楊會(huì)珍， 胡 廣， 苗 蘭， 彭 勍， 任常英， 孫明謙， 林 力

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院， 北京 100091)

血瘀證是指離經(jīng)之血不能及時(shí)排出或消散而停留在人體的某部，或血液運(yùn)行不暢瘀積于經(jīng)脈或器官內(nèi)所出現(xiàn)的證候，主要的致病因素為情志失調(diào)、痰凝和寒邪等。作為一種常見(jiàn)的中醫(yī)證候，血瘀證見(jiàn)于多種疾病如冠心病、子宮肌瘤等發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。中醫(yī)認(rèn)為氣為血之帥，氣行則血行、氣滯則血瘀。情志失調(diào)如憂思焦慮、狂躁大怒等，均可引起氣血運(yùn)行失常和瘀血內(nèi)?！，F(xiàn)代研究表明，在焦慮、抑郁等情緒狀態(tài)下人體的交感神經(jīng)功能亢進(jìn)，血液中腎上腺素和去甲腎上腺素分泌增加[1]，因此以往研究中多采用腎上腺素進(jìn)行血瘀證的造模。

臨床上氣滯血瘀的形成是一個(gè)“久病成瘀”的長(zhǎng)期過(guò)程，具有“久病”“慢病”的特點(diǎn)[2]。但文獻(xiàn)常見(jiàn)單次大劑量注射腎上腺素復(fù)合冰水刺激建立的血瘀模型[3，4]，該模型是一種急性應(yīng)激模型，并不符合血瘀證在中醫(yī)理論上由氣機(jī)郁滯發(fā)展到血瘀的證候變化。本研究擬采用小劑量腎上腺素長(zhǎng)期給藥的方法進(jìn)行造模，模擬長(zhǎng)時(shí)間焦慮抑郁導(dǎo)致慢性血瘀，更符合臨床致病特點(diǎn)。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要分支，通過(guò)考察生物體受刺激擾動(dòng)后其內(nèi)源性代謝物種類、數(shù)量及變化規(guī)律來(lái)判斷機(jī)體狀態(tài)，目前已成為疾病診斷研究的重要手段[5]。本文擬應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)腎上腺素致慢性血瘀證大鼠模型進(jìn)行研究，挖掘其生物標(biāo)志物及相關(guān)代謝途徑，為揭示血瘀證的發(fā)病機(jī)制和藥物的研發(fā)提供依據(jù)。本研究通過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)2021XLC011-2)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量150～180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境設(shè)施中，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及潔凈飲用水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜各半交替，溫度 18～22 ℃，通風(fēng)良好，濕度恒定。

1.2 藥物、試劑與儀器

鹽酸腎上腺素注射液(1 mL，1 mg/支，天津金耀藥業(yè)有限公司，貨號(hào)2002031)；甲醇(貨號(hào)194253)和乙腈(貨號(hào)194063)均為色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；甲酸(貨號(hào)17 M8207)，購(gòu)自ROE SCIENTIFIC INC公司。

Q-ExactiveOrbitrap四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀并配有熱噴霧離子源(HESI)，Xcalibur4.1化學(xué)工作站，美國(guó)ThermoScientific公司；Vanquish超高效液相色譜系統(tǒng)(含二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，DAD檢測(cè)器)，美國(guó)ThermoScientific公司；PL-12血小板分析儀，江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司；LBY-N6C全自動(dòng)清洗血流變儀，北京普利生儀器有限公司；MilliporeSynergyUV型超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；SartoriousBT25 S型萬(wàn)分之一電子分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

2 方法

2.1 分組與造模

22只大鼠隨機(jī)分為正常組和血瘀證模型組各11只，正常組不給予任何操作，血瘀證模型組大鼠背部皮下注射鹽酸腎上腺素溶液0.6 mg/kg，每日注射1次，連續(xù)注射1周。

2.2 樣本采集

取材前1 d所有大鼠均禁食12 h。造模第7天記錄大鼠體質(zhì)量及體征變化，血瘀證模型組大鼠末次注射腎上腺素1 h后，3.5%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，抗凝后分別用于全血黏度(低切5 s-1，中切60 s-1，高切150 s-1)和ADP(adenosine diphosphate，二磷酸腺苷)誘導(dǎo)的血小板聚集率的測(cè)定，剩余肝素化抗凝血漿置于-80 ℃凍存，用于代謝組學(xué)研究。

