陳亞杰，趙學(xué)科，徐瑞華，宋 昕，魏夢霞，李 貝，范宗民，胡景峰，王 苒，孫 琳，謝葉真，馬琳琳，喬佳欣，王立東

食管鱗癌是全球最常見的六大惡性腫瘤之一(發(fā)病率和死亡率均居第六位)，中國是食管鱗癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)(發(fā)病率居第六位，死亡率居第四位)[1]。研究顯示遺傳多態(tài)性是影響食管癌易感性的重要因素。近年來分子流行病學(xué)資料表明漢族人群食管癌遺傳易感基因主要包括抑癌基因、癌基因、代謝酶相關(guān)基因、DNA 切除修復(fù)相關(guān)基因和細(xì)胞因子基因等，深入了解易感基因的表達(dá)變化，有助于明確食管癌的發(fā)病機(jī)制[2-3]。目前已發(fā)現(xiàn)一些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)，如rs671對食管鱗癌的早期篩查具有一定的臨床意義[4]。SNP與多種惡性腫瘤的遺傳易感性已被相關(guān)研究證實(shí)[5-7]。因此，本研究探討人類CNTNAP3B基因rs3739620位點(diǎn)SNP不同基因型與食管鱗癌患者的相關(guān)性，為食管鱗癌患者的預(yù)后生存提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

1.1.1 研究對象的采集共收集來自高發(fā)地區(qū)醫(yī)院199位食管鱗癌患者的癌組織。所用樣品均為新鮮組織樣本,在手術(shù)切除后30 min內(nèi)進(jìn)行取樣，并保存在-80 ℃下。樣本采集前未接受放化療等其他治療。以半定量的方式對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行病理學(xué)評分，僅選擇惡性細(xì)胞>70%的腫瘤樣品進(jìn)行全基因組外顯子測序(WES)。所有患者都簽署了獨(dú)立的知情同意書，用于取樣和測序分析。本研究已獲得了相關(guān)機(jī)構(gòu)的審查和批準(zhǔn)。

1.1.2 研究對象的隨訪本研究主要通過電話、家訪和村醫(yī)與患者或患者家屬直接聯(lián)系，或通過新合作醫(yī)療數(shù)據(jù)庫、醫(yī)療保障局?jǐn)?shù)據(jù)庫和公民死亡信息登記管理等系統(tǒng)查詢方式進(jìn)行隨訪，每半年進(jìn)行一次隨訪，記錄去世時間和主要死因等。本研究隨訪截止到2021年12月1日，隨訪成功199例。

1.1.3 組織樣本的制備將199例食管鱗癌患者的癌組織分裝到準(zhǔn)備好的已經(jīng)標(biāo)記的凍存管內(nèi)，樣本編號為001～199號。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時保證每份樣品有足夠的DNA可供提取。

1.2 WES測序SNP分析

1.2.1 DNA樣品檢測利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣本是否有蛋白、RNA污染及其降解程度。并用Qubit3.0測出DNA樣品濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進(jìn)行后續(xù)建庫。

1.2.2 建庫捕獲及上機(jī)測序采用Agilent液相芯片捕獲系統(tǒng)對人全外顯子區(qū)的DNA進(jìn)行富集，Agilent SureSelectHumanAllExonV6試劑盒進(jìn)行建庫及捕獲，后在Illumina平臺上進(jìn)行高通量測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制高通量測序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過轉(zhuǎn)化后形成原始Raw Data測序序列。將原始Raw Data數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并且控制平均堿基位置測序錯誤率低于0.1%，樣本的測序reads達(dá)到95%以上的比對率，且堿基覆蓋深度達(dá)到10×以上時該點(diǎn)檢測的SNP比較可信。

1.2.4 SNP檢測和功能注釋使用bcftools軟件識別SNP，并利用ANNOVAR軟件對多態(tài)性位點(diǎn)用進(jìn)行功能注釋。注釋包括dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組計劃，包含變異的位置、類型，保守性及有害性預(yù)測等。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析與鑒定

采用液相色譜—質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)對199例食管癌的癌組織樣本進(jìn)行分析。

1.4 eQTL分析整合eQTL分析所獲得的SNP位點(diǎn)，用HaploView 軟件排除冗余，采用Sequenom MassARRAY中通量基因分型平臺，對來自高發(fā)地區(qū)醫(yī)院的199位食管鱗癌患者進(jìn)行基因分型檢測并且建立線性模型推測CNTNAP3B基因?qū)RPL18蛋白表達(dá)的影響。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。高發(fā)區(qū)食管鱗癌組織的SNP影響蛋白的表達(dá)從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生采用雙重線性回歸檢驗(yàn)，采用Kaplan Meier方法進(jìn)行2 a生存分期。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CNTNAP3B基因rs3739620位點(diǎn)不同基因型對食管鱗癌生存期的影響

