趙音珺， 楊小杭

(浙江大學 醫(yī)學院， 杭州310000)

乳腺癌是目前全球發(fā)病率最高的癌癥之一，且發(fā)病率逐年增高。眾多研究指出BRCA1基因的突變與卵巢癌和乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。1990年Hall等學者通過對大量具有早發(fā)性乳腺癌病例的家庭進行連鎖分析，首次定位了第一個候選的乳腺癌相關(guān)基因，并將其命名為乳腺癌相關(guān)基因1(Breast cancer 1, early onset)[1,3]。1994年BRCA1基因首次被克隆，與此同時BRCA1編碼序列的突變在患有多例乳腺癌的家庭中被鑒定出來[2-3]。

乳腺癌和卵巢癌易感性基因檢測已經(jīng)整合到臨床腫瘤治療中，用于檢測BRCA1突變的技術(shù)有蛋白質(zhì)截斷檢測、DNA芯片技術(shù)、直接測序技術(shù)和MLPA等[4]。而BRCA1蛋白功能的研究主要在小鼠模型中進行，眾多研究表明，BRCA1參與多項細胞活動。其中Brca1突變小鼠胚胎發(fā)育的研究揭示了BRCA1在HR修復途徑中的主要功能。通過總結(jié)相關(guān)小鼠胚胎發(fā)育的研究成果介紹HR修復途徑中的重要蛋白BRCA1的研究進展。在未來的研究中，BRCA1相關(guān)的乳腺癌和卵巢癌的特定分子遺傳學分析及對BRCA1的相關(guān)功能了解可能會促進新的靶向療法的發(fā)展。

1 BRCA1基因

1.1 人源BRCA1基因

人源BRCA1基因是一個腫瘤抑制基因，BRCA1基因位于17號染色體長臂端12-21區(qū)域(17q12-21)，約81 kb[3]。BRCA1編碼的mRNA長約7.8 kb，共有24個外顯子,其中共有22個外顯子能夠編碼氨基酸序列。第11號外顯子最長，約3.4 kb，編碼BRCA1中超過60%的氨基酸序列。而第1號和第4號外顯子不具備功能性[5]。多年來對BRCA1基因的研究增強了人類對相關(guān)遺傳性和散發(fā)性癌癥的認識，也使得對應(yīng)的治療方案及預防措施有重大突破。

1.2 BRCA1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

以人源BRCA1蛋白為例，BRCA1在包括乳腺和卵巢在內(nèi)的許多組織中高度表達，由1 863個氨基酸殘基組成，約220 ku。BRCA1蛋白的主要結(jié)構(gòu)[2]：(1)RING結(jié)構(gòu)域。其N端有一環(huán)狀鋅指結(jié)構(gòu)域，具有Cys3-His-Cys4結(jié)構(gòu)，能與BARD1(BRCA1-associated RING domain)蛋白相互作用，形成異源二聚體，該異源二聚體具有E3泛素連接酶的功能[6]。(2)NLS核定位信號。BRCA1蛋白分別在氨基酸503KRKRRP508和606PKKNRLRRK615處包含兩個核定位信號，兩者皆由11號外顯子編碼，且都可以引導BRCA1進入細胞核[7]。(3)CC結(jié)構(gòu)域。螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain)由1 364～1 437位氨基酸殘基組成。BRCA1的CC結(jié)構(gòu)域能識別PALB2的螺旋結(jié)構(gòu)域，與PALB2蛋白結(jié)合，進一步形成BRCA1-PALB2-BRCA2復合體，這一復合體能夠促進重組酶RAD51募集到單鏈DNA處[8-9]。(4)BRCT結(jié)構(gòu)域。BRCA1蛋白羧基端(BRCA1 C-terminal)區(qū)域有兩個相鄰的BRCT結(jié)構(gòu)域，單個BRCT結(jié)構(gòu)域含有約110個氨基酸殘基。BRCT結(jié)構(gòu)域具有轉(zhuǎn)錄激活的功能，該結(jié)構(gòu)域也能與許多蛋白質(zhì)結(jié)合，包括Abraxas、BRIP1(也稱為FANCJ)和CtIP等，這些蛋白與BRCA1相互作用共同參與DNA損傷修復[10]。

