馬超 楊莉莉 鄭秋月 鄭文杰 曹際娟*

（1.大連民族大學生物技術與資源利用教育部重點實驗室 遼寧 大連 116600；2.天津師范大學）

1 前言

對蝦白斑?。╓hite Spot Disease，WSD），是由對蝦白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）引發(fā)的一種嚴重綜合性傳染性疾病[1]。WSSV屬線頭毒科目 （Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus），是一種快速復制、毒性極強的蝦病原體，已在全球出現(xiàn)并成為最普遍和廣泛的病毒之一[2]。由于其具有發(fā)病急、死亡率高、死亡速度快的特點，多年來一直嚴重威脅著全世界對蝦的養(yǎng)殖安全。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為強制通報水生動物疫病，亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展網(wǎng)絡中心（NACA）將其列為強制通報疫病[3]，我國農(nóng)業(yè)部在2008年將其列為一類動物疫病。

WSSV的形態(tài)和超微結構迄今為止尚未被完全了解。在顯微鏡下可觀察到，WSSV病毒粒子從桿狀到卵圓形橢圓狀，帶有3層囊膜，在一端有長包膜延伸，粒子尺寸范圍較大（80 nm～120 nm×250 nm～380 nm）。病毒包膜有6～7 nm厚，病毒粒子為桿狀，包含雙鏈DNA[4]。WSSV病毒具有毒力強、發(fā)病急、復制速度快、傳播力度強、致死率高等特點，患病的蝦從出現(xiàn)癥狀至死亡只有3～5 d的時間，甚至更短[5]。感染W(wǎng)SSV的蝦在外骨骼、附屬物和表皮內(nèi)會迅速出現(xiàn)大小不等的白色斑點（直徑約0.5～3.0 mm），因此取名為白斑綜合征。

2 流行現(xiàn)狀

1921年，中國臺灣首次發(fā)現(xiàn)WSD，之后蔓延至其他亞洲國家。美洲首例確診的WSSV病例于1995年在美國德克薩斯州被發(fā)現(xiàn)[6]。此病的感染率較高，約7 d可使池中70%以上的蝦被感染，甚至死亡。這種流行性病毒性疾病的爆發(fā)，給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[7]。此病毒可以通過水域大范圍傳播，傳染性強，一旦水中有病蝦，病蝦的排泄物及其他身體組織會迅速擴散，將此范圍的水域污染，同水域的所有正常對蝦及其他蝦類[8]，如小龍蝦等都有可能受到感染[9]。人工感染實驗證明，通過注射、投食、浸泡3種感染方式均能造成WSSV的感染。可見WSSV的感染性極強，因此對WSD的防治工作勢在必行。

3 WSSV的基因組信息及主要結構蛋白

對WSSV的基因組及蛋白質(zhì)的鑒定，有助于研究人員了解WSSV的裝配形式和入侵機理。目前在GenBank公布的WSSV的基因組序列已有8株[10]。WSSV病毒的結構蛋白主要包括核衣殼蛋白、囊膜蛋白和被膜蛋白，病毒的非結構蛋白大多是一些催化、調(diào)節(jié)病毒復制的酶類和調(diào)控蛋白。目前已經(jīng)鑒定的蛋白主要有核衣殼蛋白VP15[11]，在病毒粒子的囊膜蛋白中占比較高的VP19[12]蛋白，從純化的WSSV中分離鑒定而得到一種結構蛋白VP24[13]。還有作為粘附蛋白的VP26[14]，此蛋白能夠?qū)⒉《菊掣接谒拗骷毎?，從而幫助病毒感染宿主，且VP26在病毒粒子中與其它結構蛋白相比含量較高。囊膜相關蛋白VP28[15-16]也是非常重要的，它能夠在脫離病毒狀態(tài)下，單獨和宿主細胞發(fā)生結合。除此之外，還有在WSSV感染宿主時能夠起到一定中和作用的VP31[17]囊膜蛋白及VP32[18]、VP33[19-20]等WSSV病毒的結構蛋白。

4 WSSV的檢測技術

目前，針對對蝦暴發(fā)性流行病的病理學、病原學、診斷學及流行病學的研究已深入至分子水平。但由于WSSV具有細胞內(nèi)寄生的特性，是通過水生途徑傳播且尚無有效藥物，因此，到目前為止還不能完全控制WSSV的疫情。當前最主要的措施是及早發(fā)現(xiàn)和消滅傳染源，果斷切斷傳播途徑，在對蝦養(yǎng)殖過程中實施早期診斷和提前預防的策略，以建立完善準確、高效、靈敏、快捷、方便的檢測方法。常用的檢測技術主要包括組織病理學診斷技術、免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術。

4.1 組織病理學診斷技術

組織病理學診斷是比較傳統(tǒng)的檢測方法，主要以染色組織病理學檢測法為主，通過電子顯微鏡觀察細胞核是否腫大和核內(nèi)嗜酸兩性著色病變來進行判斷，比較直觀。但該方法操作較為繁瑣、靈敏度較低，且易受時間、實驗設備和人員的限制，還可能出現(xiàn)漏檢的情況，實用性較差，不宜應用于現(xiàn)場檢測[21]。

