胡 鑫，朱 娜，王 琴（解放軍廬山康復(fù)療養(yǎng)中心/原解放軍171 醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江西九江332000）

非小細胞肺癌（non -small cell lung cancer，NSCLC）是臨床最常見的惡性腫瘤，約占全部肺癌的85%以上。目前，手術(shù)、放化療、分子靶向治療等治療手段取得巨大進步，但由于約75%的NSCLC患者確診時已處于中晚期，5年生存率低下[1-2]。因此，應(yīng)重視早期診斷、早期治療，并針對不同類型的肺癌采用不同的治療方案。其中，分子靶向治療在晚期NSCLC的治療上逐漸得到臨床的廣泛認同，被認為是特異度最高的肺癌個體化治療方案。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類單鏈非編碼小分子RNA，在腫瘤組織中性質(zhì)穩(wěn)定、功能廣泛，能夠參與并調(diào)控腫瘤的生長和凋亡[3-4]。大量研究證實，miR-23a，miR-29a的異常表達與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。但目前關(guān)于miR-23a，miR-29a在NSCLC患者靶向治療效果中的作用研究較少，本研究通過檢測血清miR-23a，miR-29a表達，旨在探究其對NSCLC患者靶向治療效果的預(yù)測價值，以期為NSCLC的診療提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年12月～2019年6月解放軍廬山康復(fù)療養(yǎng)中心收治的NSCLC患者102例為觀察組，選擇同期本院的健康體檢者102 例為對照組。觀察組男性59 例，女性43 例，平均年齡59.21±8.22 歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為22.42±2.52 kg/m2，其中腺癌70 例，鱗癌32 例；Ⅲb 期41 例，Ⅳ期61 例；中高分化69 例，低分化33 例。對照組男性52 例，女性50 例，平均年齡58.11±8.43 歲，平均BMI 為21.96±2.39 kg/m2。兩組年齡、性別及BMI 比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。納入標準：①均經(jīng)過細胞學或組織病理檢查確診為NSCLC；②既往未接受過放、化療及靶向治療等治療；③臨床資料完整；④患者及其家屬知情同意，并簽署同意書。排除標準：①并發(fā)心、肺、肝、腎等器官嚴重疾病患者；②并發(fā)其他惡性腫瘤患者；③精神疾病患者。

本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準通過，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 miScript SYBR?Green qPCR Mix（貨號218073），購自德國QIAGEN 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號ALH266-PTO），購自北京百奧萊博科技有限公司；RNA 提取試劑盒（貨號15596-026），購自美國Invitrogen 公司。NanoDrop 微量分光光度計和Applied Biosystems qRT-PCR 儀，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Allegra X-15R低溫高速離心機，購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 治療方法：NSCLC患者靶向治療藥物選擇鹽酸厄洛替尼（國藥準字 H20060108）治療，用法用量：口服，150mg/天，療程8 周，治療2～4 個療程后進行療效評價。

1.3.2 采集標本：NSCLC患者于治療前、治療后及健康體檢者于體檢時抽取靜脈血5ml，3 000 r/min離心30 min 后取上清液即血清，冷凍保存待測。

1.3.3 血清miR-23a，miR-29a水平檢測：采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）法檢測所有研究對象血清miR-23a，miR-29a表達水平。提取血清樣本總RNA，紫外分光光度法鑒定各樣本提取的RNA 純度和完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行qRT-PCR 反應(yīng)。miR-23a 上游引物：5’-GGGGATCACATTGCCAGG-3’，下游引物：5’-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’；miR-29a 上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCACCATCTGAA-3’，下游引物：5’-CTCAACTGGTGTGGTGGA3’；內(nèi)參U6 上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATA CTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAAT TTG CGTGTCAT-3’；均由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計及合成。反應(yīng)體系20μl：miScript SYBR?Green Mix 10μl，cDNA 4.0μl，上下游引物（10 μmol/L）各1μl，ddH2O 4.0μl。擴增條件：92℃ 60s；95℃30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共42 個循環(huán)。每例樣本均經(jīng)3 孔重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束，以2-ΔΔCt法計算血清miR-23a，miR-29a 相對表達量。

1.3.4 療效評價：療效評價依據(jù)實體腫瘤的療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumors,RECIST)[7]。完全緩解：病灶消失≥4 周；部分緩解：腫瘤最大徑縮小≥30%且至少持續(xù)4 周；疾病進展：腫瘤最大徑增大＞20%或出現(xiàn)新病灶；病情穩(wěn)定：腫瘤變化介入部分緩解及疾病進展之間。完全緩解+部分緩解為治療有效，病情穩(wěn)定+疾病進展為治療無效。