圖1 BRCA1蛋白結(jié)構(gòu)示意圖(改自文獻[11])Figure 1 Schematic diagram of BRCA1 protein structure(adapted from reference[11])

1.3 BRCA1同源蛋白

多種哺乳動物中存在BRCA1同源蛋白，且蛋白序列高度保守。不同物種的BRCA1同源蛋白長度相近，都含有主要結(jié)構(gòu)域：RING結(jié)構(gòu)域、BRCT結(jié)構(gòu)域、與PALB相互作用的區(qū)域等。BRCA1同源蛋白參與多項細胞活動，本文主要論述其在HR途徑中的作用。BRCA1能夠募集至DSB位點，參與調(diào)控HR損傷修復。其RING結(jié)構(gòu)域與BARD1形成的異源二聚體能夠在HR修復DSB的過程中促進DNA末端切割；BRCA1同源蛋白還能與PALB相互作用促進重組酶RAD51的募集[12-13]。表1列舉了幾種具有代表性的哺乳動物的BRCA1同源蛋白，并進行比較(數(shù)據(jù)來源：https://www.uniprot.org)。

2 BRCA1蛋白在HR修復中的作用

2.1 DSB損傷修復

BRCA1蛋白參與DNA損傷修復，在HR中發(fā)揮重要作用[14]。生物體內(nèi)多種因子會對DNA造成損傷，其中DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks， DSB)是對細胞而言危害性最大的DNA損傷形式。隨著時間的推移，未修復的DSB在生物體內(nèi)發(fā)生累積，將會導致細胞衰老或細胞凋亡的發(fā)生，而DSB的錯誤加工則會損壞基因組的穩(wěn)定性并誘導癌癥的發(fā)生[15]。DSB形成原因眾多，外源性因素包括電離輻射、紫外線、拓撲異構(gòu)酶抑制劑和化學物質(zhì)等，內(nèi)源性因素包括復制壓力、V(D)J重排和程序性因素等[16-17]。DSB主要通過非同源末端連接(nonhomologous end-joining，NHEJ)和HR兩種途徑來修復[18-20]。NHEJ是一種不需要同源模板，直接將DNA末端連接在一起的快速修復方式，NHEJ途徑錯配率較高，易造成DNA損傷位點堿基序列的改變，從而導致遺傳信息的丟失。而HR途徑則需要同源序列作為修復模板，使得DNA斷裂處丟失的遺傳信息得以恢復，是一種較為慢速但非常精確的DSB修復方式[21-22]。

圖2 DSB損傷修復途徑的選擇Figure 2 The choice of DSB damage repair pathway

2.2 HR修復途徑

HR是一種在機制上非常保守且高保真的修復途徑，因此可以維持基因組完整性。在HR修復途徑中，BRCA1蛋白在多個步驟中發(fā)揮作用[23]。細胞中的DSB位點首先被MRN(MRE11-RAD50-NBS1)復合物識別，MRN復合物被募集到DNA末端，進一步激活ATM(ataxia-telangiectasia mutated)蛋白激酶，ATM激酶通過與NBS1的C末端結(jié)合而被募集到DSB位點?；罨腁TM激酶能使DNA損傷修復所涉及的多種蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化，隨之放大損傷信號[24-25]。ATM可以在多個位點磷酸化BRCA1，被激活的BRCA1被募集至DSB位點，形成的BRCA1-BARD1復合物與53BP1發(fā)生拮抗，使DSB通過HR方式得以修復[26]。HR修復起始于DNA末端切除——5′DNA鏈從斷裂位點沿5′到3′方向發(fā)生降解，產(chǎn)生3′ssDNA單鏈[27]。DNA末端切除包含2個步驟：(1)由細胞中的MRN(MRE11-RAD50-NBS1)復合物和磷酸化的CtIP共同作用在5′端完成短程DNA末端切割，產(chǎn)生較短的3′ssDNA，BRCA1能夠有效促進該步驟的進行[28]。遠程切除因子包括兩種核酸酶：dsDNA特異性核酸外切酶EXO1和ssDNA特異性的5′→3′核酸酶DNA2，EXO1可特異性降解dsDNA中5′末端的DNA鏈，與核酸酶DNA2共同作用，最終產(chǎn)生長度可達幾千個堿基的3′ssDNA突出端[27]。DNA末端切除產(chǎn)生的長距離ssDNA，迅速被復制蛋白A(replication protein A，RPA)包被，RPA是一種ssDNA結(jié)合蛋白，可以抑制3′ssDNA末端被降解，并且防止ssDNA自身退火形成二級結(jié)構(gòu)[29]。(2)3′ssDNA上的RPA會被重組酶RAD51取代，相較于RPA重組酶RAD51與DNA鏈的親和力更低，BRCA1會在重組酶RAD51取代RPA的過程中發(fā)揮作用。BRCA1可以與PALB2和BRCA2結(jié)合，從而介導與BRCA2結(jié)合的重組酶RAD51裝配至ssDNA，隨后重組酶RAD51將會取代ssDNA上的RPA產(chǎn)生RAD51-ssDNA結(jié)構(gòu)[30]。重組酶RAD51能夠促進ssDNA向同源雙鏈DNA模板入侵，形成D-loop結(jié)構(gòu)，重組酶RAD51在RAD54的幫助下發(fā)生解離[31-32]。

