張文龍 胡穎媛 王穎莉 李 睿 李建麗 楊斌盛

(1山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，晉中 030619)

(2山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

蜂毒肽(Mel)是蜂毒的主要活性成分，包含26個氨基酸殘基(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)，具有兩親性[1?2]，氨基端主要由疏水氨基酸殘基(resi?dues 1?20)組成，而羧基端則由大部分親水氨基酸殘基(residues 21?26)構成。在生理pH條件下，羧基端4個正電殘基(KRKR)及Lys7使得Mel帶5個正電荷。在水溶液中，低濃度(μmol·L?1)的Mel作為單體以無規(guī)卷曲狀態(tài)存在[3]；高濃度(mmol·L?1)或在高鹽溶液中，Mel形成四聚體以α?helix狀態(tài)存在[3]；在磷脂雙分子層中，Mel作為單體以α?helix狀態(tài)存在[4]。其α?helix結構如圖1所示。Mel通過各種構象以不同方式調節(jié)其活性，參與細胞內信號傳遞。

圖1 Mel(PDB∶2MLT)的結構Fig.1 Structure of Mel(PDB∶2MLT)

作為抗菌肽，Mel由于可以與細胞內多種成分反應，故而常作為模型肽來了解細胞內過程。例如，其可以與磷脂結合，引起膜融合[4]；與核苷酸結合，調控基因表達[5]；作為鈣調蛋白的抑制劑，研究鈣調蛋白的性質[6]；可以作為藥物傳遞肽；另外，Mel對革蘭氏陰/陽性菌及真菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性[7?8]；具有顯著的抗過敏和抗炎癥特性[9]；可以抑制某些癌細胞的生長[10]；誘導人白血病細胞的凋亡[11]；并表現(xiàn)出顯著的抗病毒活性[12]。多項報告還表明，Mel對于糖尿病及動脈粥樣硬化也有一定的治療作用[13]?？傊琈el具有廣泛的生物學及藥理學效應[14]。

Mel與核酸的反應研究主要集中在Mel對DNA的損傷及所選基因的表達[15?16]。對于DNA與Mel的結合過程以及結合后構象改變仍然是未知的。我們采用多種光譜方法以及量熱法研究了小牛胸腺DNA(CT?DNA)與Mel的相互作用，為今后研究抗菌肽的藥理作用、了解抗菌肽與核酸的結合機制以及設計新型高效藥物分子提供了依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

N?2?羥乙基派嗪?N′?乙磺酸(HEPES，AR)購于Sigma公司。CT?DNA(純度98%)、溴化乙錠(EB)購于索萊寶。Mel(純度達到98%)由中國武漢Fine peptide公司合成，其它試劑均為分析純。

主要儀器：Biologie Mos 450型圓二色譜儀(法國Bio?logic公司)、F?2500型熒光光譜儀(日本Hitachi公司)、Cary 50 Bio UV?Visible型紫外吸收光譜儀(美國Varian公司)、ITC200型等溫滴定量熱儀(英國Malvern 公司)、Edinburgh Analytical Instrument type nF?900熒光光譜儀(英國愛丁堡公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

Mel溶液：取少量Mel固體，溶解于 10 mmol·L?1pH=7.4的HEPES緩沖液，測量其在280 nm處的吸光度，確定其濃度(ε=5 500 L·mol?1·cm?1[17])。

CT?DNA溶液：參照文獻[18]進行配制。

1.2.2 光譜測試

所有實驗均在10 mmol·L?1pH=7.4的HEPES緩沖溶液中進行，光譜數(shù)據(jù)均為3次掃描的平均值。

UV?Vis吸收光譜：T=25℃，使用1 cm比色皿測定不同溶液在200～800 nm范圍的光譜。

CT?DNA解鏈溫度(Tm)的測量:樣品以5℃的升溫間隔從15℃連續(xù)加熱至90℃，使用1 cm比色皿，監(jiān)測不同溶液在不同溫度下260 nm處吸光度。

圓二色光譜(CD)：T=25℃，步長0.2 nm，帶寬1 nm，使用1 mm比色皿記錄不同溶液在190～320 nm范圍的光譜。

熒光壽命：T=25℃，用Ludox HS?30硅膠溶液作為空白，使用280 nm的激光器作為激發(fā)光源，測定不同溶液的熒光壽命，熒光衰減曲線參照文獻[19]進行擬合。

