夏安然，羅群強(qiáng)，甘林

1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手足外科/小兒骨科，廣西百色 533000

骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，一般在兒童以及青少年群體中發(fā)病率較高，臨床工作中常見骨肉瘤集中在長骨干骺端，目前在臨床上針對骨肉瘤的治療手段多采用手術(shù)切除腫瘤，結(jié)合全身化療以控制微轉(zhuǎn)移瘤。根據(jù)最近幾年的臨床統(tǒng)計(jì)，原發(fā)性骨肉瘤患者的五年生存率約為70%，但進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性疾病患者的總生存率低于20%。雖然隨著各項(xiàng)研究開展，臨床中對骨肉瘤的了解不斷加深，而且在臨床試驗(yàn)中多次通過改變化療藥物劑量或者嘗試研發(fā)新型的化療藥來加強(qiáng)療效。令人沮喪的是，由于骨肉瘤的特異性較大，目前對骨肉瘤患者的臨床治愈能力依舊沒有明顯提升，導(dǎo)致骨肉瘤患者的預(yù)后并不理想。特別是一些在初診時(shí)就已經(jīng)確定發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，其五年生存率只有20%左右。近年來，采用針對性療法改進(jìn)治療方案提升患者預(yù)后生存率的問題依舊存在，然而卻面臨著缺乏特定研究目標(biāo)的困擾。根據(jù)目前的研究進(jìn)展來看，針對性治療骨肉瘤的靶向化療藥物或更加完善的臨床治療方案尚未成型。因此，尋找合適的生物標(biāo)志物對骨肉瘤的早期監(jiān)測及臨床治療具有重要的意義。本文通過對骨肉瘤生長侵襲中的相關(guān)調(diào)控蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納綜述，從而為骨肉瘤的針對性治療、提高患者生存率找出新的治療方案，進(jìn)一步為臨床治療骨肉瘤提供科學(xué)依據(jù)。

1 Survivin 蛋白

生存素[1]（也稱為Survivin、BIRC5）是一種進(jìn)化保守的真核蛋白，在細(xì)胞分裂中的作用至關(guān)重要，可以抑制細(xì)胞死亡。通常，它僅在活躍的增殖細(xì)胞中表達(dá)，尤其在大多數(shù)癌癥中表達(dá)上調(diào)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，生存素在細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡作用與半胱天冬酶蛋白（caspase）直接和間接相關(guān)[2]。生存素基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制基因，細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡的主要形式，主要依賴于半胱天冬酶，在體內(nèi)有兩種凋亡途徑：內(nèi)在途徑和外在途徑，當(dāng)接收到內(nèi)源性應(yīng)激信號時(shí)，線粒體釋放細(xì)胞色素C，同時(shí)導(dǎo)致半胱天冬酶9（caspase-9）的激活從而調(diào)控細(xì)胞凋亡；相比之下，外源性途徑則屬于線粒體非依賴性，并且由配體與細(xì)胞表面受體的結(jié)合觸發(fā)效應(yīng)。兩種途徑都有半胱天冬酶3 和7（caspase-3、caspase-7）存在，其通過分離下游大分子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來的研究重心已將生存素作為腫瘤治療的潛在藥物靶點(diǎn)。研究表明，caspase 在臨床上的大多數(shù)癌癥中都呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且高度影響患者預(yù)后情況，而且通過caspase 在癌癥細(xì)胞中的高表達(dá)同樣可以用來判斷其癌癥細(xì)胞的增殖能力以及預(yù)測治療效果，而caspase 在骨肉瘤的增殖分化以及生長侵襲中同時(shí)具有重要作用[3]。這種關(guān)聯(lián)表示生存素在骨肉瘤的生長侵襲中同樣也具有一定的相關(guān)性。夏鵬等[4]通過構(gòu)建特異性siRNA，將siRNA 轉(zhuǎn)錄至骨肉瘤MG-63 細(xì)胞中。并檢測在MG-63 細(xì)胞中FANCD2 基因的表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，降低FANCD2 基因在細(xì)胞中的表達(dá)，則p53信號通路開始調(diào)控細(xì)胞凋亡。當(dāng)FANCD2 基因表達(dá)受抑制時(shí)，細(xì)胞內(nèi)TP53INP1 基因表達(dá)上調(diào)，該基因可促進(jìn)p53 的磷酸化，導(dǎo)致p21 蛋白被激活，從而影響依賴caspase 介導(dǎo)的骨肉瘤MG-63 細(xì)胞，加速其發(fā)生凋亡[5]。這與王玉峰等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。丁艷平等[5]則是通過選取45 例口腔癌石蠟標(biāo)本，利用免疫組化方法將各個分組的口腔癌細(xì)胞的生存素以及caspase-3 進(jìn)行染色，通過不同陽性染色程度進(jìn)行區(qū)分總結(jié)，最后發(fā)現(xiàn)，隨著口腔癌增生分化的嚴(yán)重程度增加，caspase-3 的陽性染色逐漸降低，生存素的表達(dá)逐漸升高。caspase-3 的表達(dá)被抑制，癌細(xì)胞增殖分化較前明顯升高。而王玉峰等[6]在研究二硫代氨基甲酸吡咯烷（pynolidine dithiocarbamate, PDTC）抑制骨肉瘤MG-63 細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，通過體外構(gòu)建不同濃度的PDTC 培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同濃度的PDTC 對骨肉瘤細(xì)胞抑制效果完全不同，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后認(rèn)為PDTC 通過促進(jìn)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3（caspase-3）蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖分化。同時(shí)因?yàn)樯嫠貙aspase-3 有直接抑制作用，二者表達(dá)程度成反比，從而認(rèn)為生存素對于骨肉瘤癌細(xì)胞的生長侵襲以及后續(xù)的分化復(fù)發(fā)有明顯促進(jìn)作用。