4.2 免疫學檢測技術

4.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附技術（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是利用抗體分子能夠與抗原分子特異性共價結合的特點，將游離的雜蛋白和結合于固相載體的目的蛋白相結合，并利用特殊的標記物對其定性或定量分析的一種檢測方法。該技術建立在抗原抗體反應上，能夠應用于大批量檢測，在發(fā)病前20余天就可以做出預測，對儀器的要求較低，在實際應用中具有廣闊的前景。但是制備多克隆抗體或單克隆抗體的過程較為繁瑣、歷時較長，且容易被污染而產(chǎn)生假陽性[22]。

XIE X等[23]采用蛋白質(zhì)組學技術鑒定了WSSV的58種結構蛋白，發(fā)現(xiàn)其中至少7種囊膜蛋白與病毒的侵染過程相關。

鄭曉聰?shù)萚24]用純化的表達蛋白VP28制備了單克隆抗體與多克隆抗體，成功建立了檢測WSSV的雙抗體夾心ELISA方法。優(yōu)化后的ELISA法與早期檢測技術相比，能夠更大程度地保證檢測的準確性。

Tang Xiaoqian等[25]對雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）定量檢測WSSV進行優(yōu)化。此研究中建立了WSSV對數(shù)濃度與OD值的標準曲線，得出在120～7 680 ng/mL范圍內(nèi)兩者呈線性關系，定量測定了人工感染W(wǎng)SSV后螯蝦不同組織中的病毒蛋白，可檢測感染小龍蝦從感染初期至死亡階段的WSSV傳播情況，為WSSV的診斷提供了參考。

4.2.2 膠體金試紙法

膠體金試紙法是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。自1971年FAULK和TAYTOR將膠體金引入免疫化學，此方法在生物醫(yī)學領域得到了廣泛應用。該技術大多用單克隆抗體標記，具有很好的特異性，且陰陽性顯色更明顯，肉眼更容易判斷[26]。

張玲等[27]通過復蘇WSSV單克隆抗體雜交瘤細胞2E6、1G12、3B7、4G9和5D2，利用辛酸-硫酸銨法純化腹水單抗。選擇單抗2E6作為金標抗體，以檸檬酸鈉還原法制備膠體金，通過膠體金標記單抗2E6制備金標抗體，整個過程僅需要10 min，且無需專業(yè)儀器設備，通過肉眼即可觀察檢測結果，對養(yǎng)殖現(xiàn)場的蝦類、蟹類等甲殼類生物WSSV的半定量快速檢測適用性較好，但對因操作不當?shù)犬a(chǎn)生的假陽性問題還需進一步優(yōu)化。

4.3 分子生物學檢測技術

應用核酸探針進行斑點雜交法[28]和原位雜交法[29]對WSSV進行檢測是早期在分子生物學領域較為常用的方法，但這類方法耗時長、操作繁瑣，且可能存在非特異性標記，不適宜在基層使用。之后通過不斷優(yōu)化，該技術更加成熟，常用的分子生物學檢測技術主要有套式PCR、熒光PCR、LAMP和RPA等。

4.3.1 套式PCR檢測技術

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外大量擴增特定DNA片段的分子生物學技術，可看作是生物體外的特殊DNA復制[30]。1985年美國科學家穆利斯發(fā)明了PCR技術，并于1993年獲得了諾貝爾獎。目前我國的國家標準是采用套式PCR檢測技術[31]，套式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應，使用2對PCR引物擴增完整的片段，以第1步PCR的擴增產(chǎn)物為模板，將第2對引物結合在第1步PCR產(chǎn)物的內(nèi)部。該方法與一步PCR相比，靈敏性、特異性更高，但存在著操作繁瑣、易交叉污染等問題。

李文杰等[32]根據(jù)GenBank中已發(fā)表的3株WSSV的VP28基因序列，建立了檢測克氏原螯蝦WSSV的套式PCR方法。該方法第1輪擴增的敏感性是36 ng，第2輪擴增的敏感性是36 pg，其靈敏度比一步PCR提高了1 000倍，具有更高的檢測靈敏度和應用前景。但該方法也容易出現(xiàn)假陽性，常雯等[33]對套式PCR方法出現(xiàn)假陽性的原因進行分析并提出控制措施。

4.3.2 實時熒光定量PCR檢測技術

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是指在DNA擴增反應中，在PCR反應體系中加入熒光基團，保證PCR反應時熒光信號的增加和PCR產(chǎn)物擴增的同步性，由于其在每輪循環(huán)時，都能檢測1次熒光信號的強度，因此能夠在實現(xiàn)監(jiān)測熒光信號累積的同時，對PCR全程進行實時監(jiān)測，并利用標準曲線，對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。

Xian-Hong Meng等[34]采用TaqMan實時PCR法，對不同生長季節(jié)的南美白對蝦的WSSV感染情況進行調(diào)查，初步發(fā)現(xiàn)，在蝦群中病毒載量為103copies/ng時，會引發(fā)WSSV的爆發(fā)。