熒光光譜的測定：T=25℃，使用1 cm比色皿。其中在紅邊激發(fā)熒光位移法(REES)實驗中，激發(fā)波長以5 nm的波長間隔從280 nm逐漸增加至305 nm，記錄不同激發(fā)波長下樣品的發(fā)射波長；在丙烯酰胺熒光猝滅實驗中，激發(fā)波長為295 nm，逐步加入丙烯酰胺溶液(5 mmol·L?1)到樣品中，記錄不同溶液最大發(fā)射波長所對應的熒光強度；對于穩(wěn)態(tài)熒光光譜，激發(fā)波長為295 nm，狹縫為5 nm，掃描速度為100 nm·min?1，逐漸滴加CT?DNA到Mel溶液中，收集300～550 nm的發(fā)射光譜；對于EB熒光競爭實驗，激發(fā)波長為488 nm，記錄500～750 nm范圍的發(fā)射光譜。

1.2.3 等溫滴定量熱法

T=25℃，采用MicraoCal ITC200進行等溫滴定量熱測試。將 3.0 mmol·L?1CT?DNA 和 0.08 mmol·L?1Mel分別放置于注射池與樣品池中，進行滴定。第一次滴加0.4 μL，以后每次滴加1 μL CT?DNA到樣品池中，反應時間為3 min，共滴加31次，攪拌速度為750 r·min?1。數(shù)據(jù)處理時去除第一滴，扣除稀釋熱，利用儀器自帶的軟件來擬合，得到結合常數(shù)(Ka)及結合焓變(ΔH)，ΔG與ΔS參考文獻[19]得到。

2 結果與討論

2.1 CD光譜

圖2為室溫下10 mmol·L?1pH=7.4的HEPES 緩沖溶液中，Mel與CT?DNA混合前后的CD光譜。由圖可見，Mel在203 nm有一較強負信號，同時在222 nm處有一弱的肩峰(圖2A)，表明在緩沖溶液中Mel基本以無規(guī)卷曲的狀態(tài)存在。這與文獻報道的結果一致[20]。CT?DNA由于堿基堆積在275 nm出現(xiàn)一個正峰，由于右手螺旋在245 nm出現(xiàn)負峰(圖2B)，這是B型DNA的特征峰[21]。為了更好的觀察Mel與CT?DNA混合后構象的變化，用混合物的光譜數(shù)據(jù)減去單一成分的光譜數(shù)據(jù)，分別得到反應后的Mel與CT?DNA的光譜。從圖中可以看到，Mel與CT?DNA反應后，在208與222 nm分別出現(xiàn)了負峰(圖 2A)，這是典型的α?helix特征峰[20,22]，表明 Mel與CT?DNA反應后以α?helix狀態(tài)存在，與文獻報道的結果一致，即Mel遇到疏水模擬物，如膠束、膜環(huán)境或者脂質體，會采用α?helix[23]。與Mel反應后，CT?DNA位于275 nm處的正峰及245 nm處的負峰強度與位置均發(fā)生變化(圖2B)，表明CT?DNA的雙螺旋結構發(fā)生變化[21]。

圖2 (A)Mel與(B)CT?DNA的CD光譜Fig.2 CD spectra of(A)Mel and(B)CT?DNA

2.2 紫外光譜

圖3為Mel與CT?DNA反應后的紫外可見吸收光譜。由于Mel的19位含有色氨酸殘基，其最大吸收峰位于280 nm處。CT?DNA的最大吸收峰位于258 nm，將CT?DNA與Mel混合后，最大吸收峰位于267 nm處，而將CT?DNA與Mel的光譜加和所產生的最大吸收峰位于261 nm。紫外光譜的變化表明Mel與CT?DNA形成了復合物，Mel中色氨酸的環(huán)境可能發(fā)生了變化[24]。同時推測可能由于與Mel作用，使得CT?DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，雙螺旋解開[25]。

圖 3 Mel(a)、CT?DNA(b)、CT?DNA?Mel(c)以及 Mel與CT?DNA光譜加和的(d)UV?Vis光譜Fig.3 UV?Vis absorption spectra of Mel(a),CT?DNA(b),CT?DNA?Mel(c)and calculated sum spectrum of Mel with CT?DNA(d)