HR有兩種主要亞通路，一是雙鏈斷裂修復(double strand breaks repair，DSBR)：D-loop形成后，入侵鏈根據(jù)模板鏈完成復制后又會進行第二次末端的捕獲，產(chǎn)生dHJ(double holiday junction)結(jié)構(gòu)。dHJ結(jié)構(gòu)在特異性核酸內(nèi)切酶作用下會產(chǎn)生交叉產(chǎn)物(crossover，CO)或非交叉產(chǎn)物(noncrossover，NCO)。此外dHJ結(jié)構(gòu)也可以在特異性解旋酶BLM和拓撲異構(gòu)酶TopoIIIα介導下發(fā)生溶解(dissolution)，最終解旋產(chǎn)生非交叉產(chǎn)物[34]。在另外一種亞通路SDSA中，D-loop結(jié)構(gòu)中的入侵鏈完成修復后，在解旋酶RTEL1的作用下發(fā)生解離。隨后，該鏈重新退火至原始親本鏈DSB另一側(cè)的末端，從而形成互補鏈介導DSB修復。該途徑會發(fā)生基因轉(zhuǎn)換，最終產(chǎn)生非交叉產(chǎn)物[34]。

2.3 BRCA1蛋白在HR修復中的功能

DSB產(chǎn)生后BRCA1可以通過C端的BRCT結(jié)構(gòu)域與DNA鏈相互作用募集至DSB位點。在DSB位點處，BRCA1可以與MRN復合體及效應(yīng)蛋白CtIP相互作用，促進CtIP的活性，促進由MRN復合體/CtIP負責的DNA末端切除過程[35]。與此同時，BRCA1還可以與在DSB末端處的53BP1發(fā)生拮抗，將DNA保護蛋白移除，從而介導DSB損傷修復向HR方向進行。研究表明在BRCA1缺失的情況下，53BP1可以在DSB損傷末端大量募集，從而阻止DNA末端被切除[36-37]。

DNA末端被切除產(chǎn)生單鏈DNA后，BRCA1能直接與PALB2相互作用產(chǎn)生BRCA1-PALB2-BRCA2復合體，該復合體可以介導重組酶RAD51募集至DSB位點，促進重組酶RAD51替換RPA，形成RAD51-ssDNA結(jié)構(gòu)，有利于下一步DNA單鏈入侵。研究指出BRCA1和BARD1都能募集至DNA鏈并且與RAD51相互作用。BARD1與BRCA1相互作用形成的異源二聚體能夠有效促進重組酶RAD51的募集，并介導RAD51-DNA鏈進行同源DNA配對，并且還能增強RAD51的重組酶活性[38-39]。