2 TRIM35 蛋白

三方基序（tripartite motif, TRIM）家族是具有高度保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族。TRIM 家族蛋白的成員在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[7]。而在癌細(xì)胞生長侵襲過程中，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾參與調(diào)節(jié)許多生物過程。其中泛素化是針對賴氨酸殘基并調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程的翻譯后修飾之一。目前研究表明，細(xì)胞實(shí)現(xiàn)泛素化反應(yīng)需要3 種酶[8]：泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）。有研究指出，在癌細(xì)胞的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)產(chǎn)生的生化反應(yīng)中，泛素的結(jié)合反應(yīng)由E1、E2 和E3 催化[9]。E3 是介導(dǎo)E2 和底物之間的支架，負(fù)責(zé)底物識別。而三元基序家族蛋白由于具有較高程度的E3 泛素連接酶活性[10]。所以在癌癥、炎癥性疾病和與生長相關(guān)疾病等多種疾病中均發(fā)揮調(diào)控作用[11]。TRIM 家族的其他成員與癌癥發(fā)展有關(guān)，而不參與染色體的重新排列，目前看來可能就是通過泛素化或腫瘤抑制其蛋白功能喪失。而研究表明，TRIM35 在影響骨肉瘤生長侵襲過程中，可以通過介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的方式促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長侵襲以及增殖分化[12]。EMT 是一種細(xì)胞程序，在人體內(nèi)對胚胎發(fā)生、傷口愈合和惡性進(jìn)展至關(guān)重要。在EMT 被激活的情況下，癌癥干細(xì)胞在人體中增長速度較前明顯加快，直接加速了癌癥的生長侵襲。目前Yu L 等[13]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EMT 與間質(zhì)源性骨肉瘤相關(guān)。張杰等[7]通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)TRIM35 在骨肉瘤組織中表達(dá)較正常組織顯著提高。通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)印證了過表達(dá)TRIM35 能夠顯著提高骨肉瘤細(xì)胞在組織中的遷移能力。而上述的研究結(jié)論均可以表明在骨肉瘤的生長侵襲以及預(yù)后轉(zhuǎn)移的過程中，TRIM35 可以通過影響EMT 在組織中的表達(dá)能力，消除上皮細(xì)胞的極化，從而促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步增加骨肉瘤癌細(xì)胞的生長侵襲能力。

