孫小添 王海超 郭根勝 裴志永

摘 要：針對傳統(tǒng)葉片橫切面寬度測量效率低、重現(xiàn)性差、勞動強度大，以及已有圖像處理算法精度不高等問題，本研究提出一種基于變分水平集主動輪廓算法來提高葉片圖像分割效果，從而更準(zhǔn)確地測量細(xì)胞厚度。以狹葉錦雞兒（Caragana Stenophylla Pojark）葉切片表皮細(xì)胞為研究對象，依據(jù)圖像特點，首先采用基于幾何均值和三維塊匹配算法，實現(xiàn)圖像盲去噪;然后采用變分水平集主動輪廓算法，分割預(yù)處理后圖像提取表皮細(xì)胞;最后采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細(xì)胞輪廓2交點，通過計算2交點間的距離，并除以對應(yīng)比例關(guān)系，得出表皮細(xì)胞實際厚度。結(jié)果表明，①圖像經(jīng)去噪后，有效去除圖像噪聲，圖像質(zhì)量明顯提高，相較傳統(tǒng)Lazy Snapping算法和Graph Cut算法，本文提出算法雖耗時較長，但分割效果很明顯，平均分割誤差（R）、過分割誤差（OR）和欠分割誤差（UR）分別為5.670%、0.589%和5.900%，所用時間為30.228 s;② 通過與交互測量值的比較得出，本文算法測量值與交互測量值間相對誤差為3.27%，均方根誤差為0.983，相對較小，結(jié)果較準(zhǔn)確;③通過對同一幅圖像30次重復(fù)測量后發(fā)現(xiàn)，相較ToupTek（高分辨率智能顯微鏡成像CCD相機）Toupview軟件交互測量方法，本文算法用時更短，穩(wěn)定性較高，誤差為0.007。

關(guān)鍵詞：厚度測量;變分水平集;主動輪廓;表皮細(xì)胞;狹葉錦雞兒

中圖分類號：TP391.41;S77??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2022）02-0001-07

Extraction and Thickness Measurement of Leaf Epidermal Cells Based

on Active Contour of Variational Level Set Method

SUN Xiaotian， WANG Haichao， GUO Gensheng， PEI Zhiyong*

（College of Energy and Transportation Engineering， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China）

Abstract：Aiming at the problems of low efficiency， high labor intensity， poor reproducibility and low accuracy of the existing image processing algorithms， in this study， an active contour algorithm based on variational level set was proposed to improve the segmentation effect of leaf image， so as to measure cell thickness more accurately. The epidermal cells of Caragana Stenophylla Pojark leaf slice were taken as the research object. Based on the image characteristics， the geometric mean and 3D block matching algorithm were firstly adopted to realize image blind denoising. Then the active contour algorithm based on variational level set was used to segment the pre-processed epidermal cell images and realize the extraction of epidermal cells. Finally， the fast marching skeleton extraction algorithm was used to determine the intersection of the vertical line of the local fitting center line on the skeleton curve and the epidermal cell contour. The actual thickness of epidermal cells was obtained by calculating the distance between the two intersections and dividing it by the corresponding proportional relationship. The results showed that： ① After denoising， the image noise was effectively removed and the image quality was significantly improved. Compared with traditional Lazy Snapping algorithm and Graph Cut algorithm， the algorithm proposed in this paper took a long time， but the segmentation effect was obvious. Mean segmentation error （R）， over-segmentation error （OR） and under-segmentation error （UR） value were 5.670%， 0.589% and 5.900%， respectively， the average time was of 30.228 s. ② Through the comparison with the interactive measured values， the relative error between the measured values and the interactive measured values of the algorithm in this paper was 3.27%， and the root mean square error was 0.983， which was relatively small and the results were relatively accurate. ③ After repeated measurement of the same image for 30 times， it was found that， compared with the interactive measurement method of ToupTek Toupview software， the algorithm in this paper had shorter time， higher stability with an error of 0.007.

Keywords：Thickness; variational level set method; active contour; epidermal cells; Caragana Stenophylla

0 引言

狹葉錦雞兒（Caragana stenophylla Pojark）是我國北方荒漠草原優(yōu)勢物種，屬強旱生小灌木，具有良好的防風(fēng)固沙性能。經(jīng)過對其研究發(fā)現(xiàn)，干旱程度與表皮細(xì)胞直徑呈正相關(guān)，葉片通過增大表皮細(xì)胞直徑抑制水分蒸騰，在一定程度上提高水分利用率。表皮細(xì)胞尺寸的準(zhǔn)確測量，對植物生理生態(tài)學(xué)研究十分重要。表皮細(xì)胞厚度為表皮細(xì)胞直徑與角質(zhì)層厚度之和，該指標(biāo)的準(zhǔn)確測定對揭示植被對環(huán)境變化的響應(yīng)機制具有重要意義，由于葉切片顯微圖像具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、邊界模糊、存在噪聲和色差等特點，制約了傳統(tǒng)尺寸測量算法在葉切片表皮細(xì)胞厚度測量中的應(yīng)用。

