崔繼來，周 潔 ，周倩倩，范靜怡，劉國峰

(信陽師范學(xué)院 a. 生命科學(xué)學(xué)院; b. 河南省茶樹生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 信陽 464000)

0 引言

信陽毛尖茶是中國十大名優(yōu)綠茶之一，主產(chǎn)于河南省信陽市，以“細(xì)圓緊直多白毫、香高味濃湯色綠”的品質(zhì)特征備受消費(fèi)者喜愛。信陽毛尖茶優(yōu)異的品質(zhì)源于其非揮發(fā)性品質(zhì)成分和揮發(fā)性品質(zhì)成分，其中非揮發(fā)性品質(zhì)成分主要和滋味有關(guān)，而揮發(fā)性品質(zhì)成分主要影響香氣。信陽毛尖茶滋味特征是味濃，和其他綠茶相同，茶多酚、兒茶素、咖啡因是構(gòu)成其滋味的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，茶樹品種[1]、加工方式[2]、采摘時(shí)期[3]等對(duì)信陽毛尖茶的滋味成分都有影響。但是這些因素對(duì)滋味成分的影響機(jī)制仍然需要進(jìn)一步深入研究。

信陽毛尖茶的香氣以嫩香、熟板栗香著稱，其主要香氣成分為反-香葉醇、反-橙花叔醇、反-植醇、芳樟醇、壬醛、δ-杜松烯等[4-5]。在信陽毛尖茶香氣成分研究中，香氣成分的處理方法對(duì)結(jié)果非常重要，常用的茶葉香氣前處理方法有同時(shí)蒸餾萃取、溶劑萃取等方法，但是這些方法可能存在由于加熱導(dǎo)致結(jié)果失真或引入色素干擾色譜等問題。固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)作為一種不用試劑的前處理方法，具有敏感、快速、樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，是目前香氣分析中最有效的前處理手段之一。但目前采用該方法分析信陽毛尖茶香氣的研究較少。

為了研究信陽毛尖品質(zhì)形成，本文在感官審評(píng)的基礎(chǔ)上采用高效液相色譜和分光光度計(jì)法分析了茶葉中主要非揮發(fā)性成分，并通過頂空-固相微萃取(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)和氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)結(jié)合相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value, ROAV)分析茶葉中的香氣成分，以建立內(nèi)含成分與品質(zhì)形成之間的關(guān)系，加深對(duì)信陽毛尖品質(zhì)形成的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5個(gè)不同信陽毛尖茶樣隨機(jī)購于信陽本地茶葉市場，生產(chǎn)時(shí)間為2019年春季，茶樹品種均為信陽群體種，加工工藝按照傳統(tǒng)信陽毛尖加工工藝制作。

甲醇、乙腈(色譜純)，美國TEDIA試劑公司；冰乙酸(色譜純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；沒食子酸(gallate，GA，99%)、兒茶素(catechin，C，95%)、表兒茶素(epicatechin，EC，99%)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallic acid ester，ECG，99%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG，98%)、茶氨酸(99%)，上海麥克林生化科技有限公司；表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC，99%)，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所；咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品，自制，純度>99%，經(jīng)過色譜、質(zhì)譜和核磁共振確認(rèn)；無水葡萄糖(優(yōu)先級(jí))，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純。審評(píng)用水為桶裝飲用礦泉水。

1.2 儀器與設(shè)備

VIS-7220型可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司；安捷倫1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；Agilent 7890-7000D安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀(配EI源和Masshunter 10數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國安捷倫科技公司；60 mL頂空瓶，天津市東科儀器設(shè)備有限公司；手動(dòng)固相微萃取手柄，美國Supelco公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 感官審評(píng)

按照《茶葉感官審評(píng)方法:GB/T 23776—2018》對(duì)茶樣進(jìn)行感官審評(píng)[6]。首先于白底托盤中評(píng)定茶葉的形狀、整碎、凈度和色澤，然后準(zhǔn)確稱量樣品3.0 g，將茶葉置于150 mL審評(píng)杯中，倒入沸水，蓋上杯蓋沖泡5 min后倒出茶湯，進(jìn)行香氣和滋味評(píng)審。將5個(gè)茶樣隨機(jī)編號(hào)，5位審評(píng)人員獨(dú)立審評(píng)并打分(總分=外形×25%+湯色×10%+香氣×25%+滋味×30%+葉底×10%)，所有審評(píng)人員共同商討確認(rèn)描述性感官評(píng)語。