2.3 色氨酸殘基微環(huán)境的變化

2.3.1 熒光壽命

色氨酸的熒光壽命對于所處微環(huán)境極為敏感[26]。圖4A為Mel在不同溶液中的熒光壽命。如圖所示，CT?DNA的加入改變了Mel的熒光壽命。其中Mel在緩沖溶液中的平均壽命為3.77 ns，與文獻報道的結果一致[27]，表明色氨酸殘基暴露在溶劑中。當Mel與CT?DNA結合后，平均壽命減少了68%，變?yōu)?.22 ns，色氨酸殘基微環(huán)境的極性降低，進入疏水環(huán)境，這可能對應了Mel的構象由無規(guī)卷曲向α?helix的轉變，與CD測得的結果一致。

2.3.2 丙烯酰胺猝滅實驗

使用丙烯酰胺來進一步探究Mel的構象變化，尤其是色氨酸微環(huán)境的變化。丙烯酰胺作為中性猝滅劑，既能猝滅位于蛋白質表面的熒光基團的熒光，也能猝滅位于蛋白質內部疏水腔的熒光基團的熒光，因此常用來分析蛋白質熒光基團的微環(huán)境[28]。丙烯酰胺猝滅實驗的結果,采用Stern?Volmer方程[28](式1)進行擬合分析：

其中F0、F是丙烯酰胺不存在或存在時溶液的熒光強度，Ksv是Stern?Volmer猝滅常數(shù)，cQ是丙烯酰胺的濃度。圖4B即為丙烯酰胺猝滅不同溶液所產生的光譜圖，由斜率測得Ksv，其中Mel在緩沖溶液中的Ksv為 17.30 L·mol?1，表明 Mel在緩沖溶液中經歷了較大的猝滅，色氨酸殘基暴露在溶劑中[28]。當Mel與CT?DNA結合后，Ksv減少為4.87 L·mol?1。Ksv的減少表明，一旦Mel與CT?DNA形成配合物，Mel中色氨酸殘基對溶劑中丙烯酰胺的可接近性減少，色氨酸殘基處于更疏水的內部環(huán)境[28]，這與熒光壽命得到的結果一致。

圖4 Mel及其與CT?DNA混合物的熒光分析:(A)熒光衰減曲線;(B)丙烯酰胺猝滅實驗的Stern?Volmer分析;(C)激發(fā)波長的變化對最大發(fā)射波長的影響Fig.4 Fluorescence analysis for Mel and the mixture of Mel with CT?DNA:(A)fluorescence decay curves;(B)representative data for Stern?Volmer analysis of acrylamide quenching;(C)effect of changing the excitation wavelength on the maximum emission wavelength

2.3.3 REES法

采用REES法來進一步檢測CT?DNA對Mel中色氨酸殘基微環(huán)境的影響[29]。REES是指由于激發(fā)波長向長波方向移動而導致熒光基團的最大發(fā)射波長也向長波方向移動。REES上升是由熒光基團激發(fā)態(tài)周圍溶劑的弛豫速率較慢引起。圖4C為CT?DNA對Mel的紅邊激發(fā)熒光位移影響。由圖中可以看到，隨著激發(fā)波長的逐漸增加，從280 nm增加到305 nm，處于緩沖液中的Mel最大發(fā)射波長幾乎沒有變化，表明緩沖溶液中Mel的色氨酸基團處于一個可移動的水環(huán)境中。當Mel與CT?DNA結合后，最大發(fā)射波長值隨著激發(fā)波長的增加而發(fā)生紅移，從 340 nm(λex=280 nm)移到 348 nm(λex=305 nm)，位移8 nm。REES研究表明，Mel與CT?DNA形成復合物后，使得Mel中的色氨酸殘基活動受到限制，這與熒光壽命及熒光猝滅實驗得到的結果一致，Mel與CT?DNA的結合使得Mel的色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生變化，由親水區(qū)進入更疏水的內部。

2.4 CT?DNA構象的變化

2.4.1 EB熒光

EB在水溶液中熒光較弱，通過內插結合到CT?DNA的堿基對中后熒光顯著增強，故而可以作為監(jiān)測CT?DNA構象變化的熒光探針[30]。如圖5所示，EB在緩沖溶液中或者Mel溶液中的熒光很弱，最大發(fā)射波長位于612 nm，當EB插入到CT?DNA分子中，熒光顯著增強，最大發(fā)射波長移至599 nm，當向EB?CT?DNA溶液中逐漸加入Mel后，EB熒光強度逐漸減弱，最終熒光強度(曲線g)強于EB在緩沖溶液中的強度(曲線 a)，而弱于 EB?CT?DNA的熒光強度(曲線c)，推測Mel與CT?DNA的作用使得CT?DNA的構象發(fā)生變化，EB的結合位點減少，部分EB分子被釋放，這與紫外光譜及CD光譜得到的結果一致。