傳統(tǒng)指標(biāo)尺寸測量常采用交互測量方式，該方式存在較大的人為主觀因素干擾，不但效率低，勞動強度大，而且誤差和重現(xiàn)性較差。目前，由于圖像處理技術(shù)蓬勃發(fā)展，圖像處理技術(shù)被廣泛應(yīng)用于特征指標(biāo)尺寸測量。紀(jì)平等選擇Canny算子對番茄邊緣進(jìn)行提取，通過對番茄面積、圓心和半徑等參數(shù)的統(tǒng)計分析，進(jìn)行圓擬合，實現(xiàn)了各幾何尺寸測量;包能勝等提出一種新的算法實現(xiàn)了輥式涂布涂層厚度測量，其基于啟發(fā)式蟻群算法與傳統(tǒng)機理建模法相比，最大誤差為5.74%，平均誤差為4.04%;路文超等通過擬合麥穗主部中心線方式和統(tǒng)計曲線穿過麥穗?yún)^(qū)域方式計算麥穗長度和麥穗數(shù)量，測量結(jié)果絕對誤差為0.47 cm，相對誤差為3.95%。曾德斌等通過對羊只圖像預(yù)處理、分割和輪廓提取等算法，實現(xiàn)了羊只個體體長和提高了測量精度，測量平均相對誤差小于1%，相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.999 7。Sunoj等針對向日葵花大小人工測量尺寸存在主觀和費時的缺點，開發(fā)了一種ImageJ用戶編碼插件，該插件采用字段圖像采集方式，用于測量單個向日葵尺寸，與直接法相比，采用包裹多邊形法十分有效，等效直徑和擬合橢圓短軸有較高相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.88;Jin等提出一種基于雙投影的孔尺寸測量方法，使用CCD相機分別采集在零件表面上2個方向投影的光柵圖像，采用相移位法計算2個方向上的光柵圖像的相位，將構(gòu)建的2個方向上的三維圖像合并起來測量孔的尺寸，其厚度測量精度0.04 mm，孔尺寸精度0.1 mm，該方法解決了機械零件表面孔測量不精確問題;Singh等結(jié)合圖像處理和機器學(xué)習(xí)算法，提出一種利用遞歸方法從稻米粒圖像中識別各米粒大小，并根據(jù)每粒稻米粒所占像素來估計籽粒大小，進(jìn)而預(yù)測稻米質(zhì)量，測量小粒稻谷、中粒稻谷、大粒稻谷長度的平均誤差分別為3.6%、2.5%和2.4%。

植物葉片圖像的合理分割，對植物結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確分析十分重要。狹葉錦雞兒葉片解剖結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞與柵欄組織交界十分模糊，且表皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，采用傳統(tǒng)分割算法很難達(dá)到分割效果。變分水平集主動輪廓圖像分割算法是近年來圖像分割領(lǐng)域研究的熱點，針對傳統(tǒng)葉片橫切面寬度測量效率低、重現(xiàn)性差、勞動強度大，以及已有圖像處理算法精度不高等問題，本研究提出一種基于變分水平集主動輪廓算法來提高葉片圖像分割效果。首先采用基于幾何均值和三維塊匹配算法，實現(xiàn)圖像盲去噪;通過變分水平集的主動輪廓算法，分割去噪后的圖像;最后通過采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細(xì)胞輪廓2交點，通過計算2交點間的距離，并除以對應(yīng)比例關(guān)系，實現(xiàn)表皮細(xì)胞厚度測量。

1 材料與方法

1.1 圖像獲取

采用石蠟切片法獲取狹葉錦雞兒葉片表皮細(xì)胞圖像，詳見文獻(xiàn)。本文使用YYS-80E型光學(xué)生物顯微鏡和配套CM1400攝像機進(jìn)行拍照及存儲，根據(jù)視野范圍需求，選擇×40目鏡，圖像分辨率為1 792×1 374，由于人工制片不僅受相機曝光增益的影響，還受溫度和染液濃度等因素的影響，圖像不可避免存在噪聲和色差，如圖1所示。