統(tǒng)計學(xué)分析顯示SNP不同基因型食管鱗癌患者的生存之間有顯著差異(P<0.02)。在單個SNP 位點(diǎn)分析時，發(fā)現(xiàn)C/T基因型比C/C基因型生存率高，T/T基因型比C/T基因型生存率高，說明rs3739620位點(diǎn)T/T基因型是患者的保護(hù)因素。此外rs3739620位點(diǎn)T/T、C/T、和C/C基因型頻率分別為4.0%、56.2%和39.6%，見圖1。

圖1 CNTNAP3B基因生存分期

2.2 CNTNAP3B基因rs3739620位點(diǎn)不同基因型對MRPL18蛋白表達(dá)水平的影響

為了探討rs3739620位點(diǎn)不同基因型影響食管鱗癌患者生存的可能機(jī)制，本研究對該位點(diǎn)3種不同基因型患者的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示：3組不同基因型患者間的MRPL18蛋白表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.001)，其中C/C基因型組的MRPL18蛋白表達(dá)水平最高，C/T 基因型組次之，T/T基因型組最低，見圖2。

圖2 rs3739620位點(diǎn)不同基因型患者M(jìn)RPL18蛋白的表達(dá)情況

為了矯正其他混雜因素的影響，作者應(yīng)用表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)(expression quantitative trait locus,eQTL)算法進(jìn)一步分析了rs3739620位點(diǎn)不同基因型與MRPL18蛋白表達(dá)水平的關(guān)系，結(jié)果顯示：C/C基因型組、C/T 基因型組、T/T基因型組食管鱗癌患者M(jìn)RPL18蛋白的表達(dá)水平呈線性下降趨勢(P<0.001)，其在擬合方程中對應(yīng)的系數(shù)(β)為-0.32，即當(dāng)某患者rs3739620位點(diǎn)上攜帶的突變基因(T)數(shù)量較其他患者每多出1個時，其MRPL18蛋白的表達(dá)水平約降低0.32個單位。

3 討論

食管癌具有明顯的地域分布差異，但是在相同環(huán)境因素下的人群只有少數(shù)罹患食管癌，可見個體基因型在食管癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[8-9]。從基因水平判斷患者的病變發(fā)展情況以及預(yù)后的評估正逐漸成為研究的熱點(diǎn)[10]。單核苷酸多態(tài)性主要是指DNA序列上變異頻率大于>1%的單個核苷酸變異[11]，可以認(rèn)為這些SNP是人群間異質(zhì)性的來源之一，而且SNP在DNA序列上分布廣泛，有研究認(rèn)為每100～300個堿基就能發(fā)現(xiàn)一個SNP[12]。在NCBI網(wǎng)站中查詢發(fā)現(xiàn)，CNTNAP3B基因即接觸相關(guān)蛋白家族成員3B(contactin associated protein family member 3B)，位于人類第9號染色體，突變點(diǎn)是rs3739620。該基因8號外顯子1 316位堿基C突變成了T，439位氨基酸由脯氨酸變成了亮氨酸。

本研究探討CNTNAP3B基因rs3739620位點(diǎn)SNP不同基因型與食管鱗癌患者生存期之間的相關(guān)性。在單個基因位點(diǎn)分析rs3739620位點(diǎn)SNP不同基因型與食管鱗癌患者的生存有顯著的差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。在不同基因分型中，發(fā)現(xiàn)T/T基因型的生存率最高，推測rs3739620位點(diǎn)突變對食管鱗癌患者預(yù)后生存具有保護(hù)作用。提示CNTNAP3B基因單核苷酸多態(tài)性與食管鱗癌患者生存有關(guān)，可能作為預(yù)測食管鱗癌術(shù)后患者生存的潛在預(yù)后標(biāo)志物。

CNTNAP3B基因rs3739620位點(diǎn)突變導(dǎo)致MRPL18蛋白表達(dá)下調(diào)，尤其是T/T基因型蛋白表達(dá)量最低。研究發(fā)現(xiàn)MRPL18蛋白在腫瘤中高表達(dá)[13]，推測這個靶蛋白可能是腫瘤中潛在的靶基因，再次說明rs3739620突變可能是影響食管鱗癌患者生存的機(jī)制。SNP造成靶蛋白表達(dá)量的改變，本研究目前僅闡述了二者之間的相關(guān)性，可能是一種潛在的Trans eQTL調(diào)控作用，需要后期進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，CNTNAP3B基因rs3739620位點(diǎn)T/T基因型生存期最好，并且CNTNAP3B基因影響MRPL18蛋白表達(dá)，對食管鱗癌患者預(yù)后生存具有一定的臨床指導(dǎo)意義。