曹 宇，陳鵬澤，曹秀蘭，胡安娜，葉雨婷，李 鵬1，2，*

（1.熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室，海南 海口 571158；2.海南省熱帶動植物生態(tài)學重點實驗室，海南 ?？?571158；3.海南師范大學 生命科學學院，海南 ?？?571158）

茄科作物青枯病是一種由茄雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的典型細菌性維管束土傳病害，其病原能長時間存活于土壤中，對植物危害性極強[5]。該病原菌廣泛分布于全球熱帶、亞熱帶以及溫帶的部分地區(qū)，寄主范圍極廣，除危害多種茄科作物外還可侵染花生、香蕉等50科200種作物[6-7]。作物種植區(qū)域發(fā)病后將導致作物大量減產甚至絕產，給農業(yè)生產造成巨大的經濟損失，已成為海南櫻桃番茄等茄科植物種植產業(yè)的嚴重制約因素。

茄科植物青枯病的防治中采用最多的方法是化學防治，容易造成農藥殘留和環(huán)境污染。生物防治是植物病蟲害防治的新興技術，生防產品以其環(huán)境友好、效果持久等特質近年來得到迅速發(fā)展。目前，主要的生物防治策略包括無致病力菌株、生防菌、誘導抗性及轉基因植物的研究與應用[8]。資料顯示，微生物、青枯立克中草藥殺菌劑、乙蒜素植物仿生農藥、青枯病拮抗菌等生防產品已應用于青枯病防治中[9]。但受限于海南典型的亞熱帶地區(qū)高溫和高濕等氣候環(huán)境，部分生防菌劑在海南并沒有表現(xiàn)出很好的防治效果。

為進一步研究生物防治技術防控茄科植物青枯病，本研究從海南省櫻桃番茄重病田存活的健康植株的砧木根際土壤中分離出了對茄雷爾氏菌具有高效拮抗活性的菌株，通過平板對峙的方法從分離出的菌株中篩選出一株對茄雷爾氏菌拮抗效果優(yōu)良的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis，編號為HNU24），該菌株還表現(xiàn)出在番茄根系和莖部穩(wěn)定定殖的特性和對番茄的顯著促生長作用。本研究對防治茄科植物青枯病和采用生物防治技術提高茄科植物的產量具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌強致病力茄雷爾氏菌EP1[10]、貝萊斯芽孢桿菌FZB42和HNU24由本實驗室保存，其中菌株HNU24分離自海南陵水縣櫻桃番茄青枯病重病田健康植株的砧木根系。

1.1.2 培養(yǎng)基TTC固體培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 g、酪蛋白水解物1 g、胰蛋白胨10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。TTC液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖10 g、酪蛋白水解物1 g、胰蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL。LB固體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。LB液體培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 番茄品種

番茄品種Moneymaker由華南農業(yè)大學汪國平教授饋贈。

1.2 平板對峙試驗

將分離純化出的HNU24和保存的茄雷爾氏菌EP1活化后分別轉移至新鮮的LB液體培養(yǎng)基和TTC液體培養(yǎng)基中，均在恒溫搖床上于200 rmp、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h；加熱TTC固體培養(yǎng)基使其完全融化，待其降至適宜溫度（37 ℃左右）后按培養(yǎng)基與菌液的體積比為100:1的比例向融化后的TTC培養(yǎng)基中加入已搖好的EP1菌液（OD600≈1.2），并徹底混勻；向直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中倒入20 mL混合后的培養(yǎng)基，待平板徹底凝固后在平板上用直徑為5 mm 的打孔器打孔；分別向平板的每個孔中加40μL HNU24 菌液（OD600=2.0）；在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察統(tǒng)計抑菌圈直徑。平板對峙實驗以貝萊斯芽孢桿菌FZB42作對照。