2.3 代謝組樣品制備

凍存血漿在室溫下解凍，精密吸取各組樣本50 μL，分別加入200 μL冷有機(jī)溶液(乙腈：甲醇=1∶1)，渦旋混合，4 ℃ 16500 g離心12 min，取上清液進(jìn)行分析。

2.4 液質(zhì)條件

液相條件：色譜分離采用Thermo Scientific的U3000快速液相色譜，使用反相色譜對(duì)血漿樣本進(jìn)行分析。液相分離采用色譜柱：Waters UPLC BEH C18(1.7um 2.1 mm×100 mm)。流動(dòng)相A相為0.1%甲酸的乙腈液, B相為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫，25% B；0～10 min，90 %B；10～11 min，90%B；11～13 min，25%B，14 min停止。2針之間平衡時(shí)間為1 min。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，樣品室溫度為4 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件為正負(fù)離子檢出模式，離子源溫度350 ℃，噴霧電壓3.5 KV，S-LensRF電壓60 V，毛細(xì)管溫度300 ℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)?純度>99.99%)，鞘氣流速35arb，輔助氣流速10arb。數(shù)據(jù)采集采用一級(jí)全掃描(數(shù)據(jù)采集范圍100～1200 m/z)與數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描，碰撞模式采用高能量碰撞解離(high energy collision dissociation，HCD)。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Xcalibur 2.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用CompoundDiscoverer2.0軟件對(duì)具有精確分子量的MS1和MS2質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行mzCloud譜圖匹配和Chemspider、HMDB以及Kegg Pathways等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，參數(shù)為MS1質(zhì)量精度<5ppm，譜庫(kù)搜索算法為High Chem Low+High Res，打分匹配閾值>60(越高匹配越準(zhǔn)確，最高為100)，搜索過(guò)程中進(jìn)行同位素匹配以及背景噪音扣除等處理。未被指認(rèn)的代謝產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行Metlin等二級(jí)譜圖搜庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)控(quality control，QC)樣本由等量的不同樣本混合制成，在液質(zhì)分析過(guò)程每6個(gè)樣本進(jìn)1個(gè)QC樣本。為保證樣品檢測(cè)中的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中QC的變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)值小于30%作為質(zhì)譜檢測(cè)到成分的篩選標(biāo)準(zhǔn)，大于30%的變量不進(jìn)入下一步分析。

將所得樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)在線分析軟件MetaBoanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)，采用無(wú)監(jiān)督的主成分分析(principal components analysis，PCA)和有監(jiān)督的偏最小二乘法(partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA)進(jìn)行模式識(shí)別分析，通過(guò)PLS-DA的變量投影重要性(ariable importancein projection，VIP)值，篩選變化顯著的差異代謝物，并將找到的差異代謝物導(dǎo)入HMDB(humanmetabolome databatabase)和KEGG(kyotoencyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和確認(rèn)，最終鑒定出與血瘀證相關(guān)的生物標(biāo)志物。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠證候變化

血瘀證模型組大鼠懈怠懶動(dòng)，皮毛疏松粗糙，毛色發(fā)黃無(wú)光澤，進(jìn)食量減少，大便溏爛，弓背，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)量下降明顯(表1)。正常組大鼠毛色有光澤，食欲正常，好動(dòng)，反應(yīng)靈敏。

表1 正常組與血瘀證模型組大鼠造模前后體質(zhì)量比較

3.2 各組大鼠血液流變學(xué)和血小板聚集水平比較

表2、3示，與正常組比較，血瘀證模型組大鼠的全血黏度在不同切變率下均顯著升高(P<0.01)，血小板聚集率也顯著增加(P<0.01)，表明造模后大鼠血液黏滯，凝血功能活躍，血瘀證大鼠造模成功。

表2 正常組與血瘀證模型組大鼠不同切變率下全血黏度比較

表3 正常組與血瘀證模型組大鼠血小板聚集率比較

3.3 數(shù)據(jù)分析

為更直觀地分析注射腎上腺素對(duì)大鼠血漿樣本代謝物譜的影響，將正常組和血瘀證模型組大鼠的血漿代謝物譜分別采用PCA和PLS-DA進(jìn)行模式識(shí)別，得到二者的模式識(shí)別圖(如圖1)。在正負(fù)離子模式下，模型組與正常組血漿樣本間均呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別，說(shuō)明大鼠造模后體內(nèi)內(nèi)源性小分子代謝物發(fā)生了明顯變化，表明慢性血瘀證模型造模成功。