3 Brca1 基因突變小鼠

3.1 Brca1基因突變小鼠的胚胎發(fā)育缺陷

為進一步了解BRCA1的功能，研究者通過基因敲入和敲除技術(shù)構(gòu)建許多Brca1突變基因小鼠模型。這些Brca1基因突變小鼠的生理特征研究能夠幫助理解BRCA1在HR修復途徑中的作用。到目前為止，已經(jīng)通過使用不同的基因操作技術(shù)在小鼠體內(nèi)構(gòu)建了超過20種Brca1突變基因(包括無效突變、條件突變和點突變等)[40]。眾多Brca1基因突變小鼠在胚胎期死亡，這表明BRCA1對胚胎發(fā)育而言具有重要意義。Brca1基因突變位點不同，則小鼠胚胎死亡時間不同。這表明Brca1不同基因位點對BRCA1蛋白功能具有不同的影響，由于突變基因表達的BRCA1蛋白大小各異，存在的功能域不同且其轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯后修飾也不同，因此這些Brca1突變基因表達的蛋白存在許多不同情況。在有些突變體中Brca1基因完全失效，無法表達BRCA1蛋白；而有些突變體中的BRCA1蛋白仍存在部分結(jié)構(gòu)域。這些研究提示BRCA1在HR修復途徑中還具有其他功能。

3.2 Brca1基因突變胚胎致死的小鼠

研究指出HR途徑相關(guān)蛋白缺失的小鼠會出現(xiàn)胚胎致死的情況，由此可知HR修復途徑在小鼠早期胚胎發(fā)育和細胞增殖過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[41]。Brca1Δ5-6是一種Brca1的無效等位基因。在這種等位基因中，Brca1第5和第6外顯子的序列被替換，突變使得編碼RING結(jié)構(gòu)域的序列被破壞，并產(chǎn)生了終止密碼子，因此該種Brca1突變基因無法表達BRCA1蛋白。Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠胚胎細胞中也被證實不存在BRCA1蛋白。Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠在胚胎發(fā)育至7.5 dpc之前死亡，突變小鼠的胚胎發(fā)育不良，其中胚層沒有形成的跡象[42]。Brca1Δ5-13是另一種Brca1的無效等位基因。將Brca1flox5-13/flox5-13小鼠與帶Cre酶小鼠交配可以獲得Brca1Δ5-13/Δ5-13突變小鼠。在這種Brca1突變基因中，第5至13外顯子的序列被刪除，所有BRCA1的功能域都遭到破壞，Brca1Δ5-13/Δ5-13小鼠也在胚胎期死亡[10,43]。Brca1ex2基因中原有的第2號外顯子被替換。第2號外顯子編碼N端RING結(jié)構(gòu)域，也包含啟動子，因此該片段突變將會導致Brca1失效。Brca1ex2/ex2小鼠死于胚胎期6.5～9.5 dpc，遲于Brca1Δ5-6/Δ5-6小鼠胚胎死亡日期。然而Brca1還存在另外一個啟動子，當其被激活后能夠表達出不包含RING結(jié)構(gòu)的BRCA1蛋白，因此該基因型小鼠胚胎死亡的日期略有推遲[44]。Brca11700T基因通過將neogene插入第20號外顯子獲得，在Brca11700T/1700T小鼠細胞中，所表達的BRCA1蛋白不存在C端BRCT結(jié)構(gòu)域。BRCT結(jié)構(gòu)域具有使BRCA1與DSB末端結(jié)合的功能，由于影響了HR途徑，Brca11700T/1700T小鼠胚胎死于9.5～10.5 dpc[45]。

3.3 Brca1基因突變小鼠胚胎致死的挽救

眾多Brca1基因突變小鼠的研究結(jié)果表明，在早期胚胎發(fā)育過程中BRCA1有非常重要的作用。在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)p53信號失活，或者53bp 1的缺失可以在不同程度上挽救Brca1基因突變小鼠胚胎致死的情況。這些結(jié)果為BRCA1在胚胎早期發(fā)育中的機制研究提供了證據(jù)。