1.3.2 內(nèi)含成分檢測

水浸出物檢測參考《 茶水浸出物測定:GB/T 8305—2013》[7]；游離氨基酸檢測采用茚三酮比色法[8]；茶多酚、兒茶素、咖啡因含量測定參照《GB/T 8313—2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[9]；可溶性糖總量測定采用蒽酮法[10]。

1.3.3 香氣成分的測定

準(zhǔn)確稱取1.0 g磨碎茶樣放于60 mL萃取瓶中，倒入30 mL沸水，立即蓋上瓶蓋置于80 ℃水浴鍋中。平衡 5 min后插入萃取頭，吸附60 min，然后進(jìn)行GC-MS分析。條件如下：采用DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)，載氣為氦氣(純度≥99.999%)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，色譜柱的升溫程序：起始柱溫60 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升到150 ℃并且保持2 min，最后以7 ℃/min上升到280 ℃，保持2 min；不分流進(jìn)樣。采用EI離子源,離子源的溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，電子能量為70 eV，溶劑的延遲時(shí)間為2 min，質(zhì)量掃描范圍(m/z)為35～500。

1.4 相對(duì)氣味活度值計(jì)算

為了鑒定信陽毛尖茶香氣起主要作用的香氣成分，采用相對(duì)氣味活度值(relative odor activity value, ROAV)評(píng)價(jià)揮發(fā)性化合物對(duì)茶葉香氣貢獻(xiàn)[11-12]，將最大氣味活度值ROAVmax定義為100，其他組分的ROAV按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

其中:Wi代表揮發(fā)性化合物i的相對(duì)含量,%;Ti代表化合物i的在水中的香氣閾值,μg/L;Wmax代表香氣貢獻(xiàn)最大組分的相對(duì)含量,%;Tmax分別代表香氣貢獻(xiàn)最大組分的閾值，μg/L。

計(jì)算得到揮發(fā)性組分的ROAV≤100，ROAV值越大的組分對(duì)樣品總體香氣貢獻(xiàn)也越大。一般認(rèn)為ROAV≥1的組分為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，0.1≤ROAV<1的組分對(duì)樣品總體風(fēng)味具有重要修飾作用[13]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)茶樣重復(fù)檢測3次，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行線性分析和相關(guān)性分析。氣質(zhì)數(shù)據(jù)利用MassHunter未知物分析軟件(Unknown Analysis B.10.00，美國Agilent公司)進(jìn)行解卷積，然后與數(shù)據(jù)庫(NIST17)比對(duì)，保留質(zhì)譜匹配得分在75以上檢索結(jié)果。同時(shí)根據(jù)正構(gòu)烷烴C7-C40在相同GC-MS條件下的線性公式計(jì)算各香氣化合物的保留指數(shù)，并與文獻(xiàn)中的數(shù)值比對(duì)，以保留指數(shù)相差15以內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)再次篩選上述檢索結(jié)果。刪除柱流失等非茶葉香氣物質(zhì)后，采用面積歸一法計(jì)算各香氣相對(duì)含量，計(jì)算公式如下：

其中：wi為組分i相對(duì)含量，Ai為組分i峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 信陽毛尖茶感官評(píng)價(jià)

按照 GB/T 23776—2018 審評(píng)方法對(duì)5個(gè)信陽毛尖茶樣進(jìn)行感官審評(píng)(見表1)。1號(hào)茶樣原料嫩度高，芽頭多，白毫披露，帶有濃郁的熟板栗香，香高持久，湯色透亮，滋味醇和。2號(hào)茶樣原料稍次，但具有獨(dú)特的豆香，滋味醇和回甘。4號(hào)茶樣滋味略顯苦澀。感官審評(píng)結(jié)果符合對(duì)信陽毛尖茶 “細(xì)圓緊直多白毫，香高味濃湯色綠” 的認(rèn)識(shí)。