倆人乘坐開往郊區(qū)的公交車，顛簸了兩個小時才來到這個偏僻的地方，然后像做賊似的偷偷藏在這堵矮墻后面，煞有介事地監(jiān)視著五十米開外那兩棟樓。

1.3 HNU24發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物的制備

將HNU24 純培養(yǎng)物置于LB 液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)（30 ℃、200 rpm）48 h，于12 000 g 離心20 min，收集上清液。于上清液中加入等體積的乙酸乙酯，充分震蕩搖勻，將有機相于旋轉蒸發(fā)儀中蒸干，最后使用DMSO溶液將蒸干后的萃取物溶解（濃度調整為1mg/mL），通過平板檢測法檢測萃取物抑制茄雷爾氏菌的活性，檢測時采用DMSO做對照，其他操作參照1.2中的描述。

1.4 EP1與貝萊斯芽孢桿菌HNU24的共培養(yǎng)實驗

將茄雷爾氏菌EP1和貝萊斯芽孢桿菌HNU24分別接種在TTC固體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基上以獲得單菌落。將EP1 和HNU24 的單菌落分別接種在10 mL 的TTC 液體培養(yǎng)基和LB 液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 rpm條件下振蕩培養(yǎng)48 h獲得單培物（OD600=2.0），分別標記為A、B。按200μL的接種量將A、B分別接種在10 mL TTC 液體培養(yǎng)基和LB 液體培養(yǎng)基中；按100μL 的接種量將A、B 同時接種在10 mL TTC 液體培養(yǎng)基中，分別標記為MP（A）、MP（B）、CP（A+B），均在28 ℃、160 rpm 條件下振蕩培養(yǎng)。在第6、12、18、24、30、36、42、48 h分別從MP（A）、MP（B）、CP（A+B）中取出1 mL 3種菌液，連續(xù)稀釋這三種菌液（稀釋倍數(shù)為10-6、10-7、10-8），將稀釋后的菌液按各100μL的接種量分別在TTC固體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基上涂板（每個稀釋倍數(shù)各有3個重復），在30 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后選取菌落數(shù)量適當?shù)模?0～60個）固體培養(yǎng)基平板統(tǒng)計在不同振蕩培養(yǎng)時間共培養(yǎng)EP1和HNU24的菌落數(shù)（EP1和HNU24的分別培養(yǎng)作為對照）。

1.5 貝萊斯芽孢桿菌HNU24的生防實驗

分別將EP1 接種在10 mL 的TTC 液體培養(yǎng)基中，HNU24 和FZB42 接種在10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 rpm條件下進行恒溫搖床培養(yǎng)24 h，用無菌水稀釋至500 mL制成菌懸液（OD600=1.0）。選出80株健康、長勢一致的番茄幼苗，分為A、B、C、D組，每組20株。A組幼苗的根蘸取無菌水后再移栽入無菌土中；B 組幼苗的根蘸取EP1 菌液后再移栽入無菌土中；C 組幼苗的根蘸取EP1 菌液前先在HNU24 菌液中浸泡5 min，然后移栽至無菌土中；D組幼苗的根蘸取EP1菌液前先在FZB42菌液中浸泡5 min，然后移栽至無菌土中。最后將4組番茄幼苗置于25 ℃溫室條件下培養(yǎng)，每隔2 d拍照并記錄每個組的番茄植株發(fā)病株數(shù)，最后分別計算各組幼苗的發(fā)病率。番茄幼苗發(fā)病率=發(fā)病幼苗數(shù)/總幼苗數(shù)×100%。

