蔡莉莉，趙凱，王根杰

商丘市第一人民醫(yī)院1輸血科，2檢驗(yàn)科，3血液科，河南 商丘 476100

急性髓細(xì)胞性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性血液腫瘤，主要表現(xiàn)為髓系祖細(xì)胞增殖失調(diào)、浸潤(rùn)、凋亡受阻，導(dǎo)致造血功能障礙[1-2]。AML主要表現(xiàn)為貧血、出血、感染等癥狀[3]。研究認(rèn)為，基因異常和表觀遺傳學(xué)改變是AML發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[4-6]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的生物分子，參與染色體修飾、基因印記、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程。不同的lncRNA通過(guò)不同機(jī)制在AML的發(fā)生發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用[7-8]。細(xì)胞周期激酶抑制因子4基因座中反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the inhibitors of cyclin-dependent kinase 4 locus，ANRIL）是定位于人類染色體9p21的lncRNA，其表達(dá)異常與心血管疾病、腫瘤等密切相關(guān)[9-10]。ANRIL在AML中的報(bào)道較少，本研究探討ANRIL在AML發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，以進(jìn)一步闡述AML的發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2021年5月商丘市第一人民醫(yī)院收治的AML患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合AML的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)等檢查確診；②均接受化療，且均可耐受；③年齡≥18歲，復(fù)查時(shí)接受骨髓療效評(píng)價(jià)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤、肝功能嚴(yán)重障礙、精神疾病或自身免疫性疾病；②合并凝血功能異常，對(duì)化療藥物過(guò)敏或存在藥物禁忌證。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入82例AML患者為研究對(duì)象，作為觀察組，其中男54例，女28例，中位年齡33歲。所有患者均給予柔紅霉素及或阿糖胞苷方案化療，依據(jù)患者病情分為初治組（n=53）、緩解組（n=19）和復(fù)發(fā)組（n=10）。初治依據(jù)法、美、英（France-America-British，F(xiàn)AB）診斷標(biāo)準(zhǔn)判定；緩解指化療后患者的骨髓原始和幼稚細(xì)胞比例＜5%；復(fù)發(fā)指化療后患者的骨髓原始細(xì)胞比例＞20%。另選取31例非血液病健康者，作為對(duì)照組，其中男18例，女13例；中位年齡36歲。兩組受試者性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器

Prime Srcipt RT reagent kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，Ultra SYBR Mixture購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。CFX96熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞提取

無(wú)菌條件下抽取所有受試者骨髓5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的抗凝管，1500 r/min離心5 min，取上層血漿于-80℃保存，下層加入2倍體積的生理鹽水混勻。另取裝有淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液）的離心管45°傾斜，緩慢沿離心管壁將含有生理鹽水的骨髓細(xì)胞加入至Ficoll液面上層，室溫2000 r/min離心30 min。此時(shí)細(xì)胞分為4層，小心吸取第2層白色層的單個(gè)核細(xì)胞，并加入等體積生理鹽水洗滌，1500 r/min離心5 min，重復(fù)3次，沉淀物即為單個(gè)核細(xì)胞。

1.4 實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)ANRILmRNA 的相對(duì)表達(dá)量

按照Trizon試劑盒提取單個(gè)核細(xì)胞的RNA，檢測(cè)細(xì)胞中的mRNA濃度和純度，然后合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系：無(wú)核糖核酸酶滅菌蒸餾水 9.5 μl、cDNA 1 μl、正向引物1 μl、反向引物1 μl、2×qPCR混合物12.5 μl；反應(yīng)過(guò)程：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性10 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，計(jì)算ANRILmRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列：ANRIL正向引物5'-TCCATTTACCTGTGCGTGGC-3'，反向引物 5'-GAAGGAAGATTCGGCCACCT-3'；GAPDH正向引物 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 5'-AACGCTTCAATTTGCGT-3'。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANRILmRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

