喬佳欣，宋 昕，徐瑞華，趙學(xué)科，魏夢(mèng)霞，王 苒，韓雪娜，陳亞杰，孫 琳，馬琳琳，謝葉真，白合林，羅 宏，李愛麗，王立東

食管癌是上消化道常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)50萬例食管癌患者中一半以上發(fā)生在中國(guó)[1-2]，患者的死亡率排在消化系統(tǒng)腫瘤的第一位[3]。食管癌早期無特異性癥狀，確診時(shí)大多已達(dá)中晚期，5 a生存率僅約20%[4-7]，嚴(yán)重威脅著人們的健康。食管癌病因復(fù)雜，尚未明確。普遍認(rèn)為食管癌的發(fā)生與胃部食物的反流有關(guān)[8-9]。但目前國(guó)內(nèi)外的食管癌因主要發(fā)生部位不同而對(duì)食管的研究方向也不相同，導(dǎo)致目前對(duì)食管癌的診斷沒有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)。最新研究表明，PCNT SNP位點(diǎn)rs2070426多態(tài)性不同方向的突變表達(dá)，其對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)量也不同，不同的蛋白表達(dá)量食管癌患者的生存也不同，因此蛋白表達(dá)在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和侵襲中發(fā)揮重要作用?？偨Y(jié)得出食管癌中基因的改變與食管癌的預(yù)后有一定的相關(guān)性[10]。

以上方法的進(jìn)行需要外顯子技術(shù)的參與，外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing，WES)是利用探針雜交富集外顯子區(qū)域的DNA序列，通過高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異相關(guān)遺傳突變的技術(shù)手段。相比于全基因組測(cè)序，外顯子組測(cè)序深度更高，更加經(jīng)濟(jì)、高效，能直接對(duì)蛋白編碼序列進(jìn)行測(cè)序，找出影響蛋白結(jié)構(gòu)的變異。同時(shí)，WES能高深度測(cè)序，可發(fā)現(xiàn)常見變異、低頻變異及罕見變異，是非常有價(jià)值的一種方法。

綜上，本研究提出以下研究目的：探究PCNT SNP位點(diǎn)rs2070426不同基因型患者的生存狀況，探究PCNT SNP位點(diǎn)rs2070426不同基因型患者的蛋白表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究納入的199例患者均來自于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室50萬例食管癌患者臨床信息數(shù)據(jù)庫(kù)，患者來自河南省食管癌高發(fā)區(qū)，經(jīng)過確診并行手術(shù)治療的人群，確診時(shí)間為2019年11月至2020年1月，其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)。

1.1.1 樣本采集收集199位食管癌患者的癌組織和癌旁組織。均為新鮮的組織樣本，在進(jìn)行手術(shù)切除后30 min內(nèi)進(jìn)行宏觀解剖，保存在-80 ℃下。在樣本采集前病人未接受放化療等其他治療，以半定量的方式對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行視覺評(píng)分，僅選擇惡性細(xì)胞>70%的腫瘤組織進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序。癌旁正常組織為距腫瘤邊緣至少2 cm遠(yuǎn)的鄰近的上皮正常組織(生殖系對(duì)照)。本研究所有患者均簽署了獨(dú)立的知情同意書，均已獲得相關(guān)機(jī)構(gòu)的審查和批準(zhǔn)。

1.1.2 隨訪本研究通過打電話、家訪或聯(lián)系村醫(yī)等方法與患者或患者家屬直接聯(lián)系，或者通過新合作醫(yī)療數(shù)據(jù)庫(kù)、醫(yī)療保障局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)和公民死亡信息登記管理等系統(tǒng)查詢聯(lián)系方式進(jìn)行隨訪，每半年進(jìn)行一次隨訪，記錄死亡時(shí)間和主要死因等。本研究隨訪時(shí)間從手術(shù)結(jié)束開始，截止時(shí)間為全因死亡時(shí)間，為期2 a，即從隨訪成功199例開始，全部死亡結(jié)束。