2.2 信陽毛尖茶滋味成分分析

茶多酚、咖啡因、游離氨基酸等物質(zhì)與茶湯滋味品質(zhì)密切相關(guān)，是茶葉風(fēng)味化學(xué)成分的主體。5個(gè)信陽毛尖茶樣的茶多酚、咖啡因、兒茶素、可溶性糖含量如表2所示，水浸出物、可溶性糖等沒有明顯差異，1號(hào)信陽毛尖的游離氨基酸含量顯著高于其他茶樣。

表1 信陽毛尖茶感官審評(píng)結(jié)果Tab. 1 Sensory evaluation results of Xinyang Maojian tea

表2 信陽毛尖茶主要化學(xué)成分含量Tab. 2 Results of main chemical components in Xinyang Maojian tea

信陽毛尖茶水浸出物含量為47.9%～50.5%，遠(yuǎn)高于名優(yōu)綠茶水浸出物含量大于38%的標(biāo)準(zhǔn)，說明信陽毛尖茶內(nèi)含物質(zhì)豐富。游離氨基酸是茶湯鮮爽味的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)茶湯具有重要作用[14]。信陽毛尖茶游離氨基酸含量為53.2～61.1 mg/g(表3)，在綠茶中處于較高水平。信陽毛尖茶采摘幼嫩茶樹鮮葉，以單芽和一芽一葉為主，其中1號(hào)茶樣游離氨基酸總量高達(dá)61.07 mg/g，高含量的氨基酸是信陽毛尖茶滋味鮮爽的物質(zhì)基礎(chǔ)。

兒茶素占茶多酚的75%～80%，是重要的綠茶風(fēng)味物質(zhì),具有健康功效[15-17]。但是過高含量的茶多酚會(huì)使綠茶茶湯收斂性增強(qiáng)，茶湯苦澀。信陽毛尖茶的多酚含量206.69～227.47 mg/g，兒茶素含量為166.53～180.1 mg/g，1號(hào)茶樣具有最低含量的兒茶素和茶多酚，4號(hào)茶樣具有最高含量的兒茶素和茶多酚(表2，表3)。兒茶素是茶湯苦澀味的主要來源物質(zhì)，其中酯型兒茶素在茶湯中苦澀味較強(qiáng)，簡單兒茶素爽口，澀味弱[18]，信陽毛尖茶兒茶素含量高，但是非酯型兒茶素比例也高，所以茶湯滋味鮮濃，爽口。

綠茶茶湯滋味是多種成分共同作用的結(jié)果，為進(jìn)一步研究各成分對(duì)茶湯滋味貢獻(xiàn)度，采用SPSS軟件，對(duì)信陽毛尖茶滋味品質(zhì)與兒茶素組分含量進(jìn)行偏相關(guān)分析，并進(jìn)行雙尾顯著性檢驗(yàn)，相關(guān)性分析結(jié)果見表4。結(jié)果表明，游離氨基酸和茶湯滋味評(píng)分成正相關(guān)，水浸出物、酚氨比、可溶性多糖、酯型兒茶素和兒茶素總量與茶湯滋味評(píng)分成負(fù)相關(guān)，其中酯型兒茶素含量和茶湯品質(zhì)成顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。信陽毛尖茶具有較高的游離氨基酸，酚氨比較低，賦予茶湯滋味鮮濃爽口的特征。

表3 信陽毛尖茶兒茶素含量Tab. 3 Catechin contents in Xinyang Maojian tea mg/g

表4 信陽毛尖茶滋味品質(zhì)與內(nèi)含成分相關(guān)性分析Tab. 4 Correlation analysis between taste quality and main flavor compounds of Xinyang Maojian tea

2.3 信陽毛尖茶揮發(fā)性化合物組分分析

為了分析信陽毛尖茶的揮發(fā)性成分，采用頂空SPME吸附并采用GC-MS進(jìn)行分離，得到信陽毛尖茶揮發(fā)性組分總離子流色譜圖，如圖1所示。通過圖1可以看出，現(xiàn)有試驗(yàn)條件能實(shí)現(xiàn)信陽毛尖茶主要揮發(fā)性成分的分離，為后續(xù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定提供良好基礎(chǔ)。利用GC-MS配套軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，首先采用解卷積區(qū)分共流出的揮發(fā)性成分，然后將解卷積后的“純凈”質(zhì)譜圖與NIST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，保留匹配因子在75以上的組分，同時(shí)計(jì)算各組分保留指數(shù)，并和數(shù)據(jù)庫中保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)，剔除保留指數(shù)>10的組分，5個(gè)信陽毛尖茶樣中共得到85個(gè)揮發(fā)性組分，如表5所示。各信陽毛尖茶樣的揮發(fā)性組分?jǐn)?shù)量相差不大，分別具有82、83、79、85、81種揮發(fā)性組分。