1.6 貝萊斯芽孢桿菌HNU24的促生長實驗

將HNU24在10 mL的LB液體培養(yǎng)基中于28 ℃、180 rpm條件下恒溫搖床培養(yǎng)48 h后，用無菌水稀釋至500 mL 制成菌懸液（OD600= 1.0）。選出60 株健康、長勢良好的番茄幼苗，分為CK-A、CK-B、HNU24-A、HNU24-B 4 組，每組15 株。CK-A 組用稀釋50 倍的500 mL LB 液體培養(yǎng)基進行葉面噴施處理。CK-B 組用稀釋50倍的500 mL LB培養(yǎng)基進行灌根處理。HNU24-A組用稀釋50倍的500 mL HNU24菌液進行葉面噴施處理。HNU24-B組用稀釋50倍的500 mL HNU24菌液進行灌根處理。將4組番茄幼苗置于25 ℃的溫室條件下培養(yǎng)，每隔3 d處理一次，拍照并測量株高、莖圍、鮮重和根系長度。

1.7 貝萊斯芽孢桿菌HNU24定殖能力的探究

把選出的18株健康、長勢良好的番茄幼苗的根在HNU24（已經過利福平抗性篩選）菌懸液（OD600=1.0）中浸泡5 min，然后栽種在同一花盆中。每次取3株幼苗（每7 d 取樣一次，4 次重復），將根表的土剝除并用無菌水反復沖洗，然后每株稱取1 g根和1 g莖，用無菌水沖洗3次后用70%的酒精處理表面1.5 min，再用無菌水沖洗2 次。將上述材料分別研磨成糊狀，加入1 mL 無菌水成母液，后加無菌水分別稀釋100 倍、1 000倍、10 000 倍。分別取100μL 稀釋液涂抹在含30μg/mL 利福平的LB 固體培養(yǎng)基平板上，每濃度均3 個重復，在30℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后選取菌落數(shù)量適當（30～60個）的固體培養(yǎng)基平板統(tǒng)計HNU24的菌落數(shù)（在進行菌落統(tǒng)計時以HNU24的純培養(yǎng)菌落形態(tài)作為對照），同時設置空白處理（未接種）對照。按照上述方法，研究接種7、14、21和28 d后每個平板上長出菌落的形態(tài)和數(shù)目，評價HNU24在番茄幼苗根部和莖部的定殖能力。

1.8 數(shù)據統(tǒng)計與分析

用IBM SPSS Statistics 23.0軟件進行數(shù)據處理分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 HNU24的分離鑒定和形態(tài)特征

菌株HNU24分離自櫻桃番茄的根系，目前已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，菌株保藏編號為GD?MCC61231，全基因組測序結果表明其為貝萊斯芽孢桿菌。HNU24菌落在LB培養(yǎng)基上呈乳白色，凸起且有規(guī)則的邊緣。掃描電鏡結果顯示HNU24呈現(xiàn)明顯的桿狀結構，單個或成對排列，有的也呈短鏈排列；芽孢呈橢圓狀，位于非腫脹胞囊的中間或末端（圖1A）。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌HNU24的平板對峙實驗和形態(tài)特征Figure 1 Plate confrontation experiment and morphological characteristics of the Bacillus velezensis strain HNU24

2.2 平板對峙實驗

以強致病力茄雷爾氏菌EP1菌株為指示菌，用已報道的對茄雷爾氏菌具有較強拮抗活性的貝萊斯芽孢桿菌FZB42作對照，對貝萊斯芽孢桿菌HNU24對茄雷爾氏菌EP1的拮抗作用進行研究。結果發(fā)現(xiàn)，HNU24周圍可以產生較大的透明圈，其抑菌圈直徑可達25 mm（圖1B），表明HNU24對EP1具有較強的拮抗效果，且HNU24對EP1的拮抗效果優(yōu)于FZB42（圖1C）。

2.3 EP1和HNU24共培養(yǎng)實驗

通過稀釋涂板法測定單一培養(yǎng)MP（A）、MP（B）和共培養(yǎng)CP（A+B）48 h 培養(yǎng)液中的菌落生長狀況。在MP（A）和MP（B）中，EP1、HNU24的菌落數(shù)目均逐漸增加。在CP(A+B)中，菌株EP1的菌落數(shù)在0～24 h內逐漸增多，但24～48 h逐漸減少并在48 h時未檢測到EP1，而菌株HNU24的菌落數(shù)則一直增長且和MP（A）的生長趨勢接近，說明CP（A+B）后期HNU24增殖的同時顯著抑制了茄雷爾氏菌EP1的生長（圖2）。為進一步驗證HNU24的活性代謝產物是否抑制茄雷爾氏菌生長，本研究對HNU24發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物進行了活性檢測。結果表明，萃取物中含有可以拮抗茄雷爾氏菌的活性物質（圖3）。