3 Neurensin-2 蛋白

神經(jīng)膜蛋白2（neurogenin 2, NRSN2）是一種小神經(jīng)元膜蛋白，定位于神經(jīng)細(xì)胞中的小囊泡中。有研究文獻(xiàn)報(bào)道NRSN2 主要參與肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）以及非小細(xì)胞癌（non-smallcell lung cancer, NSCLC）的發(fā)生發(fā)展。Keremu A等[14]通過生物信息學(xué)分析方法在GEO 數(shù)據(jù)庫找出NRAN2 蛋白，發(fā)現(xiàn)其在骨肉瘤組織中高度表達(dá)。經(jīng)過研究證實(shí)，目前NRSN2 的表達(dá)在18 個新的骨肉瘤組織中更加常見。NRSN2 通過直接影響PI3K/AKT/mTOR 信號傳導(dǎo)和間接影響Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長侵襲。PI3K/Akt 是一條在多種癌細(xì)胞中發(fā)揮作用并高度活躍的信號傳導(dǎo)通路[15]。大量證據(jù)表明，許多與癌細(xì)胞生長高度相關(guān)的轉(zhuǎn)化因子通過PI3K/Akt 途徑促進(jìn)骨肉瘤組織的進(jìn)一步惡化增殖[16-17]。PI3K/Akt在腫瘤的絕大多數(shù)惡性表型中都高度活躍，包括腫瘤生長侵襲、癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移等[18]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NRSN2 在組織中通過抑制或促進(jìn)PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)通路以抑制或促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡或增殖[19]。Wnt信號傳導(dǎo)通路在癌細(xì)胞生長侵襲過程中同樣具有重要作用，研究表明，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)在骨肉瘤細(xì)胞增殖中確實(shí)發(fā)揮著不可或缺的作用，其中，在Wnt 信號傳導(dǎo)通路中最重要的就是β-連環(huán)蛋白（β-catenin）[20]。由于PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)通路可以抑制GSK3β 的活化[21]，從而影響到GSK3β 對β-連環(huán)蛋白的降解，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白降解速度變慢，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。最新研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，由人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中所產(chǎn)生出的miR-1913 的外泌體轉(zhuǎn)移也可以通過靶向NRSN2 抑制骨肉瘤的增殖生長[22]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）在腫瘤微環(huán)境中的許多關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用均依賴于各種機(jī)制，包括分泌細(xì)胞外囊泡。外泌體就屬于BMSCs 所分泌的細(xì)胞外囊泡之一。外泌體通過傳遞各種核酸來參與細(xì)胞增殖生長以及轉(zhuǎn)移分化[23]。Yu L 等[13]通過IHC 染色以及蛋白質(zhì)印記等方法發(fā)現(xiàn)，相較于正常組織，NRSN2 在骨肉瘤組織中的表達(dá)上調(diào)。并通過實(shí)驗(yàn)研究表明，NRSN2 在骨肉瘤中的表達(dá)高度與骨肉瘤的增殖生長以及預(yù)后不良成正相關(guān)。

4 LATS2 蛋白

LATS 家 族蛋 白，包 括LATS1 和LATS2，LATS（大型腫瘤抑制因子）家族的腫瘤抑制因子（LATS1和LATS2）在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程中作用顯著[24]。LATS 功能繁多，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和細(xì)胞遷移，通常在各種細(xì)胞中均參與調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控和維持遺傳穩(wěn)定性。LATS 的活性通過各種機(jī)制受到嚴(yán)格控制，包括翻譯后修飾，差異定位和表達(dá)。LATS1 或LATS2 的功能失調(diào)常會使細(xì)胞惡性增生，逐漸向腫瘤轉(zhuǎn)化。它們的高度同源性和功能重疊，在Hippo-LATS 信號通路中早已得到印證，雖然對這些活動的具體潛在機(jī)制知之甚少，但目前的數(shù)據(jù)表明，LATS 信號傳導(dǎo)與成熟的腫瘤抑制或致癌途徑 相 交，包 括p53，Ras 或Akt 網(wǎng) 絡(luò)。人LATS1 和LATS2 是AGC 亞家族的Ser/Thr 激酶，與核Dbf2 相關(guān)激酶（NDR1/2）關(guān)系最密切[25]。而Hippo-LATS 通路[26]中的激活因子Yes 相關(guān)蛋白[27]（YAP）和轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ 結(jié)合基序[28]（TAZ）的表達(dá)異常在大多數(shù)軟組織腫瘤中影響頗深，YAP 不僅參與細(xì)胞增殖分化，同樣也是重要的預(yù)后標(biāo)志物[29]，而TAZ 對腫瘤干細(xì)胞自我更新及腫瘤形成能力起重要作用[30]，當(dāng)然也可影響上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[31]，臨床上與腫瘤的復(fù)發(fā)關(guān)系密切[32]。LATS 激酶對于生物體健康，基因組完整性和癌癥預(yù)防至關(guān)重要。對于LATS2蛋白而言，p53 可以直接與LATS2 啟動子相互作用以誘導(dǎo)LATS2 表達(dá)。之前文獻(xiàn)報(bào)道，LATS2 和YAP/TAZ 之間的這種負(fù)反饋回路有助于抑制YAP 活動的持續(xù)時(shí)間[33-34]，維持體內(nèi)平衡并使Hippo 通路更加穩(wěn)定，以抵抗YAP 過度表達(dá)所產(chǎn)生的致癌作用[35]。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)LATS2 缺失，加速了YAP 誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展[36]。這表明保留LATS2 蛋白的高表達(dá)實(shí)際上有時(shí)可能對腫瘤有益[37]。作為LATS 家族蛋白，LATS1 與LATS2 對細(xì)胞的作用不同[38]，實(shí)驗(yàn)表明，癌細(xì)胞中與LATS1 相關(guān)的蛋白質(zhì)與雌激素信號傳導(dǎo)有關(guān)[39]，而LATS2 已經(jīng)進(jìn)化出與細(xì)胞周期、代謝和p53 相關(guān)的發(fā)散相互作用組[40]。p53 過表達(dá)將會導(dǎo)致骨肉瘤在內(nèi)的大多數(shù)癌細(xì)胞凋亡。而在體內(nèi)LATS2 和YAP/TAZ 之間的相互作用又可以減少YAP 的活動時(shí)間[41-42]，通過鞏固Hippo通路達(dá)到抑癌效果[43]。最新研究表明，骨肉瘤癌細(xì)胞中的Hippo/YAP 和Wnt/β-連環(huán)蛋白兩種信號通路不僅對生理成骨發(fā)揮重要作用，而且對骨肉瘤的生長侵襲至關(guān)重要[44-45]。這兩條信號通路之間關(guān)系緊密，尤其，β-catenin 可以彌補(bǔ)YAP-敲除MSCs中的成骨缺陷[46]。激酶LATS2 嚴(yán)格控制YAP 的活性[47]：通過在Ser127 磷酸化YAP，LATS2 促進(jìn)了細(xì)胞核的退化[48]，隨后YAP 的細(xì)胞質(zhì)降解。因此，LATS2 能有效拮抗YAP/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)[49-50]。Hippo 通路在骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移中也占有很重要的地位[51]。所以這也表明LATS2 蛋白對骨肉瘤癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后治療都具有較明顯的抑制作用。為骨肉瘤的預(yù)后治療提供了潛在的策略以及研究方向[52]。