圖5 EB?CT?DNA在加入Mel前后的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of EB?CT?DNA before and after the addition of Mel

2.4.2Tm測定

Tm是指50%的雙鏈DNA變成單鏈的溫度[31]。圖6為CT?DNA在不同溶液中的熱變性曲線，經擬合得到Tm，其中緩沖溶液中CT?DNA的Tm值為64.3℃。而與Mel結合后，CT?DNA的Tm值為66.2℃。Tm升高可能是由于Mel中的帶正電荷的氨基酸殘基與CT?DNA反應，改變了CT?DNA的電荷排列，從而起到穩(wěn)定雙螺旋結構的作用[31]，此外，氨基酸疏水側鏈與CT?DNA的疏水部分接觸，也可能使復合物更穩(wěn)定[31]。

圖6 CT?DNA(a)和CT?DNA?Mel(b)的熱變性曲線Fig.6 Thermal denaturation curves of CT?DNA(a)and CT?DNA?Mel(b)

2.5 結合常數(shù)

2.5.1 熒光光譜

Mel與CT?DNA親和力通過CT?DNA滴定Mel實驗來測定。圖7A是CT?DNA滴定Mel的熒光光譜，從圖中可以看出，Mel由于含有色氨酸，最大熒光發(fā)射峰位于357 nm，表明色氨酸殘基暴露在緩沖溶液中。隨著CT?DNA逐漸滴加到Mel中，Mel的熒光強度逐漸減弱，減弱約53%，最大發(fā)射波長發(fā)生藍移，由357 nm藍移到342 nm，Mel與CT?DNA形成復合物，Mel的構象發(fā)生變化，色氨酸殘基進入更加疏水的內部，這可能對應了Mel由無規(guī)卷曲向α?helix的轉變。熒光猝滅可能是由于Mel所帶的正電荷與CT?DNA磷酸骨架所帶的負電荷的靜電作用使得Mel的表面電荷發(fā)生重排[32]，另外CT?DNA與色氨酸殘基吲哚基附近氨基的氫鍵形成也可能會引起Mel熒光的猝滅[33]。

圖7 (A)CT?DNA的加入對Mel(1.2 μmol·L?1)熒光光譜的影響;(B)隨cCT?DNA/cMel變化的熒光強度滴定曲線Fig.7 (A)Effect of adding CT?DNA on fluorescence spectrum of Mel(1.2 μmol·L?1);(B)Titration curve for fluorescence intensity as a function of cCT?DNA/cMel

將 Mel在 357 nm 處的熒光強度對cCT?DNA/cMel作圖，得到圖7B。從圖7B可以看出，Mel在357 nm處的熒光強度隨著cCT?DNA/cMel的增大而逐漸減小。Mel與CT?DNA的結合常數(shù)可由式2得到：

其中F0為CT?DNA不存在時，Mel在357 nm處的熒光強度；Fi為任一滴定點的熒光強度；F∞為CT?DNA與Mel完全結合后Mel在357 nm處的熒光強度；Ka為CT?DNA與Mel結合的條件結合常數(shù)；n為結合位點數(shù)；cCT?DNA為任一滴定點時CT?DNA的游離濃度。根據(jù)文獻[19]，使用CT?DNA的總濃度代替CT?DNA的游離濃度，用 lg[(F0?Fi)/(Fi?F∞)]對 lgcCT?DNA作圖可得Ka和n，數(shù)據(jù)處理過程中扣除滴定過程中產生的稀釋效應。如圖7B插圖，得到CT?DNA與Mel的結合常數(shù)為(5.39±0.04)×105L·mol?1。

當CT?DNA與Mel反應的緩沖液中NaCl濃度達到 500 mmol·L?1時(圖 8)，Mel與 CT?DNA 混合物的最大熒光發(fā)射峰從342 nm移回357 nm(曲線b到曲線c)，表明Mel與CT?DNA的結合高度依賴靜電作用。

圖8 (a)Mel在HEPES中、(b)CT?DNA?Mel在HEPES中、(c)CT?DNA?Mel在500 mmol·L?1NaCl中和(d)ssDNA?Mel在HEPES中的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra of(a)Mel in HEPES buffer,(b)CT?DNA?Mel in HEPES buffer,(c)CT?DNA?Mel in 500 mmol·L?1NaCl,and(d)ssDNA?Mel in HEPES buffer