陳蒙蒙[35]針對凡納濱對蝦血細胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridescent Virus，SHIV）病原建立的TaqMan探針實時熒光定量PCR方法，其靈敏度能夠達到4 copies SHIV/μL DNA，可以應用于臨床采集對蝦樣品和人工感染對蝦樣品的檢測。該方法檢測靈敏度很高，對研究建立檢測WSSV的實時熒光定量PCR技術具有借鑒和指導作用。

4.3.3 環(huán)介導等溫擴增檢測技術（LAMP）

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是指在等溫（60℃～65℃）條件下，短時間（通常是1 h內(nèi)）內(nèi)進行核酸擴增的方法，和常規(guī)PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，是一種具有簡單、快速、特異性強、適合現(xiàn)場、基層快速檢測等特點的全新的核酸擴增方法[36]。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等方面能媲美甚至優(yōu)于PCR技術，且檢測成本低于熒光定量PCR。

KONO等[37]于2004年首次應用LAMP技術檢測WSSV，采用2組引物擴增WSSV基因組的235 bp靶標片段，檢測靈敏度能夠達到10 fg。

李紅梅等[38]選取WSSV的囊膜蛋白VP28基因為靶標，利用ESE-Quant tube scanner檢測平臺建立了一套基于LAMP的實時熒光檢測方法。結果顯示，對于傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌O1和O139等5種病原DNA，該方法具有很好的WSSV檢測特異性。與瓊脂糖凝膠電泳檢測法以及ZHU F等[39]建立的TaqMan實時熒光PCR等檢測方法相比，具有相同的靈敏度，結果表明，在1.365×104～1.129×109copies/μL濃度范圍內(nèi)，可檢測到WSSV拷貝數(shù)，105稀釋組（1.524×105copies/μL）死亡率為60%。但在樣品模板不純的情況下，該方法可能會導致擴增曲線傾斜向上等假性結果現(xiàn)象。

張娜等[40]針對WSSV和IHHNV病毒建立了雙重LAMP檢測方法，采用熒光目測觀察和電泳分析2種方法對結果進行判定，靈敏度結果顯示，該方法的最低檢測限為100 fg，熒光顯色目測判定方法的最低檢測限為1 pg，優(yōu)于周國勤等[32]建立的套式PCR方法（36 pg）。但該方法無法將2種感染病毒加以區(qū)分，且熒光目測觀察極易出現(xiàn)假陽性。

吳麗云等[41]利用鈣黃綠素作為檢測指示劑，建立了可視化LAMP快速檢測WSSV的方法，最低檢測限可達到0.225～2.250 copies/μL，此方法具有操作簡便、檢測快速、靈敏度高等優(yōu)點，能夠滿足實際應用的需求，但是該方法的靈敏度是基于純化的陽性質(zhì)粒，而實際感染病毒樣本的核酸存在著諸多抑制因子，可能會影響實際檢測結果。

4.3.4 重組酶聚合酶擴增檢測技術（RPA）

重組酶聚合酶擴增檢測技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被 稱 為 是 可 以 替 代PCR的核酸檢測方法，其最大優(yōu)勢是可以在等溫條件下進行擴增。與傳統(tǒng)PCR相比，RPA引物堿基數(shù)更多，引物解鏈溫度對擴增性能影響很小[42]。

夏小明等[43]選定Vp28作為WSSV檢測重組質(zhì)粒的靶標序列，利用RPA技術建立的檢測方法的最低檢測限約為2.250～0.225 copies/μL，具有較高特異性且無交叉反應，適用于養(yǎng)殖對蝦的現(xiàn)場監(jiān)測，但是該方法的穩(wěn)定性有待于進一步優(yōu)化。

Thawatchai等[44]將CRISPR-Cas12a熒光檢測技術與快速核酸擴增相結合，對WSSV的Vp28質(zhì)粒進行檢測，研究中構建的RPA-Cas檢測方法的最低檢測限為200拷貝數(shù)/反應，且特異性較好，無交叉反應出現(xiàn)。該方法在恒溫條件下即可進行，無需專用儀器，可通過便攜式熒光分光光度計或暴露在紫外線下實現(xiàn)可視化，適用于現(xiàn)場監(jiān)測。

5 結論

人類對甲殼類病毒的研究歷史不長，目前約60年，特別是對養(yǎng)殖蝦類的病毒病害研究歷史更短。本文通過分析WSD的流行現(xiàn)狀，主要介紹了WSSV檢測技術的研究進展及其特點。分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有方法仍然會有因操作不當?shù)纫蛩爻霈F(xiàn)特異性、靈敏度、易污染等問題，影響檢測結果的準確性，因此需要建立更多檢測方法以相互對比驗證。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模不斷擴大，需要更適合現(xiàn)場操作、可視化的快速檢測技術。今后對WSSV檢測技術的研究依然是以分子生物學水平為主，借助多方快檢技術相互驗證、核酸提取與擴增一體化的微流控芯片檢測技術、CRISPRCas12a基因編輯技術與核酸擴增相結合等技術或?qū)⒊蔀檫m用于現(xiàn)場快速檢測WSSV技術的重點發(fā)展方向。