3.3.1 p53信號失活的拯救

為研究Brca1Δ5-6/Δ5-6基因型小鼠胚胎致死是否由p53的信號激活導致，研究者構(gòu)建了Brca1Δ5-6/Δ5-6;p53-/-小鼠模型。研究結(jié)果顯示，由于部分挽救了發(fā)育延遲和細胞增殖的缺陷，Brca1-p53DKO小鼠胚胎的壽命較Brca1Δ5-6/Δ5-6基因型小鼠可以延長1～2 d[46]。此外p53基因缺失、Chk2基因缺失、Atm基因缺失都可以挽救Brca1Δ11/Δ11早期胚胎致死的情況[47-48]。DSB在細胞內(nèi)大量產(chǎn)生后，p53被ATM激酶磷酸化激活，CHK2也會被ATM激酶激活，在ATM-CHK2通路的介導下，細胞進入細胞檢查點，細胞活動阻滯在特定時期。細胞內(nèi)積聚大量未修復的DSB，細胞會啟動凋亡程序，最終導致早期胚胎死亡[49]。如果在Brca1基因缺陷的小鼠中引入p53的缺失，ATM-Chk2-p53信號就無法被激活，因此胚胎發(fā)育阻滯可以在不同程度上有所挽救。由此可知，相關(guān)Brca1基因缺陷的小鼠胚胎致死是由p53信號激活導致的。

3.3.2 53BP1缺失的拯救

p53結(jié)合蛋白1(p53 binding protein 1，53BP1)是p53基因的轉(zhuǎn)錄激活物，53bp1缺失也可以挽救Brca1Δ11/Δ11小鼠早期胚胎死亡的情況[50]。然而與p53基因缺失模型不同的是，在Brca1Δ11/Δ11、Trp53bp1-/-小鼠的細胞中，ATM-Chk2-p53信號是完整的。實驗證明53BP1缺失通過恢復HR修復途徑來挽救Brca1Δ11/Δ11小鼠早期胚胎死亡的情況。53BP1 KO也是通過恢復HR修復途徑來挽救Brca1ex2/ex2小鼠早期胚胎死亡的情況[50]。這些實驗證明BRCA1能夠調(diào)控DSB修復途徑的選擇，使DSB選擇通過HR修復途徑進行修復[51]。BRCA1還可以與在DSB末端處的53BP1發(fā)生拮抗，將DNA保護蛋白移除，介導DSB通過HR途徑進行修復。在Brca1基因突變小鼠中，53BP1固定在DSB末端，DNA末端切除無法進行[52]。如果引入53BP1 KO，突變體細胞內(nèi)DNA末端切除便能發(fā)生，HR修復途徑在沒有完整BRCA1蛋白的情況下被恢復，相關(guān)Brca1基因突變小鼠因此被拯救。53BP1的缺失還可以挽救Brca1ΔC/ΔC、Brca1Δ5-13/Δ5-13早期胚胎致死的情況，但與上述挽救方式有所不同。在Brca1ΔC/ΔC基因突變小鼠細胞中，由于HR修復途徑中的重要蛋白如RAD51、PALB2等無法募集到DNA切除末端，因此53BP1缺失無法修復由BRCA1介導的HR修復途徑。與此同時，研究表明53BP1缺失也不是通過恢復HR修復途徑來挽救Brca1Δ5-13/Δ5-13小鼠。但是在Brca1ΔC/ΔC、Trp53bp1-/-和Brca1Δ5-13/Δ5-13、Trp53bp1-/-基因型小鼠中，還存在小部分非BRCA1介導的HR修復途徑[53-54]。其中在Brca1Δ5-13/Δ5-13、Trp53bp1-/-小鼠的細胞中，53BP1缺失還使得DSB通過NHEJ的方式得以修復，從而挽救該種Brca1基因缺陷小鼠胚胎致死的情況[53]。

4 總結(jié)

BRCA1蛋白參與DNA損傷修復，在HR修復途徑中發(fā)揮重要作用。在HR修復途徑中BRCA1具有兩個主要功能：一是促進DNA末端切除，二是介導重組酶RAD51在DSB位點處的裝載。為了進一步研究BRCA1的功能，研究者構(gòu)建了諸多Brca1基因突變小鼠模型。在Brca1基因突變小鼠模型中，通常存在早期胚胎致死的現(xiàn)象。相關(guān)研究可以驗證BRCA1在HR修復途徑中有重要意義的結(jié)論。此外一些相關(guān)基因的敲除可以在不同程度上挽救Brca1基因突變小鼠胚胎致死的情況。這表明BRCA1還具有另外一項功能：與53BP1發(fā)生拮抗，調(diào)控DSB修復途徑的選擇。這些成果提示在以后的研究中，可以通過構(gòu)建不同的Brca1基因突變小鼠模型，探索BRCA1在HR修復途徑中還未解決的問題。