楊虎，王佩瑤，李小偉，王繼飛，楊君瓏*

1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏賀蘭山國家級自然保護區(qū)管理局，寧夏 銀川 750021

土壤真菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有分解有機物，維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡、物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換的重要作用（Adélia et al.，2015）；也能與植物形成共生體，促進植物生長及土壤生產(chǎn)力的改善（Hu et al.，2017），對土壤質(zhì)量具有重要影響。土壤真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)能反映土壤養(yǎng)分與土壤健康狀況（Tedersoo et al.，2014）。影響土壤真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的主要因子有生物因素，如植被類型（Roy et al.，2013）、根系分泌物（劉淑霞等，2008）、凋落物（桑昌鵬等，2017）等；非生物因素，如土壤溫度（Ma et al.，2012）、pH 值（Tripathi et al.，2012）、土壤養(yǎng)分狀況（Cox et al.，2010）等。但不同的生態(tài)系統(tǒng)，其主導(dǎo)環(huán)境生物和非生物因子存在巨大差別（柴永福等，2016）。因此，辨析影響不同生態(tài)系統(tǒng)土壤真菌群落多樣性及其組成的主要影響因素，對生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性研究具有重要意義。

相對于水平分布的生態(tài)系統(tǒng)，山地生態(tài)系統(tǒng)在海拔梯度上由于生態(tài)因子的改變形成了土壤理化性質(zhì)、植被類型以及區(qū)域小氣候的梯度效應(yīng)（谷曉楠等，2017），土壤真菌受海拔梯度效應(yīng)的影響，會形成明顯的地理分布特點（Cui et al.，2019）。在山地森林生態(tài)系統(tǒng)中，真菌群落多樣性隨著海拔梯度增加存在上升（Ni et al.，2018）、下降（Sheng et al.，2019）、“單峰”模式（Liu et al.，2015）、“U”型模式（Wang et al.，2015）和無明顯變化（Meng et al.，2013）5種模式。這說明土壤真菌對于土壤環(huán)境變化非常敏感（Hu et al.，2014）。因此，分析不同海拔梯度植被類型的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性對山地生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)及對環(huán)境變化的響應(yīng)意義重大。

賀蘭山是寧夏平原乃至華北地區(qū)的天然生態(tài)屏障。其植被類型在海拔梯度上分布明顯，由低到高依次分為山地荒漠草地、淺山疏林和灌叢、亞高山針葉林、亞高山草甸（劉秉儒等，2014）。該區(qū)域是研究海拔梯度上不同植被類型真菌群落結(jié)構(gòu)的天然場所，然而，對于該區(qū)域的研究主要集中于動植物，迄今僅有劉秉儒等（2013）利用Biolog微平板法和PLFA法對該區(qū)域土壤微生物功能多樣性和群落結(jié)構(gòu)做了相關(guān)報道，而PLFA法分類水平低，不能鑒定分析出微生物具體的分類水平（劉國華等，2012）；高通量測序因其測序結(jié)果準(zhǔn)確、通量高，能夠準(zhǔn)確反映土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)成為新一代被學(xué)者廣泛應(yīng)用的測序技術(shù)手段（樓駿等，2014）。本研究利用高通量測序技術(shù)，分析賀蘭山東坡不同植被類型的土壤真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)，闡明土壤真菌分布特征與影響因素，為賀蘭山生態(tài)環(huán)境保護提供土壤微生物層面理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

賀蘭山位于銀川平原和阿拉善戈壁荒漠之間，地處 38°27′—39°30′N、105°41′—106°41′E 之間（圖1），山體孤立，其獨特的地理位置阻擋了騰格里沙漠東移，削弱了西北寒流的侵襲。山地主體海拔在2000—3000 m之間，相對高度在1500—2000 m，由北向南地勢逐漸降低，北部最高峰俄博疙瘩高達3556.1 m。該區(qū)是干旱—半干旱地區(qū)荒漠與草原的過渡帶，呈現(xiàn)顯著的過渡特征，擁有豐富的物種多樣性，且在海拔梯度上呈現(xiàn)明顯的植被類型帶分布特征，由低到高大致分為荒漠草地帶、疏林灌叢帶、針葉林帶和亞高山草甸帶。該地區(qū)冬季寒冷干燥，夏季溫暖少雨，是典型的大陸性氣候。降雨量年季變化較大在 230—600 mm之間且具有明顯的垂直分布，土壤類型主要為灰褐土、灰鈣土和亞高山草甸土（劉秉儒，2010）。