1.1.3 樣本制備將199例食管癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行配對(duì)，分裝到準(zhǔn)備好的已經(jīng)標(biāo)記的凍存管內(nèi)，樣本編號(hào)為001～199號(hào)。在樣本類型中，食管癌組織用字母T標(biāo)記(tumor)，癌旁正常組織用字母N標(biāo)記(normal)。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時(shí)保證每份樣品有足夠的DNA可供提取。

1.2 WES測(cè)序分析

1.2.1 DNA樣品檢測(cè)利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣本是否有蛋白，RNA污染及其降解程度，并用Qubit 3.0測(cè)出DNA樣品濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進(jìn)行后續(xù)建庫(kù)。

1.2.2 建庫(kù)捕獲及上機(jī)測(cè)序用Agilent液相芯片捕獲系統(tǒng)對(duì)人全外顯子區(qū)的DNA進(jìn)行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進(jìn)行建庫(kù)及捕獲，后在Illumina平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制高通量測(cè)序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后形成原始Raw Data測(cè)序序列。將原始Raw Data數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并且控制平均堿基位置測(cè)序錯(cuò)誤率低于0.1%，樣本的測(cè)序reads達(dá)到95%以上的比對(duì)率，且堿基覆蓋深度達(dá)到10×以上時(shí)該點(diǎn)檢測(cè)的SNP(single nucleotide polymorphisms)比較可信。

1.2.4 SNP檢測(cè)和功能注釋對(duì)部分家系成員DNA進(jìn)行WES測(cè)序(由諾禾致源測(cè)序公司進(jìn)行) ，基于WES數(shù)據(jù)中所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)，將正常與癌組織中都有的SNP進(jìn)行比對(duì)，使用bcftools軟件識(shí)別SNP，并利用ANNOVAR軟件對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行功能注釋。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析與鑒定

采用液相色譜—質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術(shù)對(duì)199例食管癌的癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行分析。

1.4 SNP與蛋白質(zhì)組作用關(guān)系分析

采用WES測(cè)序，將基因中的突變位點(diǎn)和突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)引起的蛋白表達(dá)量之間聯(lián)系起來，進(jìn)行一定的探討。

2 結(jié)果

2.1 患者rs2070426位點(diǎn)的SNP型

基因分析結(jié)果顯示，199例食管癌患者中，rs2070426 GG型51例(25.63%)；GC型64例(32.16%)；CC型84例(42.21%)。

2.2 SNP型與生存和蛋白表達(dá)的關(guān)系

2.2.1 不同突變位點(diǎn)生存結(jié)果收集199例患者的標(biāo)本，并行WES測(cè)序探討PCNT基因SNP位點(diǎn)rs2070426多態(tài)性的3種不同基因型(GG、GC、CC)與生存的關(guān)系。在研究中發(fā)現(xiàn)是第21號(hào)染色體上的一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變，即由原來基因位點(diǎn)上的G變?yōu)镃，因此可以得出若為CC型則為純合突變、GC型為雜合突變、而若為GG型則為野生型。通過采用SPSS軟件中的Kaplan-Meier分析畫圖比較，得出在2 a的生存隨訪中，相同的時(shí)間點(diǎn)3種(GG、GC、CC)基因型生存率不同，見表1。發(fā)生純合基因突變的食管癌病人的生存人數(shù)最好，雜合突變次之，野生型最差(P=0.033)。但到隨訪的最終都死亡，均為致癌基因，但發(fā)生了純合突變的人群存活率在相同的時(shí)間段內(nèi)生存率相對(duì)較多。由于PCNT的改變與其它疾病或癌的發(fā)生之間有一定的關(guān)系[11-15]，是一個(gè)敏感點(diǎn)。但其它文中無對(duì)SNP位點(diǎn)rs2070426多態(tài)性與食管癌之間的關(guān)系進(jìn)行探討，因此在本文中對(duì)PCNT基因SNP位點(diǎn)rs2070426多態(tài)性與癌癥之間關(guān)系也變得比較有價(jià)值。見圖1。

