衰老等過程[5-7]。脫落酸（ABA）主要的生理作用是促進休眠、抑制植株生長[8]，脫落酸在植物體內(nèi)分布廣泛。另外，脫落酸是誘導(dǎo)花芽分化、提高抗逆性的重要物質(zhì)[9]。玉米素（ZT）作為細胞分裂素的一種，對植物生長發(fā)育過程的作用非常廣泛，從基因水平、生理生化水平、細胞水平以至整株發(fā)育水平都有深刻的影響。玉米素可以刺激細胞的分裂分化，并且在解除休眠、打破頂端優(yōu)勢、調(diào)配養(yǎng)分、抑制衰老[10]、促進黃化幼苗中葉綠體的成熟等方面起著重要作用。玉米素通常與生長素協(xié)同作用，在有生長素存在時，不同濃度的細胞分裂素不僅在培養(yǎng)煙草髓組織時促進根、莖干生長，還能使非機體形成胼胝體，促進植物生長。

植物激素對植物的萌發(fā)、細胞分化、花芽分化、果實成熟等生理活動起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。檢測植物內(nèi)源激素的常用方法有：氣相色譜法（GC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）和高效液相色譜法（HPLC）等[10]。GC 法是分析植物中乙烯含量最普遍的方法；ELISA 法具有操作簡單、快速、敏感性高的特點，但重現(xiàn)性差、易交叉感染、不能同時分析多種激素，在精確定量測定方面存在不足；HPLC-MS 法可以直接分析激素，分析速度快，定性分析結(jié)果可靠，但儀器的高成本阻礙了其更廣泛的應(yīng)用；GC-MS 法廣泛應(yīng)用于有機物的現(xiàn)場分析檢測，定量分析精度高，定性能力高，但維護成本高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對實驗人員操作具有較高要求[11]；HPLC 法較其他方法具有靈敏度高、選擇性強、重復(fù)性好和分析速度快等特點，被廣泛用于植物激素的測定[12]。

芽的休眠由內(nèi)源激素控制，休眠的起始、萌發(fā)和調(diào)控以及休眠階段的改變均受激素調(diào)節(jié)[13]。果樹花芽分化的相關(guān)激素研究已有相關(guān)報道[14-17]，但葉芽萌發(fā)過程中內(nèi)源激素變化卻鮮有報道。李葉芽屬于純芽，存在2 種著生形態(tài)，一是單純的葉芽，二是復(fù)芽中與花芽伴生的葉芽（復(fù)葉芽），李葉芽萌發(fā)是李樹枝葉形成的基礎(chǔ)，葉芽萌發(fā)的質(zhì)量影響樹體的生長發(fā)育，通過研究李樹葉芽萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量的變化情況，以探究內(nèi)源激素在葉芽萌發(fā)過程中的變化規(guī)律及各激素所起的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于黑龍江省綏棱縣城西1 km，地處北緯47°14′，東經(jīng)127°06′，海拔202.7 m。屬大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫1.4 ℃，1 月平均氣溫-22.6 ℃，7 月平均氣溫21.8 ℃，有效積溫2 200～2 400 ℃（≥10 ℃），無霜期118.2 d，平均年降水量551.5 mm。土壤為淋溶黑鈣土，較黏重，pH值為6.8～7.3，有機質(zhì)含量4.04%～4.16%。

1.2 試驗材料

供試材料采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄉(xiāng)村振興科技研究所綏棱基地綏李3 號試驗園，試材為成齡綏李3 號李樹上的葉芽。綏李3 號是由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄉(xiāng)村振興科技研究所經(jīng)有性雜交選育而成，樹姿較直立，萌芽力強，成枝力中等；抗寒、豐產(chǎn)，以花束狀果枝結(jié)果為主。果實圓形，大而整齊，平均單果重48.4 g，最大果重84.0 g；果肉黃色，纖維少，汁多、味甜，有香氣，可溶性固形物含量16.6%；核小、黏核；較耐貯運。該品種是黑龍江省的主栽品種之一，此外，吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆等地都有栽培。

分別于2020 年4 月7 日（李芽休眠即將結(jié)束）、4 月14 日（葉芽即將萌動，芽鱗片松動）、4 月21日（葉芽鱗片開裂）、4 月28 日（葉芽加長變大，芽尖出現(xiàn)前）、5 月5 日（葉芽出現(xiàn)芽鞘）、5 月12 日（葉芽芽尖顯現(xiàn)綠色）采集純?nèi)~芽、復(fù)葉芽，共取樣6 次。取樣后樣品立即置于液氮中，于-80 ℃冰箱中保存，待測。