1.4 統(tǒng)計學分析 運用統(tǒng)計學軟件SPSS20.0 對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料以例（n）或[n（%）]表示，采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前、后miR-23a和miR-29a表達水平比較采用配對樣本t檢驗；采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curves，ROC 曲線）分析血清miR-23a，miR-29a水平對靶向治療效果的預(yù)測價值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對照組血清miR-23a，miR-29a水平比較 觀察組血清miR-23a（1.26±0.31），miR-29a（1.35±0.42）水平均明顯高于對照組（0.98±0.28，1.01±0.30），差異均有統(tǒng)計學意義（t=6.770,6.653，均P＜0.001）。

2.2 血清miR-23a，miR-29a與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。血清miR-23a，miR-29a水平均與NSCLC患者臨床分期及分化程度有關(guān)（均P＜0.05），與患者年齡、性別、病理類型無關(guān)（均P＞0.05）。

表1 血清miR-23a，miR-29a與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系（n=102，±s）

表1 血清miR-23a，miR-29a與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系（n=102，±s）

類 別nmiR-23at 值P 值miR-29at 值P 值年齡（歲）≤60401.23±0.26 1.1430.256 1.32±0.35 1.1450.255＞60621.31±0.391.41±0.41性別男591.29±0.35 0.7730.441 1.37±0.42 0.6000.550女431.24±0.281.32±0.41病理類型腺癌701.25±0.32 0.3070.760 1.39±0.43 0.9880.326鱗癌321.27±0.271.30±0.42臨床分期Ⅲb 期411.33±0.31 2.1590.033 1.42±0.39 2.1280.036Ⅳ期611.20±0.291.26±0.36分化程度中高691.12±0.28 7.503＜0.001 1.28±0.29 2.1270.036低331.55±0.251.43±0.41

2.3 治療前后NSCLC患者血清miR-23a，miR-29a表達水平比較 治療后，NSCLC患者血清miR-23a（1.08±0.22 vs 1.26±0.31），miR-29a（1.11±0.31 vs 1.35±0.42）表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.782，4.643，均P＜0.05）。

2.4 臨床療效 102 例NSCLC患者經(jīng)治療后，完全緩解11 例，部分緩解39 例，病情穩(wěn)定31 例，疾病進展21 例；總有效（完全緩解+部分緩解）50 例，總有效率49.02%；無效（病情穩(wěn)定+疾病進展）52 例，無效率50.98%。

2.5 NSCLC患者血清miR-23a，miR-29a水平與臨床療效的關(guān)系 治療后，治療有效NSCLC患者血清miR-23a（1.05±0.21 vs 1.20±0.29），miR-29a（1.08±0.28 vs 1.27±0.31）水平均低于治療無效患者，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.982，3.244，均P＜0.05）。

2.6 血清miR-23a，miR-29a水平對NSCLC患者靶向治療效果的預(yù)測價值 見圖1。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-23a 預(yù)測靶向治療效果的曲線下面積為0.688（95%CI 0.585～0.791，P＜0.001），截斷值為1.184，敏感度為72.0%，特異度為63.5%。血清miR-29a 預(yù)測靶向治療效果的曲線下面積為0.768（95%CI：0.677～0.859，P＜0.001），截斷值為1.121，敏感度為66.0%，特異度為78.8%。血清miR-23a，miR-29a 聯(lián)合預(yù)測靶向治療效果的曲線下面積為0.821（95%CI 0.741～0.901，P＜0.001），敏感度為94.0%，特異度為55.8%。

圖1 ROC 曲線分析血清miR-23a，miR-29a水平對靶向治療效果的預(yù)測價值

3 討論

肺癌已成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，NSCLC 約占肺癌的80%。NSCLC 早期臨床癥狀隱匿，手術(shù)和化療是NSCLC 主要治療方案，但大部分NSCLC患者確診時已屬晚期，治療效果較差，5年生存率較低[8-9]。分子靶向治療是采用分子靶向藥物阻斷信號傳遞，減少腫瘤血管生成進而延緩腫瘤進程的治療方式，其可選擇性地對腫瘤細胞有更強的殺傷作用，而相對于正常細胞損傷較低。近來研究表明，靶向治療作為晚期NSCLC 尤其基因突變患者首選治療方案，已為臨床廣泛接受[10-11]。而尋找肺癌相關(guān)分子標志物對于提高NSCLC 早期診斷率和治療效果預(yù)測有重要臨床意義。