圖1 不同突變食管癌患者的生存圖

表1 PCNT種基因型與生存率的比較 199 例(%)

2.2.2 不同基因型蛋白表達(dá)量的對(duì)比SNP位點(diǎn)rs2070426多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。由于SNP位點(diǎn) rs2070426不同基因型的改變，導(dǎo)致了對(duì)應(yīng)的基因型的蛋白表達(dá)量也不相同(beta=0.267)。完全突變型CC的蛋白表達(dá)平均水平最高，GC型的蛋白表達(dá)平均水平次之，而GG型的蛋白表達(dá)平均水平最低(P<0.001)。見圖2。

圖2 rs2070426位點(diǎn)3種基因型食管癌患者的MACO1蛋白表達(dá)

3 討論

食管癌是常見的一種消化道惡性腫瘤。因其發(fā)生率高存活率低，目前提高病人的存活率非常重要，但這一問題至今沒有精準(zhǔn)的解決方法。

已有研究發(fā)現(xiàn)，食管癌的預(yù)后生存率，除了與飲食有關(guān)系以外，還與內(nèi)部的基因的改變存在著非常大的關(guān)系。因此作者對(duì)內(nèi)部基因方面進(jìn)行了一定的探討。本文采用同一批手術(shù)相同的時(shí)間段內(nèi)的食管癌患者的SNP位點(diǎn)rs2070426的不同突變基因型存活率多少進(jìn)行研究。采用WES技術(shù)能直接對(duì)蛋白編碼序列進(jìn)行測(cè)序，找出影響蛋白結(jié)構(gòu)的變異。為下一步的研究提供了幫助。在基因突變探討的過程中，發(fā)現(xiàn)PCNT基因SNP rs2070426位點(diǎn)發(fā)生了改變。通過圖1探討中了解到食管癌患者2 a生存率CC型高于GC型與GG型患者，突變等位基因越多，2 a時(shí)間段的分析中存活率反而越高。從圖2中了解到純合突變型CC的蛋白表達(dá)平均水平最高，GC型的蛋白表達(dá)平均水平次之，而GG基因型的蛋白表達(dá)平均水平最低(P<0.001)。從兩個(gè)圖中了解到PCNT基因位點(diǎn)的突變是一個(gè)好的突變，但其他文章中并未對(duì)PCNT SNP rs2070426位點(diǎn)與食管癌生存之間關(guān)系進(jìn)行研究，只探討了PCNT與其它病的關(guān)系[16]，是一個(gè)敏感點(diǎn)。

因此本文這一研究是非常有意義的。這一基因位點(diǎn)突變引起的蛋白表達(dá)改變進(jìn)而影響生存是通過影響對(duì)應(yīng)的MACO1靶點(diǎn)引起的，雖然其他文章也研究了MACO1與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[17]。本研究對(duì)闡明PCNT基因SNP位點(diǎn)rs2070426多態(tài)性對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)MACO1與蛋白表達(dá)量的關(guān)系非常有意義。本文針對(duì)SNP位點(diǎn)rs2070426，探討基因位點(diǎn)的改變與食管癌預(yù)后生存差異的關(guān)系，進(jìn)而了解其可能治療靶點(diǎn)，對(duì)以后食管癌的研究具有一定意義。是否可以通過此基因的改變延長(zhǎng)病人的生命，還需要進(jìn)一步的研究跟進(jìn)。

綜上所述，食管癌預(yù)后的存活率與位點(diǎn)突變數(shù)有關(guān)。PCNT基因突變的3種位點(diǎn)與蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)性。從本文中可知這是一個(gè)正向突變生存位點(diǎn)。作者將在下一步的研究中深入了解PCNT基因SNP位點(diǎn)rs2070426多態(tài)性與食管癌預(yù)后的存活關(guān)系，為以后的個(gè)體化治療提供一個(gè)新的線索，進(jìn)而開啟食管癌研究的新途徑，延長(zhǎng)食管癌患者的生存時(shí)間，這將是一個(gè)有價(jià)值的研究思路。