此外，我們還觀察了單鏈DNA(ssDNA)對Mel熒光的影響，ssDNA包含磷酸骨架，可以為反應提供靜電作用。CT?DNA于100℃孵化30 min，再快速轉移至冰水浴中冷卻30 min，得到ssDNA。將ssDNA加入到Mel中，熒光僅僅發(fā)生猝滅(曲線a～d)，表明CT?DNA與Mel的反應過程中除靜電作用外，還存在疏水作用，CT?DNA雙螺旋中的疏水成分可能在這個過程中起到了作用。

2.5.2 等溫滴定量熱法

為了進一步研究Mel與CT?DNA之間的相互作用，我們選用等溫滴定量熱法進行分析。圖9為CT?DNA滴定Mel所得到的代表性熱譜圖和相應的滴定曲線。由圖可知，Mel和CT?DNA之間的反應是吸熱反應。采用“one set of sites”模型進行擬合，得到Ka為(4.44±0.12)×105L·mol?1，與熒光光譜得到的結合常數(shù)接近。所有的熱力學參數(shù)列于表1。由表可知，焓變對自由能的貢獻較小，Mel與CT?DNA的相互作用是熵驅動的，表明靜電作用與疏水作用在復合物形成的過程中都起作用，靜電作用來源于CT?DNA磷酸骨架與Mel帶正電的氨基酸殘基之間的作用，疏水作用可能來源于CT?DNA雙螺旋與Mel的疏水氨基酸殘基[34]。

表1 在25℃時通過熒光光譜和ITC測量CT?DNA?Mel復合物的熱力學參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters of CT?DNA?Mel complex by spectrofluorimetric methods and ITC at 25 ℃

圖9 在25 ℃時CT?DNA(3.0 mmol·L?1)滴定Mel(0.08 mmol·L?1)的等溫量熱滴定曲線Fig.9 Calorimetric titration of CT?DNA(3.0 mmol·L?1)to Mel(0.08 mmol·L?1)at 25 ℃

綜上所述，Mel與CT?DNA可以形成復合物，這與文獻中報道的具有多個疏水氨基酸殘基的陽離子肽可與核酸形成復合物類似[34?35]。復合物的形成存在多種相互作用，Mel中帶正電荷的氨基酸殘基與CT?DNA帶負電荷的磷酸骨架之間存在靜電作用；CT?DNA雙螺旋能與Mel中的疏水氨基酸殘基之間發(fā)生疏水作用，尤其是纈氨酸與亮氨酸，它們還有與CT?DNA雙螺旋配位的趨勢[34]；此外，Mel中帶質子的氨基和羧基還可能與CT?DNA中腺嘌呤和鳥嘌呤的氮原子之間形成氫鍵。離子強度實驗表明，Mel在與CT?DNA相互作用的過程中，靜電作用在初始的結合中占主導地位，類似于Mel與膜的結合[23]。二者的相互作用會誘導Mel構象發(fā)生變化，由無規(guī)卷曲變?yōu)棣?helix，色氨酸殘基由親水的表面進入更疏水的內部環(huán)境，CT?DNA結構亦發(fā)生變化。根據(jù)短肽與DNA結合的互補作用模型[36]以及Wilkins等提出的基于X射線衍射研究的作用模型[35]，結合實驗數(shù)據(jù)，推測Mel可能以α?helix結合到CT?DNA的溝槽中。這種結合模型不僅能拓寬雙螺旋的溝槽，而且增加了反應物局部的剛性，從而使得CT?DNA更穩(wěn)定，Tm升高。

3 結論

綜上所述，在 10 mmol·L?1pH 7.4 HEPES 溶液中，Mel可以與CT?DNA形成復合物，復合物的形成使得Mel由無規(guī)卷曲轉向α?helix，Mel中的色氨酸殘基由親水環(huán)境向疏水環(huán)境轉變，吲哚環(huán)不能獨立于Mel自由轉動，并且CT?DNA的結構發(fā)生變化，該研究提供了對陽離子肽在核酸結合中作用的重要見解，不僅有助于更深入地了解抗菌肽的作用機制，而且有助于更深入地了解抗菌肽與核酸的作用機制，也為構建具有一定理化特性和生物學特性的多肽以及潛在藥用制劑的研發(fā)提供了線索。