1.2 圖像分割

1.2.1 圖像去噪

表皮細(xì)胞圖像具有較多的紋理和邊緣信息，較大的噪聲不但影響圖像品質(zhì)，而且會影響后續(xù)圖像分割精度，進(jìn)而影響厚度測量的準(zhǔn)確性。本文針對狹葉錦雞兒葉片表皮細(xì)胞圖像特點，采用基于幾何均值和三維塊匹配算法，實現(xiàn)圖像盲去噪，具體詳見文獻(xiàn)。

1.2.2 圖像分割

狹葉錦雞兒葉片表皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)表現(xiàn)為柵欄組織，采用傳統(tǒng)圖像分割算法很難準(zhǔn)確分割柵欄組織這種邊緣不明顯、表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則的葉片。因此，針對傳統(tǒng)交互式圖像分割算法不精確問題，提出將變分水平集算法與主動輪廓算法相融合，即變分水平集主動輪廓算法。將C-V（Chan-Vese）模型、測地線主動輪廓模型和邊緣檢測算子相融合，使用變分原理對能量泛函進(jìn)行極小化偏微分求解，并依托水平集方式實現(xiàn)函數(shù)表達(dá)。該算法能夠克服主動輪廓曲線演進(jìn)收斂過程中取參過量的問題，同時還能彌補其演進(jìn)過程中無法自由拓?fù)涞牟蛔?，一定程度上解決了算法運行速度慢和普適性的問題。其基本原理如下。

設(shè)有一幅圖像為I，在目標(biāo)區(qū)域任意畫一條閉合曲線C，C內(nèi)部定義為ΩC，即目標(biāo)區(qū)，外部定義為Ω＼ΩC，即分離區(qū)。當(dāng)C離目標(biāo)圖像的邊緣原來越遠(yuǎn)時，C的灰度階級梯度將逐漸減小，反之增大。c1和c2分別為ΩC和Ω＼ΩC的灰度均值，當(dāng)能量函數(shù)E（C，c1，c2）值最小時，其圖像分割更為準(zhǔn)確，其表達(dá)式為

E（C，c1，c2）=αEGAC（C）-βEAR（C）+γEMV（C，c1，c2）=α∮Cg（C（s））ds-β∮C〈SymbolQC@I，N→〉ds+γλ1ΩC（I-c1）2dxdy+λ2Ω＼ΩC（I-c2）2dxdy 。（1）

〈N→，SymbolQC@I（C）〉=SymbolQC@I（C）cosθ。

式中：EGAC（C）為變分測地線主動輪廓能量函數(shù);EAR（C）為梯度能量函數(shù);EMV（C，c1，c2）為C-V模型能量函數(shù);g（·）ds為加權(quán)弧長微元;g（·）為遞減邊緣檢測函數(shù);s為弧長參數(shù);θ為曲線法向量與梯度間夾角，（°）;SymbolQC@為梯度算子;N→為單位內(nèi)向法線;α、β、γ為權(quán)重;λ1和λ2是大于零的權(quán)重系數(shù)，用來控制曲線內(nèi)部和外部能量的比重，通常λ1=λ2=1。

對其進(jìn)行一階變分為

δEδC=δε（φ）αdivgSymbolQC@φSymbolQC@φ-β·sign〈SymbolQC@I，N→〉ΔI+γ·-λ1I-c12+λ2（I-c2）2N→。（2）

c1=1ΩCΩCI（x，y）dxdy;c2=1Ω＼ΩCΩ＼ΩCI（x，y）dxdy。

式中：ΩC為內(nèi)部區(qū)域ΩC面積;|Ω＼ΩC|為外部區(qū)域Ω＼ΩC面積。

采用EAR（C）計算演化曲線法向量與梯度內(nèi)積，驅(qū)動演化曲線對邊緣進(jìn)行檢測;EGAC（C）為變分水平集主動輪廓模型的正則項，在奇異點處進(jìn)行劃分;C-V模型EMV（C，c1，c2）函數(shù)為了使圖像最優(yōu)劃分，將模型進(jìn)行極小變分處理。α、β、γ都是正實數(shù)，分別代表模型中的權(quán)重，取值越小，比重越低，反之越大。通過求ct=δE（C）δc的穩(wěn)定解，則模型函數(shù)可取得極小值。

1.2.3 分割質(zhì)量評價

分割質(zhì)量定量評價的評價指標(biāo)分別為分割誤差（R）、過分割誤差（OR）和欠分割誤差（UR），分割指標(biāo)值越小，則表明圖像分割質(zhì)量越好，目標(biāo)分割越精確，詳見文獻(xiàn)。擬采用Photoshop軟件進(jìn)行手動分割，擦拭出表皮細(xì)胞真實區(qū)域，將其作為上述3個指標(biāo)的基準(zhǔn)，其表達(dá)式如（3）—（5）所示。