觀察組、初治組、緩解組、復(fù)發(fā)組患者骨髓ANRILmRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。復(fù)發(fā)組患者骨髓ANRILmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于緩解組和初治組，緩解組患者骨髓ANRILmRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于初治組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 AML患者和非血液病患者骨髓ANRIL mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 AML患者和非血液病患者骨髓ANRIL mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

注：a與對(duì)照組比較，P＜0.01；b與初始組比較，P＜0.01；c與緩解組比較，P＜0.01

組別觀察組（n=8 2）初治組（n=5 3）緩解組（n=1 9）復(fù)發(fā)組（n=1 0）對(duì)照組（n=3 1）F值P值2.9 5±0.2 8 a 2.8 5±0.3 2 a 1.5 4±0.1 1 a b 3.4 6±0.2 8 a b c 1.0 0±0.0 8 4 4 4.0 5 6 0.0 0 0 A N R I L m R N A相對(duì)表達(dá)量

2.2 不同臨床特征AML患者骨髓ANRILmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

不同年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平AML患者骨髓ANRILmRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；血小板計(jì)數(shù)＜20×109/L、疾病進(jìn)展、預(yù)后未緩解或緩解后再?gòu)?fù)發(fā)AML患者骨髓ANRILmRNA相對(duì)表達(dá)量分別明顯高于血小板計(jì)數(shù)≥20×109/L、疾病無(wú)進(jìn)展、預(yù)后緩解患者，差異均有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征AML患者骨髓ANRIL mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（n=82）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，RNA表達(dá)水平的變化有助于惡性腫瘤的診斷。人類基因組中僅有不超過(guò)2%的序列能夠編碼蛋白質(zhì)，其他序列雖然不能編碼蛋白質(zhì)，但超過(guò)90%的序列會(huì)轉(zhuǎn)錄成為RNA，此類RNA被稱為非編碼RNA，包括lncRNA。lncRNA是一類長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸、沒(méi)有明顯開(kāi)放閱讀框、具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)功能的生物分子。人類基因組中存在大量的lncRNA，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[11]。

ANRIL主要定位于細(xì)胞核，由19個(gè)外顯子及3個(gè)重要抑癌基因簇反義方向轉(zhuǎn)錄形成3834 bp的mRNA上，可通過(guò)以下兩個(gè)途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10,12]：①ANRIL通過(guò)招募多梳抑制復(fù)合物（polycombrepressive complex，PRC）2介導(dǎo)組蛋白H3賴氨酸27的甲基化，進(jìn)而抑制p15的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。②ANRIL與分子伴侶CBX7相互作用，招募PRC1，介導(dǎo)組蛋白H3賴氨酸27甲基化，進(jìn)而抑制p16蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。ANRIL是引起動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的重要原因，在肺癌、胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)[10]。

本研究采用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)82例AML患者及31例非血液病健康者骨髓中ANRILmRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，觀察組、初治組、緩解組、復(fù)發(fā)組患者骨髓ANRILmRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），與ANRIL在其他腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)一致[12-13]，且Tan等[14]的研究表明，ANRIL在AML患者中高表達(dá)，且高表達(dá)ANRIL患者的OS更短。表明ANRIL可促進(jìn)AML的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組患者骨髓ANRILmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于緩解組和初治組，緩解組患者骨髓ANRILmRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于初治組。Sun等[15]的研究也表明，ANRIL在AML患者中高表達(dá)，療效評(píng)價(jià)為完全緩解后其相對(duì)表達(dá)量降低，且可通過(guò)抑制脂聯(lián)素的表達(dá)促進(jìn)AML細(xì)胞存活，其作用機(jī)制可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂聯(lián)素受體1/AMP依賴的蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK]/沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）糖代謝通路有關(guān)。表明化療藥物的誘導(dǎo)刺激可促使ANRIL的表達(dá)上調(diào)。因此，AML患者治療過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)ANRILmRNA水平測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果調(diào)整治療方案，使患者的治療更具科學(xué)性。

綜上所述，ANRIL在AML患者中高表達(dá)，其表達(dá)水平能反映患者的疾病嚴(yán)重程度，可指導(dǎo)臨床診療。