miRNA 是一類長度約為21～25 個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，人類基因組中約有三分之一的基因受到miRNA 調(diào)控，能夠參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的各個階段。在肺癌發(fā)生過程中，可作為致癌基因或抑癌基因，在NSCLC 早期診療和預(yù)后判斷等方面具有重要作用，有望成為NSCLC 診治和預(yù)后預(yù)測的新分子標志物[12-13]。miR-23a 是miRNA家族中的一員，定位于核染色體19p13.12，在肺癌形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13-14]。HETTA 等[13]研究報道，肺癌遠處轉(zhuǎn)移患者血漿miR-23a表達水平較未轉(zhuǎn)移患者高，且血漿miR-23a表達水平升高與腫瘤大小有關(guān)，可作為評估肺癌病情發(fā)展的依據(jù)。何嶸等[14]研究指出，miR-23a 在NSCLC 中存在異常高表達，其可能是潛在的肺癌預(yù)后分子標志物。在肺癌的治療中，高表達的miR-23a 會降低肺癌細胞對放療的敏感度，又可以通過促進耐藥基因及其蛋白的表達削弱放化療治療效果。本研究中，觀察組血清miR-23a水平明顯高于對照組，且低分化NSCLC患者血清miR-23a水平較中高分化患者高，與HETTA 等[13-14]研究結(jié)果相似。同時發(fā)現(xiàn)NSCLC患者治療后，血清miR-23a表達水平降低，且治療有效患者較治療無效患者低，表明miR-23a可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，監(jiān)測NSCLC患者血清miR-23a水平可能有助于預(yù)測靶向治療的效果。本研究通過ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-23a預(yù)測靶向治療效果的曲線下面積為0.688，進一步表明miR-23a 可能作為一種新的腫瘤標志物預(yù)測靶向治療的效果，當血清miR-23a水平低于1.184 時，提示靶向治療效果較為顯著，但其單獨檢測敏感度、特異度相對較低，可考慮與其他指標聯(lián)合檢測以提高診斷價值。

研究表明，miR-29a的相關(guān)靶基因PTEN 是與人類腫瘤相關(guān)性較高的一種抑癌基因，miR-29a 可能通過與其靶基因3’-UTR 相結(jié)合而調(diào)節(jié)PTEN，進而參與癌癥的發(fā)生與發(fā)展，其異常表達與NSCLC密切相關(guān)[15-17]。LIU 等[18]研究報道，NSCLC 組織中miR-29a表達水平明顯高于正常肺組織，miR-29a 高表達患者具有更短的中位生存時間。劉文秀等[19]研究發(fā)現(xiàn)，2 Gy/天輻照第3 天時，NSCLC 細胞外泌體miR-29a表達水平明顯降低，其降低水平與患者胸部放射治療劑量明顯相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，觀察組血清miR-29a水平較對照組高，低分化NSCLC患者血清miR-29a水平較中高分化患者高，治療后血清miR-29a表達水平降低，且治療有效患者血清miR-29a表達水平較治療無效患者低，與LIU 等[18-19]研究類似，表明miR-29a 可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其水平變化能夠在一定程度上提示靶向治療效果。進一步ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-29a 預(yù)測靶向治療效果的曲線下面積為0.768，表明血清miR-29a 可能作為一種新的預(yù)測NSCLC 靶向治療效果的腫瘤標志物，通過檢測患者血清miR-29a水平有助于預(yù)測NSCLC 靶向治療的有效性，當血清miR-29a 低于1.121 時提示靶向治療的有效性較高。此外，血清miR-23a，miR-29a 聯(lián)合預(yù)測靶向治療效果的曲線下面積、敏感度較二者單獨檢測有所提高，表明二者聯(lián)合可在一定程度上提高對靶向治療效果的預(yù)測價值，且二者可能通過調(diào)控其共同靶基因PTEN 等影響癌細胞增殖、凋亡，進而在靶向治療過程中發(fā)揮一定作用[17,20]。

綜上所述，NSCLC患者血清miR-23a，miR-29a表達水平均明顯升高，治療后二者表達水平均明顯降低，檢測二者水平有助于NSCLC 靶向治療效果預(yù)測。但本研究僅從血清表達水平上初步探討了miR-23a，miR-29a與NSCLC 靶向治療的關(guān)系，后期尚需前瞻性、多中心及大樣本臨床實驗深入研究，深入探討分析二者在NSCLC 靶向治療中的具體作用機制及其臨床實用價值。