圖1 信陽毛尖茶揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig. 1 Representative total ion chromatogram of volatile components in Xinyang Maojian tea

表5 信陽毛尖揮發(fā)性香氣組分及其相對(duì)含量Tab. 5 Volatile aroma components and relative content in Xinyang maojian

續(xù)表5

按照揮發(fā)性成分化學(xué)性質(zhì)不同，將信陽毛尖茶中85種揮發(fā)性組分分為8個(gè)不同種類(圖2)，分別為醇類(9種)、烷烴(7種)、烯烴(13種)、醛類(8種)、酮類(12種)、雜環(huán)類(2種)、脂類(14種)和芳香族(20種)，其中芳香族是含量最高的種類(20.66%)，其次為醇類(20.19%)、醛類(15.51%)、酮類(14.2%)、雜環(huán)類(3.13%)，含量最低為烷烴(2.81%)。雖然5個(gè)供試茶樣香氣成分和含量總體相近，但是具體含量有所差別。1號(hào)茶樣含量前10的揮發(fā)性組分依次是壬醛、萘、芳樟醇、β-紫羅蘭酮、香葉醇、Z-己酸-3-己烯酯、δ-杜松烯、2-正戊基呋喃、苯甲醛、葵醛，占總香氣組分相對(duì)含量為49.39%。2號(hào)茶樣中揮發(fā)性組分含量排前10的依次是Z-己酸-3-己烯酯、順-茉莉酮、芳樟醇、橙花叔醇、壬醛、香葉醇、萘、β-紫羅蘭酮、順-3-己烯基丁酯、δ-杜松烯，占揮發(fā)性成分的57.12%。3號(hào)茶樣中相對(duì)含量排前10的揮發(fā)性組分依次是芳樟醇、萘、壬醛、β-紫羅蘭酮、Z-己酸-3-己烯酯、香葉醇、1,2,3,5-四甲基苯、1,2,3,4-四甲基苯、1,2,4,5-四甲基苯、δ-杜松烯，這些占總揮發(fā)性成分的54.09%。4號(hào)茶樣中相對(duì)含量排前10的組分依次是芳樟醇、壬醛、萘、β-紫羅蘭酮、香葉醇、橙花叔醇、順-茉莉酮、Z-己酸-3-己烯酯、δ-杜松烯、2-正戊基呋喃，占總揮發(fā)性成分的53.69%。5號(hào)茶樣中相對(duì)含量排前10的組分依次是Z-己酸-3-己烯酯、壬醛、芳樟醇、β-紫羅蘭酮、香葉醇、橙花叔醇、順-茉莉酮、萘、2-甲基丁酸葉醇酯、水楊酸甲酯，占總揮發(fā)性成分的58.59%。

圖2 信陽毛尖茶中揮發(fā)性組分的分類、數(shù)量和 平均相對(duì)含量Fig. 2 Catalogs, numbers and average relative contents of volatiles in Xinyang maojian green tea

統(tǒng)計(jì)上述各茶樣的主要揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，壬醛、萘、芳樟醇、β-紫羅蘭酮、Z-己酸-3-己烯酯、δ-杜松烯、順-茉莉酮和橙花叔醇是信陽毛尖茶中共有的含量豐富的揮發(fā)性組分。壬醛是茶葉中常見的揮發(fā)性成分，在西湖龍井、黃山毛峰、信陽毛尖、安吉白茶等含量較高[19]，同時(shí)壬醛也是紅茶[20]和黑茶[21]的主要揮發(fā)性成分之一。萘和δ-杜松烯屬于稠環(huán)芳烴衍生物，廣泛存在于各類茶中，萘被認(rèn)為是青磚茶香氣關(guān)鍵成分之一[22]，δ-杜松烯被認(rèn)為是“烏牛早”所制綠茶的主要香氣成分[23]。芳樟醇和橙花叔醇屬于萜烯醇，廣泛存在于各類茶中[24]，芳樟醇是紅茶[25]和烏龍茶[26]香氣的主要成分，橙花叔醇是大紅袍特征性香氣成分之一[27]。β-紫羅蘭酮是黑茶[28]和綠茶[29]的主要香氣成分之一，順-茉莉酮被認(rèn)為是洞庭碧螺春茶[30]和文山包種茶[31]的特征性香氣成分之一。Z-己酸-3-己烯酯主要存在于綠茶[5]和烏龍茶[32]中，并被認(rèn)為是區(qū)分鐵觀音陳茶和新茶的標(biāo)志性化合物之一[33]。