測試試劑：吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）、玉米素（ZT）的標準品均購自美國Sigma 公司。標樣稀釋濃度：IAA（1.000、0.500、0.250、0.125、0.050 g/L），GA（20.0、10.0、5.0、2.5、1.0 g/L），ABA（0.100、0.050、0.025、0.012 5、0.005 g/L），ZT（0.100、0.050、0.025、0.012 5、0.005 g/L）。

1.3 試驗方法

利用高效液相色譜法（HPLC）對IAA、GA、ABA、ZT 的含量進行測定。儀器為日本島津高效液相色譜儀LC-2010HT。流動相配制：分別量取甲醇45 mL、超純水55 mL 混勻溶解。HPLC 液相條件：色譜柱為SymmetryRC18 柱，3.5 μm，4.6 mm×75 mm，進樣量為10 μL，流速：0.7 mL/min，檢測波長：254 nm，柱溫：30 ℃。檢測器：氫離子火焰檢測器。

稱取葉芽0.5 g 冰浴研磨后加入20 mL 預(yù)冷的80%甲醇，在4 ℃冷浸過夜。抽濾2 次，合并濾液，40 ℃氮吹至無甲醇。加入30 mL 石油醚萃取脫色2次，保留水相。水相pH 值調(diào)至6.4，加0.5 g PVP，超聲30 min，抽濾。濾液pH 值調(diào)至2.9，用30 mL乙酸乙酯萃取3 次，合并酯相，減壓濃縮。45%甲醇溶解，并定容至2 mL，用0.45 μm 微孔濾膜過濾。待測液保存在4 ℃冰箱中。

取待測液10 mL，在選定的色譜條件下置于高效液相色譜儀，測定各激素的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel 進行統(tǒng)計并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉芽中內(nèi)源激素含量的變化

由圖1-A 可以看出，純?nèi)~芽中IAA 含量總體呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在芽鱗片松動前有一個大幅提升（4 月14 日），達到最大值，為98.05 μg/g，較初始值提高了251.43%。IAA 含量的這種變化發(fā)生在鱗片松動前，葉芽鱗片松動是葉芽即將萌發(fā)、開始生長的一個重要形態(tài)變化，說明葉芽在鱗片松動這樣重要的形態(tài)變化前需要較高水平的IAA 作基礎(chǔ)，當(dāng)高濃度IAA 成功激發(fā)了重要形態(tài)變化，葉芽進入萌發(fā)狀態(tài)后，低水平的IAA 即可維持葉芽的后續(xù)生長發(fā)育，IAA 含量隨后降低。芽尖出現(xiàn)前（4月28 日）IAA 含量又有一個小幅上升，可能葉芽芽尖的出現(xiàn)也是葉芽生長的一個較重要的形態(tài)變化，同葉芽鱗片開裂一樣，需要一定濃度的IAA 作基礎(chǔ)。IAA 含量的升高和降低，是為了保證葉芽重要形態(tài)變化的需求，維持葉芽的正常發(fā)育和生長。復(fù)葉芽與純?nèi)~芽的變化相似，但復(fù)葉芽中的IAA 含量的提升較純?nèi)~芽晚一些，高峰出現(xiàn)在鱗片開裂時的4 月21 日，含量為68.83 μg/g，較初始值提高了20.59%。

圖1 不同葉芽中內(nèi)源激素含量的變化

由圖1-B 可知，不同葉芽中的GA 含量的變化趨勢不盡相同。純?nèi)~芽中GA 含量呈現(xiàn)先升高后降低的單峰趨勢，在整個葉芽萌發(fā)期間對GA 的需求量都比較高，其中在葉芽鱗片開裂時期（4 月21 日）對GA 需要最多，其值為379.24 μg/g，較初始值提高了477.67%。復(fù)葉芽由于受到花芽的影響，使得復(fù)葉芽在萌發(fā)期間GA 的含量呈現(xiàn)M 形變化趨勢，其2 次升高分別在4 月14 日（葉芽即將萌動）和5月5 日（葉芽出現(xiàn)芽鞘），其值分別為330.80、294.22 μg/g，分別較初始值提高了157.55%、129.07%。并且在整個萌發(fā)期間復(fù)葉芽對GA 的需求早于純?nèi)~芽，需求量也普遍高于純?nèi)~芽。說明GA 在葉芽萌發(fā)中期起著關(guān)鍵作用。