R=A-A/A×100%。（3）

OR=A-（A∩A）/A-×100%。（4）

UR=A-（A∩A）/A×100%。（5）

式中：A為真實面積;A為目標(biāo)面積;A-為A補集。

1.3 表皮細(xì)胞厚度測量

本文在充分分析表皮細(xì)胞圖像特點基礎(chǔ)上，采用Sobel算子進(jìn)行快速行進(jìn)骨架提取，首先利用快速行進(jìn)骨架提取算法提取細(xì)胞骨架，Sobel確定細(xì)胞邊緣，利用高斯曲線擬合骨架，然后采用公式y(tǒng)=k1x+b做局部擬合中心線曲線的垂線，其中斜率k1與局部擬合中心線斜率k2滿足：k1=-1/k2，k2=-2a1（x-b1）c21e-（x-b1c1）2-2a2（x-b2）c22e-（x-b2c2）2-···-2an（x-bn）c2ne-（x-bncn）2，通過計算垂線與表皮細(xì)胞上下邊緣2交點間距離，多次結(jié)果均值即為表皮細(xì)胞平均厚度。2交點Mi、Ni確定原理為：骨架垂線上點為Mi，其坐標(biāo)為（xm，ym），邊緣線上點為Ni，其坐標(biāo)為（in，jn），當(dāng)Mi、Ni兩點間距離D=（xm-in）2+（ym-jn）2=0或接近于0時，即2點重合，此時的坐標(biāo)點即為骨架垂線與邊緣交點。

2 試驗與結(jié)果分析

2.1 試驗

（1）為驗證本文算法分割精度，從已拍攝的表皮細(xì)胞圖像中選擇×40圖像30幅，分別采用Lazy Snapping算法、GrabCut算法和變分水平集主動輪廓算法分割預(yù)處理后的圖像，比較分割效果及精度。

（2）為驗證本文算法測量精度，采用本文算法提取分割后的表皮細(xì)胞厚度平均值，將得到的圖上尺寸值除以對應(yīng)比例11.51 px/um，轉(zhuǎn)換成實際尺寸。提取結(jié)果與ToupTek Toupview軟件交互測量均值進(jìn)行對比，分析本文算法有效性。

（3）為驗證算法穩(wěn)定性，從30幅與處理后的圖像中任選1幅，分別采用本文提出算法與交互測量法對表皮細(xì)胞厚度進(jìn)行重復(fù)測量，重復(fù)次數(shù)為30。

2.2 結(jié)果與分析

（1）圖像分割如圖2所示，由2圖可知，表皮細(xì)胞圖像經(jīng)基于幾何均值和三維塊匹配算法去噪后，一定程度抑制了噪聲，圖像質(zhì)量得到顯著提高，3種算法分割效果如圖3所示，評價結(jié)果見表1。由圖3（a）和圖3（b）可知，采用Lazy Snapping算法、GrabCut算法對表皮細(xì)胞圖像分割效果較差，出現(xiàn)了較嚴(yán)重的漏分割現(xiàn)象，同時GrabCut算法出現(xiàn)了過分割，能量出現(xiàn)了外泄現(xiàn)象。由圖3（c）可知，采用基于變分水平集主動輪廓算法分割效果較好，目標(biāo)分割較準(zhǔn)確。

從表1可以發(fā)現(xiàn)，Lazy Snapping算法分割誤差（R）、過分割誤差（OR）和欠分割誤差（UR）分別為22.538%、6.368%和11.815%，所用平均時間為14.134 s。結(jié)果表明，Lazy Snapping算法運行速度最快，但分割效果最不理想。該算法引入了分水嶺算法對待處理圖像進(jìn)行預(yù)分割，在一定程度上提高了分割效率。但利用分水嶺把圖像分成了若干個小塊，這些小塊顏色相似度很大，很難區(qū)分開來，很容易視為同一標(biāo)記。然而采用Graph Cut算法進(jìn)行分割，相較Lazy Snapping算法，運行速度要快很多，主要是因為該算法引入了“迭代估計”和“不完全標(biāo)號”，從而減少交互操作量，一定程度上對分割效率有所提高。但參與顏色分類的只有主觀所標(biāo)識的，并且不做進(jìn)一步的細(xì)致劃分，對于真實圖像中的紋理、邊緣和相似的顏色等信息都被忽略了，諸多原因?qū)е路指畹慕Y(jié)果穩(wěn)定性和精細(xì)度差。從結(jié)果比較可看出，GrabCut算法比Lazy Snapping算法更準(zhǔn)確，但所用時間要長一些。主要是因為GrabCut算法輪廓能量項相比其他2個算法定義更為準(zhǔn)確，通過“迭代估計”和“不完全標(biāo)號”，在一定程度上不需要十分精準(zhǔn)的用戶交互工作。但該算法對圖像重疊像素和模糊邊界進(jìn)行處理時，采用Border Matting算法造成了運行速度較慢，耗時較長。再來看一下變分水平集主動輪廓算法，相對于前面2個算法分割效果有著明顯提高，但所用時間較長。主要是因為該算法將邊緣檢測算子、測地線主動輪廓模型和C-V模型進(jìn)行集成，采用基于水平集變分原理能量函數(shù)曲線進(jìn)行演化，所以分割效果會有明顯的提高，但同時計算過程復(fù)雜性造成用時較長。