圖2 茄雷爾氏菌EP1與貝萊斯芽孢桿菌HNU24的共培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)菌落數(shù)量變化Figure 2 Changes of colony number in single culture and co-culture of R.solanacearum and the Bacillus velezensis strain HNU24

圖3 貝萊斯芽孢桿菌HNU24發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取物對茄雷爾氏菌EP1的拮抗活性檢測Figure 3 Antagonistic activity of the B.velezensis HNU24 ethyl acetate extract to R.so?lanacearum EP1

2.4 HNU24的生防實驗

生防實驗中，第12 d 番茄植株的發(fā)病情況見表1，僅接種EP1 的植株發(fā)病率為82%；同時接種EP1 和FZB42 的植株發(fā)病率為63%；同時接種EP1 和HNU24 的植株發(fā)病率為39%，且接種后第17 d 才表現(xiàn)出萎蔫癥狀，發(fā)病時間明顯推遲。結果表明，貝萊斯芽孢桿菌HNU24可明顯降低番茄植株青枯病的發(fā)病率，推遲發(fā)病時間，拮抗效果優(yōu)于FZB42。

表1 生防實驗統(tǒng)計Table 1 Biocontrol experiment statistics

2.5 HNU24的促生長實驗

促生長實驗表明，HNU24對番茄幼苗具有明顯的促生長作用，結果見表2。通過HNU24菌液葉面噴灑和灌根2種方式處理的番茄幼苗經過21 d溫室培養(yǎng)（25 ℃）后，其株高、莖粗、鮮重和根系長度等各項指標都顯著高于CK-A和CK-B處理。其中，HNU24菌液噴灑處理（HNU24-A）番茄幼苗21 d后的株高、莖圍、鮮重、根系長度分別是CK-A處理的1.26倍、1.25倍、1.46倍和1.09倍；HNU24菌液灌根處理（HNU24-B）番茄幼苗21 d后的株高、莖圍、鮮重、根系長度分別是CK-B處理的1.20倍、1.09倍、1.39倍和1.18倍?？梢姡喔腿~面噴施HNU24菌株均可以有效促進番茄幼苗的生長。

表2 貝萊斯芽孢桿菌HNU24對番茄幼苗的促生長效果Table 2 Growth promotion effect of the B.velezensis strain HNU24 on tomato seedlings

2.6 HNU24定殖能力的探究

貝萊斯芽孢桿菌HNU24定殖能力研究結果見圖4。番茄植株在接種HNU24 后7、14、21 和28 d 仍可以在番茄植株根部和莖部分離得到HNU24（具有利福平抗性，30μg/mL），且分離到的菌落形態(tài)和HNU24純培養(yǎng)的菌落形態(tài)一致，表明HNU24 在番茄植株根部和莖部都可以穩(wěn)定定殖。從番茄植株根部分離出的HNU24菌落數(shù)明顯多于番茄植株莖部，說明HNU24主要存在于番茄植株的根部，其在根部定殖后可以轉移到番茄莖部。

圖4 貝萊斯芽孢桿菌HNU24在番茄根部和莖部的定殖實驗Figure 4 Colonization experiment of the Bacillus velezensis HNU24 on tomato roots and stems