由圖1-C 可看到，不同葉芽的ABA 含量變化有明顯不同。ABA 在2 種葉芽中，前期含量均在較高水平，這可能是李芽休眠狀態(tài)的正常含量（4 月7 日各芽均處于休眠狀態(tài)），隨著芽的形態(tài)變化，ABA 含量開始發(fā)生變化。純?nèi)~芽中的ABA 含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，在4 月14 日下降到最低，在為萌發(fā)做準備；在激發(fā)了葉芽萌發(fā)的啟動因子后，ABA 含量急劇升高，在4 月21 日，其含量從 11.91 μg/g 升高到 75.49 μg/g，提高了533.84%，可能是葉芽鱗片松動與脫落需要一定含量的ABA；隨后一直緩慢下降，則是葉芽開始進入平穩(wěn)、緩慢生長期，對ABA 的需求降低。復(fù)葉芽呈現(xiàn)先升高后降低再升高再降低的趨勢，分別在4月14 日和4 月28 日有2 個躍升，含量分別為62.34、82.20 μg/g，分別較初始值升高了20.53%、58.93%。最大的躍升時期比純?nèi)~芽出現(xiàn)的晚些，這2 個躍升期均在純?nèi)~芽中的ABA 下降時出現(xiàn)，可能也是因為復(fù)葉芽與花芽相鄰緊密，為保證花芽的正常生長發(fā)育而出現(xiàn)的自我調(diào)節(jié)，同時也驗證了葉芽的生長勢要比花芽強。葉芽在一定時期通過改變ABA 含量控制自身長勢，來保證花芽的正常生長發(fā)育。

由圖1-D 可知，不同葉芽的ZT 含量變化明顯不同。純?nèi)~芽內(nèi)的ZT 含量先下降后小幅度升高再逐漸下降；復(fù)葉芽內(nèi)的ZT 含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。純?nèi)~芽和復(fù)葉芽均在4 月21 日出現(xiàn)躍升，這一時期正是葉芽鱗片開裂時期，說明ZT 在葉芽的萌動中期起著重要的作用，葉芽萌動需要ZT 一定的濃度作為保證。復(fù)葉芽中的ZT 含量在4 月21日躍升幅度較大，含量為124.46 μg/g，較初始值提高了712.93%，可能是因為受緊密相鄰的花芽的影響，它的萌發(fā)需要更高濃度的ZT 來激發(fā)。2 種葉芽在萌動發(fā)育迅速時期（4 月14—28 日）細胞分裂旺盛，對ZT 的需求量均較大。

2.2 內(nèi)源激素含量的比值對葉芽的影響

植物的生長發(fā)育不是激素單獨作用的結(jié)果，而是多個激素通過改變其比值從而協(xié)調(diào)或拮抗作用反應(yīng)到發(fā)育過程。通常促進型激素GA 和IAA 與抑制型激素ABA 的比值能夠反映植物的生長狀態(tài)，比值高說明促進型激素占優(yōu)勢，植物加速生長；比值低說明抑制型激素占優(yōu)勢，植物生長緩慢或處于休眠狀態(tài)[18]。

試驗結(jié)果表明，純?nèi)~芽（IAA＋GA）/ABA 的值呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，如圖2-A 所示。在葉芽萌動初期（4 月7—21 日），純?nèi)~芽生長旺盛，IAA 和GA 總含量比較占優(yōu)勢，并在4 月14 日出現(xiàn)生長高峰，4 月21 日鱗片開裂后，葉芽生長稍緩；5 月5 日（葉芽出現(xiàn)芽鞘）后，葉芽萌發(fā)生長加快，對促進型激素需求再次增加。由于復(fù)葉芽受花芽影響，整個萌發(fā)期間，（IAA＋GA）/ABA 的值呈現(xiàn)M形變化趨勢，在4 月14 日，出現(xiàn)第1 個生長高峰，但（IAA＋GA）/ABA 的值均低于純?nèi)~芽，在5 月5日出現(xiàn)第2 個生長高峰，比值高于純?nèi)~芽，說明復(fù)葉芽在萌發(fā)過程中是初期較緩，后期生長迅速。