注：A.血瘀證模型組與正常組的正離子主成分分析(principal components analysis，PCA)得分圖；B.血瘀證模型組與正常組的正離子偏最小二乘法(partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA，R2=0.949,Q2=0.868)得分圖；C.血瘀證模型組與正常組的負(fù)離子PCA得分圖；D.血瘀證模型組與正常組的負(fù)離子PLS-DA(R2=0.963,Q2=0.785)得分圖圖1 血瘀證模型組(M)和正常組(N)血漿樣本模式識(shí)別圖

3.4 潛在生物標(biāo)志物的發(fā)掘與鑒定

本實(shí)驗(yàn)主要發(fā)掘注射腎上腺素誘導(dǎo)血瘀證的生物標(biāo)志物，篩選出對(duì)慢性血瘀證模型組和正常組的區(qū)分產(chǎn)生較大作用的成分，即為血瘀證血漿中的潛在生物標(biāo)志物。根據(jù) PLS-DA 模型的VIP值、變異系數(shù)(FC)分析、T檢驗(yàn)進(jìn)行篩選，以VIP>1、FC>1.5、P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)C指血瘀證模型組相對(duì)于正常組的變化倍數(shù)。對(duì)篩選到的生物標(biāo)志物進(jìn)行聚類分析得到熱圖(如圖2)，可以看出正常組和血瘀證模型組能夠明顯區(qū)分且組內(nèi)聚類良好，表明篩選得到的生物標(biāo)志物較為可靠。

圖2 正常組與血瘀證模型組大鼠血漿差異代謝物熱比較

與正常組比較，在正負(fù)離子模式下血瘀證模型組共篩選出差異代謝物17種(見(jiàn)表4)，并與不同組別生物標(biāo)志物強(qiáng)度進(jìn)行了比較(見(jiàn)圖3)。與正常組比較，阿拉伯糖酸、戊酰基乙醇酰胺以及LysoPI(20∶4/0∶0)等成分含量上升，α-亞麻酸、?；侨パ跄懰帷⑴；蛆Z去氧膽酸、苯酚硫酸鹽、順烏頭酸、乳酸以及磷脂酰膽堿等成分含量下降。這些代謝產(chǎn)物主要參與膽汁酸代謝、α-亞麻酸代謝、色氨酸代謝和能量代謝等代謝通路。

圖3 正常組與血瘀證模型組生物標(biāo)志物強(qiáng)度比較

表4 正常組與慢性血瘀證組大鼠的血漿差異代謝物比較

4 討論

血瘀證是中醫(yī)常見(jiàn)的一種證候，本研究采用長(zhǎng)期小劑量注射腎上腺素模擬長(zhǎng)期氣滯所致的慢性血瘀證，并以血液流變學(xué)及血小板聚集率作為指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

代謝組學(xué)的測(cè)定結(jié)果顯示，血瘀證模型組大鼠體內(nèi)的?；侨パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸等膽汁酸類成分的含量發(fā)生了顯著變化。膽汁酸在體內(nèi)具有重要的生理作用，不僅可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[6，7]，而且與腸道菌群的穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，還參與膽固醇的吸收和排泄[8-11]。血瘀證模型組大鼠體內(nèi)膽汁酸含量下降，能夠引起膽固醇代謝水平的紊亂，從而加劇血液黏度的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，慢性血瘀證模型大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂，表現(xiàn)為磷脂類成分磷脂酰膽堿(PC，O-16∶1/2∶0)和鞘磷脂(SM，d18∶1/24∶1)含量顯著下降，可進(jìn)一步導(dǎo)致能量代謝異常和炎性反應(yīng)。血瘀證模型中出現(xiàn)的膽汁酸與脂質(zhì)代謝異常都將進(jìn)一步加劇血脂代謝紊亂，促進(jìn)血瘀證的發(fā)展。