3 討論

芽孢桿菌能產生多種拮抗活性物質和抗逆性強的芽孢并易于在植物根際定殖，已成為國內外生防微生物研究的熱點[11]。本研究從健康櫻桃番茄植株的砧木根際分離到貝萊斯芽孢桿菌HNU24菌株。貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種功能性菌種，對農作物致病菌具有廣譜的抗菌活性[12]，對棉花黃萎病病原菌大麗輪枝桿菌（Verticillium dahliaekleb）、白菜黑斑病致病菌（Alternaria brassicae）、番茄灰霉病灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、稻瘟病菌（Pyricularia grisea（Cooke）Sacc）、黑腐菌（Thielaviopsis）等植物病害均有一定的拮抗作用[13-16]。分離于黃瓜根際土的B.velezensisSQR9菌株是一種廣譜拮抗菌，在農業(yè)生產中可作為生物肥料和生物防治劑，能夠形成強健的生物膜，具有突出的根系定殖力，可有效促進植物生長和抑制土傳病害[17]。

本研究結果表明，貝萊斯芽孢桿菌HNU24菌株對茄雷爾氏菌具有拮抗作用，具有防治茄科作物青枯病的潛力，且與國際公認具有良好拮抗效果的同屬芽孢桿菌的FZB42菌株相比效果更好。在共培養(yǎng)實驗中，HNU24的菌落數(shù)和茄雷爾氏菌EP1負相關，在2 d左右HNU24可以將EP1控制在較低水平。HNU24發(fā)酵液粗提物表現(xiàn)出較強的抑菌活性，證明HNU24產生的活性物質可以有效地抑制茄雷爾氏菌的生長，活性物質的產生使HNU24在HNU24和EP1共培養(yǎng)的過程中具有生存優(yōu)勢，從而抑制或殺滅共培養(yǎng)液中的茄雷爾氏菌。大量研究已表明，芽孢菌具有產生多種次級代謝產物的能力，如surfactin、fengycin、bacilysin、bacillaene、macrolactin和difficidin等，且這些產物往往對一些病原真菌和細菌具有較好的抑菌活性。本研究中，HNU24的發(fā)酵液粗提物具有較強的拮抗活性，說明該菌株具有一定的開發(fā)應用潛力。

實驗發(fā)現(xiàn)，同時接種茄雷爾氏菌EP1和貝萊斯芽孢桿菌HNU24的番茄植株青枯病發(fā)病時間明顯延后，且發(fā)病率從82%降到39%，表明HNU24對茄雷爾氏菌引起的番茄青枯病具有良好的防治效果。本研究結果還證明HNU24在番茄植株根部的定殖能力較強，而且對海南高溫環(huán)境的適應性良好。由于茄雷爾氏菌往往是從根部侵染，且HNU24可以在根部很好地定殖，因此在種植番茄時進行蘸根或灌根處理可以在其根部形成有效的生物屏障，從而阻止茄雷爾氏菌的侵入。本研究在番茄的莖部也分離到HNU24菌株，證明HNU24菌株可以從根部轉移到莖部，從而更加有效地防止病原菌的入侵。Luisa等研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌EA-CB0575在香蕉和番茄根際有效定殖的同時還表現(xiàn)出一定的促生長作用[18]。Priyanka等獲得的芽孢桿菌MT7菌株同樣具有顯著促進植物生長的作用[19]。MENG 等的實驗結果表明，來源于馬鈴薯疥瘡病抑菌型土壤的B.velezensis BAC03菌株具有ACC脫氨酶活性和分泌IAA的能力，對甜菜、胡蘿卜、黃瓜、胡椒、馬鈴薯、蘿卜、南瓜、番茄和蘿卜等9種作物都具有一定的促生長作用[20-22]。本研究利用貝萊斯芽孢桿菌HNU24菌懸液通過噴灑和灌根2種方式處理番茄幼苗后，番茄幼苗的株高、莖粗、鮮重和根系長度等各項指標與對照組相比都表現(xiàn)出不同程度的增加，葉面噴施的處理方式具有較好的促生長效果，操作簡便，易于相關產品的推廣。