圖2 不同葉芽中內(nèi)源激素含量比值的變化

從圖2-B 可以看出，在整個葉芽萌發(fā)過程中（4月7 日至5 月5 日），純?nèi)~芽ZT/ABA 的值呈現(xiàn)下降趨勢，說明ZT 與ABA 的比值對純?nèi)~芽萌發(fā)的影響較小。然而復(fù)葉芽ZT/ABA 的值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且變化范圍較大，說明在萌動中期ZT與ABA 的比值對復(fù)葉芽影響較大，并且至關(guān)重要。

3 結(jié)論與討論

2 種葉芽中的IAA 含量變化的總趨勢是下降，葉芽形態(tài)變化前的啟動因子需較高水平的IAA 來啟動，啟動后則需求降低。IAA 并不是在形態(tài)變化過程中發(fā)揮最大作用，而是在形態(tài)變化之前就已經(jīng)開始積累，達到最高值，激發(fā)形態(tài)變化的啟動因子時，IAA 發(fā)揮最重要作用。IAA 與其他激素的協(xié)同作用可能是調(diào)節(jié)葉芽萌發(fā)的方式。不同葉芽對IAA濃度的反應(yīng)存在差異，由于復(fù)葉芽是與花芽伴生，在萌發(fā)時，受花芽的影響，其含量變化較純?nèi)~芽遲緩。

試驗研究表明，GA 與落葉果樹芽休眠和萌發(fā)之間存在緊密聯(lián)系[19]。本試驗發(fā)現(xiàn)，2 種葉芽在萌發(fā)過程中對GA 需求量較大，這證實了GA 在抑制芽的休眠、促進芽的萌發(fā)中具有重要作用。不同葉芽在萌發(fā)的不同階段對GA 的需求也存在差異，純?nèi)~芽中GA 的含量呈現(xiàn)先升高后降低的單峰趨勢，而復(fù)葉芽在萌發(fā)期間GA 含量呈現(xiàn)M 形變化趨勢，說明葉芽的萌發(fā)不是單純依靠GA，而是通過多種激素平衡互作的結(jié)果。

關(guān)于ABA 與葉芽萌發(fā)的關(guān)系，本試驗發(fā)現(xiàn)，在葉芽萌發(fā)過程中ABA 呈現(xiàn)逐漸升高再降低的趨勢，說明解除休眠并未帶來ABA 的降低，ABA 與其他激素相互作用而起到調(diào)節(jié)葉芽萌發(fā)和營養(yǎng)物質(zhì)加速積累的作用，在葉芽形態(tài)分化期間起到促進作用。

曾輝等[20]研究澳洲堅果內(nèi)源玉米素與其花芽分化關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，其葉片、枝條和細根中較高濃度的ZT 有利于花芽的分化。在本試驗中，ZT 在2 種葉芽的萌發(fā)前期需求較低，在萌發(fā)中期需求量增加，然而后期又降低，尤其復(fù)葉芽受花芽影響對ZT 的需求更大，說明ZT 是在葉芽萌發(fā)中期起著重要作用。在本試驗中還發(fā)現(xiàn)，復(fù)葉芽在萌發(fā)中期對ZT的需求量遠高于純?nèi)~芽，說明復(fù)葉芽受花芽的影響較大。

葉芽的萌發(fā)不僅是單一激素作用，而是多個激素協(xié)同作用的結(jié)果，（IAA＋GA）/ABA 的值對2種葉芽的影響存在差異。純?nèi)~芽在萌動前期（IAA＋GA）與ABA 的比值較高，中后期逐漸降低，說明促進型激素在萌芽前期占主導(dǎo)作用，有利于葉芽打破休眠，促進萌發(fā)。而促進型激素對復(fù)葉芽促進作用分2 個階段，前期生長稍緩，后期生長迅速，這與鄰近花芽有關(guān)。

在整個葉芽萌發(fā)過程中，純?nèi)~芽ZT/ABA 的值呈現(xiàn)下降趨勢，說明ZT 與ABA 的比值對純?nèi)~芽萌發(fā)的影響較小。然而復(fù)葉芽ZT/ABA 的值在萌動中期變化較大，說明受花芽影響，復(fù)葉芽對ZT 與ABA的比值需求增加，調(diào)動更多養(yǎng)分促進細胞分裂，從而利于自身萌發(fā)。