圖1 樣點分布圖Figure 1 Sample point distribution diagram

1.2 樣地設(shè)置及土樣采集

賀蘭山為南北走向山體，本研究從北至南分別在賀蘭山東坡大水溝、蘇峪口溝、大口子溝沿海拔分布建立3條調(diào)查樣線。從低至高海拔按照植被類型分布（主要分布山地荒漠草地、淺山灌叢、亞高山針葉林和亞高山草甸），沿著調(diào)查樣線在每個植被類型同一等高線位置建立3個重復(fù)調(diào)查樣地，樣地間隔100 m以上，每個植被類型共計9個重復(fù)樣地。亞高山針葉林樣地建立20 m×20 m的樣方調(diào)查喬木；淺山灌叢在20 m×20 m樣方中心和四角設(shè)置5個5 m×5 m樣方調(diào)查灌木；山地荒漠草地、亞高山草甸在20 m×20 m樣方中隨機設(shè)置5個1 m×1 m樣方調(diào)查草本。在每個樣方內(nèi)進行群落調(diào)查和土樣采集。采用五點采樣法，去除土壤上層覆蓋未完全腐殖化的凋落物，在樣方四角和中心點采集 0—20 cm層土樣，五點土樣混合作為該點的代表性樣品。土壤樣品帶回室內(nèi)后分成2份，一份?80 ℃冷凍保存，用于土壤微生物高通量測序，一份風(fēng)干過2 mm篩用于土壤理化性質(zhì)測定。群落調(diào)查記錄物種名稱、數(shù)量等，利用手持GPS記錄樣地的經(jīng)緯度、海拔高度等地理位置信息。樣地基本概況詳見表1。

表1 不同植被類型樣地基本概況表Table 1 Basic overview table of plots of different vegetation types

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)主要測定全氮、全磷、有機質(zhì)、pH值、土壤含水率等指標(biāo)，土壤pH值采用酸度計法測定；有機質(zhì)用重鉻酸鉀-外加熱法測定；全氮用全自動凱氏定氮儀測定（雷磁，上海）；全磷用鉬銻抗比色法測定；含水率用烘干法測定。具體測定方法及所用儀器參照《土壤農(nóng)化分析》（鮑士旦，2000）進行。

1.4 植物多樣性指數(shù)計算

植物 Margalef豐富度指數(shù)（R）和 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（W）指數(shù)參照相關(guān)方法（李聰?shù)龋?020）進行計算。

1.5 氣象和地形數(shù)據(jù)獲取方法

依據(jù)采樣點的經(jīng)緯度和海拔等數(shù)據(jù)，從全球氣象數(shù)據(jù)庫（http://worldclim.org/）獲取溫度、降雨量、太陽輻射等氣象數(shù)據(jù)；依據(jù)樣地坐標(biāo)利用Arc GIS 9.3軟件中數(shù)據(jù)高程模型（Digital Elevation Model，DEM）柵格，生成坡向、坡度等地形圖后對數(shù)據(jù)層的樣地坡向和坡度數(shù)據(jù)進行提取。

1.6 土壤真菌高通量測序流程

土壤真菌高通量測序，由百邁客生物科技有限公司（北京）完成。土壤真菌總DNA抽提，按照土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）操作步驟進行。以瓊脂糖凝膠（1%）電泳檢測DNA純度和濃度。真菌ITS1區(qū)序列擴增，引物序列為 ITS1F：（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3′）；ITS2R：（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）（Bellemain et al.，2010）。PCR 擴增所采用的物品有TransGen AP221-02快速測序的高保真DNA聚合酶和ABI GeneAmp? 9700型的PCR儀。PCR擴增體系：10×FastPfu緩沖液2 μL，dNTPs（2.5 mmol·L?1）2 μL，引物（5 μM）0.8 μL，rTaq 聚合酶0.2 μL，DNA模板10 ng和無菌水補至總體系20 μL。PCR擴增條件：98 ℃ 2 min初始變性、98 ℃15 s 條件下 25—30 個循環(huán)、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 5 min（孫倩等，2019）。使用 AxyPrepDNA（AXYGEN公司）凝膠回收試劑盒酶切目的片段并回收 PCR產(chǎn)物，純化和定量后形成測序文庫，質(zhì)檢合格后基于PacBio測序平臺進行測序。依據(jù)PCR引物序列和barcode序列區(qū)別劃分所有樣本數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過FLASH（V 1.2.11）軟件對每個樣品Reads拼接，拼接后對原始數(shù)據(jù)中殘留的引物和barcode等人工序列進行切除，經(jīng)過QIIME（1.9.1）軟件過濾處理，使用UCHIME（V 4.2）軟件去除嵌合體得到有效高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（有效序列數(shù)）（Elizabeth et al.，2009）。以相似性為 97%，使用UPARSE（7.0.1090）軟件，將序列聚類為分類操作單元（OTUs）。采用UNITE（8.0）數(shù)據(jù)庫對97%同源性的OTUs代表序列進行物種注釋分析，之后對每個樣品的所有數(shù)據(jù)做均一化處理。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

利用Excel 2010軟件對土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)進行整理和計算；用SPSS 22軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為P<0.05；采用 Mothur（1.30.2）軟件計算 α多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson、Ace、Chao1等指數(shù)）；利用R（3.6.3）軟件做土壤真菌群落 PCoA圖、門水平下真菌群落豐度堆積圖和土壤環(huán)境因子與門水平土壤真菌相關(guān)性熱圖，采用方差分解分析（Variance partitioning analysis，VPA）測量植被、海拔和環(huán)境因子對真菌群落結(jié)構(gòu)變化的相對貢獻。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被類型的土壤性質(zhì)及環(huán)境因子