5 總結(jié)與展望

目前與骨肉瘤生長侵襲有關(guān)的相關(guān)蛋白正在越來越全面地被發(fā)現(xiàn)，上述四種蛋白只是在近年實(shí)驗(yàn)研究中相較于其他蛋白而言，對骨肉瘤生長侵襲影響更深。骨肉瘤作為一種治愈難度高、預(yù)后較差的惡性腫瘤，其在人體內(nèi)的發(fā)生發(fā)展具有相當(dāng)復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制。當(dāng)然還有許多尚未被研究發(fā)現(xiàn)所闡明的蛋白在人體內(nèi)發(fā)揮著重要作用。在骨肉瘤的蛋白作用機(jī)制中，單一蛋白或是多重蛋白相互結(jié)合對骨肉瘤的生長侵襲更具主導(dǎo)作用，還需要進(jìn)一步地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)論證。但令人堅(jiān)信的是，以此為切入點(diǎn)進(jìn)行更加深入全面的研究對臨床靶向治療骨肉瘤提供了更好的新思路。

由于骨肉瘤的惡性程度較高，其在臨床上的治愈率較低，骨肉瘤細(xì)胞的高度活躍能力以及基因高表達(dá)使骨肉瘤在早期就對機(jī)體造成嚴(yán)重的破壞，并且隨著轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況的出現(xiàn)，更進(jìn)一步地降低了骨肉瘤患者的生存率以及預(yù)后。隨著臨床化療耐藥性的逐漸增加，單純靶向治療骨肉瘤的新方法尤其被需要，這就需要更加全面深入地研究骨肉瘤生長侵襲的特性以及蛋白標(biāo)志物，追根究底，研究出新型的低耐藥的靶向治療藥物，更好地抑制骨肉瘤癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖分化，從而更好地提升患者預(yù)后以及生存率，從根本上解除患者病痛。目前國內(nèi)外對于骨肉瘤的研究正在逐漸地從簡單的發(fā)生機(jī)制研究向細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)信號通路以及蛋白標(biāo)志物上進(jìn)行轉(zhuǎn)變，對于骨肉瘤的生長侵襲研究已經(jīng)日趨完善，接下來，通過研究其特異性蛋白標(biāo)志物和能夠影響其發(fā)生發(fā)展的主要信號通路并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而找出更好更新穎的治療骨肉瘤的方法是當(dāng)前要開展的工作。通過抑制其主要的相關(guān)信號通路以及促進(jìn)特異性蛋白標(biāo)志物失活來達(dá)到抑制骨肉瘤生長侵襲的作用，為研究出骨肉瘤的單純靶向治療藥物進(jìn)一步提供更好的理論支撐，為臨床上提供更完善的治療計(jì)劃，從而開發(fā)出更具有特異性的抗癌藥物。