2.4 信陽毛尖茶關(guān)鍵香氣成分分析

信陽毛尖茶揮發(fā)性成分復(fù)雜，為進(jìn)一步探明揮發(fā)性成分中對(duì)香氣起作用的成分，采用相對(duì)氣味活度值(ROAV)進(jìn)一步篩選揮發(fā)性成分中的香氣關(guān)鍵成分。選取所有樣品中平均相對(duì)含量>0.5%的組分，根據(jù)文獻(xiàn)中的香氣閾值，計(jì)算出各組分的相對(duì)氣味活度值。如表6所示，芳樟醇的平均相對(duì)含量為8.18%，閾值為0.22 μg/L，分析發(fā)現(xiàn)其對(duì)總體香氣貢獻(xiàn)最大，因此定義芳樟醇的ROAV為100，計(jì)算其他組分的相對(duì)氣味活度值。

表6 信陽毛尖茶主要揮發(fā)性成分的 相對(duì)氣味活度值Tab. 6 ROAV of main volatile compounds in Xinyang Maojian tea

如表6所示，ROAV>1的組分依次為芳樟醇、萘、δ-杜松烯、香葉醇、β-紫羅蘭酮、茉莉酮、苯甲醛、β-環(huán)檸檬醛和2-正戊基呋喃，表明這些物質(zhì)對(duì)信陽毛尖茶的香氣形成具有重要貢獻(xiàn)，是關(guān)鍵香氣化合物。這些香氣成分中，芳樟醇、香葉醇、壬醛、紫羅蘭酮、順-茉莉酮、β-環(huán)檸檬醛和2-正戊基呋喃都具有花果香，這些成分含量高且閾值低，是信陽毛尖茶中花果香的主要來源物質(zhì)。萘和δ-杜松烯分別具有焦油味和木香，苯甲醛具有杏仁氣味，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了信陽毛尖茶的香氣主體。

研究認(rèn)為，ROAV值介于0.1和1之間的香氣成分對(duì)總體香氣具有修飾作用，本研究發(fā)現(xiàn)信陽毛尖茶中ROAV介于0.1和1之間的成分依次為對(duì)傘花烴、癸醛、1-甲基萘、苯乙醛、丁酸葉醇酯和水楊酸甲酯。其中葵醛、丁酸葉醇酯和水楊酸甲酯具有青氣，苯乙醛具有花果香，1-甲基萘具有刺激氣味，對(duì)傘花烴具有新鮮的柑橘氣息和木香[34]，這些物質(zhì)對(duì)信陽毛尖茶的香氣具有修飾作用，增加了香氣的層次感。其余的組分的ROAV<0. 1，是潛在香氣化合物。值得注意的是，雖然(Z)-己酸-3-己烯酯含量較高(6.83%)，但是因?yàn)槠溟撝蹈?781 μg/L)，ROAV值只有0.02，對(duì)信陽毛尖茶總體香氣貢獻(xiàn)不大。橙花叔醇雖然具有花果香且含量高(3.8%)，但是閾值高(250 μg/L)，對(duì)總體香氣貢獻(xiàn)也不大。

3 結(jié)論

信陽毛尖茶水浸出物含量高，游離氨基酸含量較高，酚氨比低，是信陽毛尖茶滋味鮮爽回甘的物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)信陽毛尖茶香氣成分豐富，芳樟醇、萘、δ-杜松烯、香葉醇、β-紫羅蘭酮、茉莉酮、苯甲醛、β-環(huán)檸檬醛和2-正戊基呋喃是主要呈香物質(zhì)。這些結(jié)果加深了對(duì)信陽毛尖茶品質(zhì)形成的認(rèn)識(shí)，對(duì)信陽毛尖茶的品質(zhì)提升具有參考意義。