注射腎上腺素后，血瘀證模型組大鼠的硫酸吲哚酚(3-Indoxyl sulphate, IS)與苯硫酸酯(phenol sulfate, PS)含量顯著下降，這2種成分都是重要的腸道菌群代謝物。IS是色氨酸代謝的最終產(chǎn)物，膳食色氨酸在腸道菌群表達(dá)的色氨酸酶作用下轉(zhuǎn)化為吲哚及其衍生物，最終在肝臟中硫酸化為IS[12，13]。而IS的含量異常提示血瘀證形成后體內(nèi)腸道菌群以及色氨酸的代謝受到了干擾。色氨酸代謝后能夠生成5-羥色胺，而5-羥色胺與情緒密切相關(guān)，具有抗抑郁、抗焦慮的作用，在外周組織5-羥色胺也與血管和平滑肌的收縮有關(guān)。因此IS含量下降提示，血瘀證患者除腸道菌群發(fā)生異常變化之外，色氨酸的代謝途徑也發(fā)生了變化，可能與其情志的變化密切相關(guān)。酪氨酸酚裂解酶將飲食中的酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸椒覽14]，后者在宿主肝臟中進(jìn)一步代謝為PS，酪氨酸可以產(chǎn)生多巴胺，多巴胺是一種具有獎(jiǎng)賞作用的神經(jīng)遞質(zhì)，與抑郁癥等疾病關(guān)系密切。這2種色氨酸與酪氨酸的腸源性代謝產(chǎn)物變化，提示氣滯血瘀模型大鼠腸-腦軸相關(guān)途徑可能出現(xiàn)紊亂，氣滯血瘀模型的情志變化可能與腸道菌群的變化密切相關(guān)。

此外，模型組大鼠馬尿酸的含量也出現(xiàn)了明顯下降。馬尿酸是苯甲酸與甘氨酸通過(guò)甘氨酸N-?；D(zhuǎn)移酶催化得到的?；拾彼?，同時(shí)也是一個(gè)與腸道菌群密切相關(guān)的內(nèi)源性代謝成分[15]。腸道微生物群將多酚轉(zhuǎn)化為苯甲酸，在人體肝臟和腎臟中與甘氨酸結(jié)合后，苯甲酸又轉(zhuǎn)化為馬尿酸。本研究發(fā)現(xiàn)，氣滯血瘀模型大鼠的多個(gè)異常生物標(biāo)志物都與腸道菌群密切相關(guān)，該模型中腸道菌群受到了較為明顯的影響。

在氣滯血瘀模型中，與能量代謝相關(guān)的小分子有機(jī)酸和脂肪酸也受到了干擾，如乳酸、順烏頭酸和3-羥基丁酸等成分代謝都出現(xiàn)了異常。乳酸是糖酵解的重要產(chǎn)物，順烏頭酸參與三羧酸循環(huán)，3-羥基丁酸可以通過(guò)酮體代謝產(chǎn)生能量。這些小分子成分在血液中的含量下降，提示能量代謝受到了干擾。血瘀證模型組大鼠α-亞麻酸、二十碳三烯酸與棕櫚烯酸含量也出現(xiàn)了顯著性降低，提示血瘀模型大鼠脂肪酸的代謝可能出現(xiàn)了異常[16]。長(zhǎng)鏈脂肪酸是能量代謝的重要原料，通過(guò)肉堿穿梭系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到線粒體進(jìn)行beta氧化，生成二氧化碳和水并產(chǎn)生能量。其含量的下降可能提示該模型中線粒體能量代謝受到了抑制[17]。多個(gè)能量代謝相關(guān)的不同內(nèi)源性成分變化，說(shuō)明在血瘀形成過(guò)程中能量代謝的不同環(huán)節(jié)都發(fā)生了改變，提示血瘀證模型的能量代謝途徑受到了干擾。

綜上所述，本文采用LC -MS對(duì)長(zhǎng)期小劑量皮下注射腎上腺素建立的大鼠慢性血瘀證模型進(jìn)行代謝組學(xué)分析，與正常組比較，血瘀證模型組主要在膽汁酸代謝、甘油磷脂代謝、腸道菌群代謝和能量代謝等方面發(fā)生了紊亂。運(yùn)用代謝組學(xué)方法尋找慢性血瘀證模型的生物標(biāo)志物及相關(guān)代謝途徑，為臨床診斷及治療血瘀證提供了參考。