（2）基于快速行進(jìn)骨架提取如圖4（a）所示，采用Sobel算子提取的邊緣如圖4（b）所示，將骨架和邊緣附于分割后的葉片表皮細(xì)胞圖像，如圖4（c）所示。由4圖可以看出，提取的骨架和邊緣精度較高，與表皮細(xì)胞基本吻合。采用高斯曲線擬合法擬合的骨架曲線如圖5（a）所示。

經(jīng)分析，冪級數(shù)n=4時，擬合效果最佳，平均均方根誤差（RMSE）為0.775 5，隨著n值越大，擬合精度隨之提高，計算量也會有所增加。采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細(xì)胞輪廓交點Mi和Ni，結(jié)果如圖5（b）所示，骨架垂線上點為Mi坐標(biāo)為（xm，ym），邊緣線上點為Ni坐標(biāo)為（in，jn），通過計算Mi和Ni間距離D=（xm-in）2+（ym-jn）2，得出表皮細(xì)胞平均厚度，將本文算法提取的表皮細(xì)胞厚度值與交互測量值進(jìn)行對比，結(jié)果見表2。由表2知，本文算法提取值與交互測量值間相對誤差為3.27%，均方根誤差為0.983，相對較小，結(jié)果較準(zhǔn)確。

（3）對同一幅預(yù)處理后的狹葉錦雞兒表皮細(xì)胞圖像測量結(jié)果如圖6所示，方差見表3。由圖6和表3可知，采用本文算法穩(wěn)定性較高，誤差為0.007，采用ToupTek Toupview軟件交互測量方法受主觀干擾較大，數(shù)據(jù)出現(xiàn)了較大的波動，誤差為1.268。

3 結(jié)論

本文以狹葉錦雞兒葉切片表皮細(xì)胞圖像為研究對象，針對交互表皮細(xì)胞厚度測量主觀干擾大、穩(wěn)定性差和效率不高等問題，通過采用基于幾何均值和三維塊匹配算法去除圖像噪聲，提出采用基于變分水平集主動輪廓算法對去噪后表皮細(xì)胞圖像進(jìn)行分割，通過計算表皮細(xì)胞骨架曲線局部擬合中心線的垂線與表皮細(xì)胞上下邊緣2交點間距離，實現(xiàn)了表皮細(xì)胞厚度的測量，通過試驗得出以下結(jié)論。

（1）采用基于幾何均值和三維塊匹配算法可有效去除圖像噪聲，圖像質(zhì)量得到明顯改善。本文提出的基于變分水平集主動輪廓算法對去噪后表皮細(xì)胞圖像可實現(xiàn)較準(zhǔn)確分割，相較傳統(tǒng)Lazy Snapping算法和Grab Cut算法，雖然本文分割算法耗時最大，但分割效果最好，R、OR和UR平均值分別為5.670%、0.589%和5.900%，平均耗時為30.228 s。

（2）采用基于快速行進(jìn)骨架提取算法提取和Sobel邊緣提取算法提取的骨架和邊緣精度較高，采用冪級數(shù)n=4時的高斯曲線擬合法骨架效果最佳，平均均方根誤差（RMSE）為0.775 5，隨著n值越大，擬合精度隨之提高，計算量也會有所增加。通過采用最小距離求交法確定出骨架曲線上局部擬合中心線的垂線與表皮細(xì)胞輪廓交點Mi和Ni，通過不斷計算Mi和Ni間的距離得出表皮細(xì)胞厚度，通過與交互測量值的比較得出，本文算法提取值與交互測量值間相對誤差為3.27%，均方根誤差為0.983，相比之下其誤差相對較小，結(jié)果較為準(zhǔn)確。

（3）通過對同一幅圖像30次重復(fù)測量后發(fā)現(xiàn)，相較ToupTek Toupview軟件交互測量方法，本文算法穩(wěn)定性較高，誤差為0.007。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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