不同植被類型的土壤理化性質(zhì)以及環(huán)境因子數(shù)據(jù)詳見表2。山地荒漠草地土壤 pH顯著高于其他植被類型；土壤含水率隨海拔上升顯著增加；不同植被類型土壤全氮、全磷差異不明顯；土壤有機質(zhì)在亞高山針葉林最高，在山地荒漠草地最低，且差異顯著（P<0.05）；海拔、年均降雨量、太陽輻射、年均溫在山地荒漠草地和淺山灌叢間差異不顯著；而與亞高山針葉林以及亞高山草甸之間均有差異，且隨著海拔的增高，年均降雨量逐漸升高，而太陽輻射和年均溫逐漸降低；不同植被類型間坡向差異不明顯，但是坡度隨著海拔升高逐漸增大且山地荒漠草地坡度顯著低于其他類型。植被多樣性指數(shù)由高到低表現(xiàn)為淺山灌叢最高，亞高山針葉林最低，且差異顯著。

表2 不同植被類型土壤理化性質(zhì)及環(huán)境因子Table 2 Soil physical and chemical properties and environmental factors of different vegetation types

2.2 不同植被類型的土壤真菌多樣性及群落構(gòu)成

2.2.1 土壤真菌多樣性測序

通過測序，36個樣本共檢測到有效序列256993個，經(jīng)過濾優(yōu)化后共得到高質(zhì)量序列249745個，平均序列長度606 bp，在97%的序列相似性水平下對序列條數(shù)進行聚類共檢測到 OTU 7988個，平均文庫覆蓋率 97%以上。稀釋曲線可以有效反映土壤真菌OTU數(shù)隨測序量的變化情況，由圖2可知，隨著測序數(shù)量的增大，所有樣地的有效序列數(shù)都趨于平緩且穩(wěn)定，說明測序數(shù)據(jù)量合理，本次測序結(jié)果可以準(zhǔn)確反映不同樣地不同真菌群落數(shù)目。

圖2 稀釋性曲線Figure 2 Rarefaction Curve

2.2.2 真菌多樣性分析

對不同植被類型土壤真菌 OTU數(shù)和土壤真菌α多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析（表3），結(jié)果表明OTU數(shù)和 Ace、Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)指數(shù)由高到低都表現(xiàn)為淺山灌叢>山地荒漠草地>亞高山草甸>亞高山針葉林，且亞高山針葉林顯著低于其他植被類型（P<0.05）。

表3 不同植被類型土壤真菌OTU數(shù)和α多樣性指數(shù)Table 3 Soil fungi OTU number and α-diversity index of different vegetation types

主坐標(biāo)分析（PCoA）表明（圖3），不同植被類型土壤真菌群落整體上存在差異性。淺山灌叢真菌群落分布相對擴散，說明該植被型土壤真菌群落組內(nèi)差異性較大；其他植被類型土壤真菌群落組內(nèi)相似性較高；與此同時亞高山針葉林較其他植被類型主體真菌群落分布分散，說明亞高山針葉林與其他植被類型真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，這與α多樣性指數(shù)分析結(jié)果一致。

圖3 土壤真菌群落PCoA圖Figure 3 PCoA diagram of soil fungal community

2.2.3 真菌群落組成分析

賀蘭山東坡不同植被類型土壤真菌相對豐度如圖4所示，相對豐度大于1%的真菌門為子囊菌門（Ascomycota，豐度范圍 21.2%—60.4%，均值46.7%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota，12.8%—57.2%，29.6%）、球囊菌門（Glomeromycota，0.3%—18.9%，均值11.5%）、被孢霉門（Mortierellomycota，3.1%—19.9%，9.4%）、壺菌門（Chytridiomycota，0.5%—1.4%，1%）；其中，子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌平均豐度占比達到了75.9%，是賀蘭山東坡優(yōu)勢真菌群落。子囊菌門和球囊菌門真菌在海拔植被帶豐度由高到低依次為山地荒漠草地、淺山灌叢、亞高山草甸、亞高山針葉林；擔(dān)子菌門和被孢霉門豐度由高到低依次為亞高山針葉林、亞高山草甸、淺山灌叢、山地荒漠草地；壺菌門豐度由高到低依次為亞高山草甸、亞高山針葉林、淺山灌叢、山地荒漠草地?？傮w而言，不同植被類型真菌門水平相對豐度存在差異，尤其亞高山針葉林真菌群落豐度顯著不同于其他植被類型。

圖4 不同植被類型土壤真菌群落組成堆積圖（門水平）Figure 4 The accumulation diagram of soil fungal community composition of different vegetation types(phylum level)

2.3 土壤真菌群落和多樣性與生態(tài)因子相關(guān)性分析

通過對門水平上優(yōu)勢真菌群落與植物多樣性指數(shù)、土壤理化性質(zhì)以及水熱因子進行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（圖5），大多數(shù)真菌群落在門水平上與以上因子有顯著的相關(guān)性。如擔(dān)子菌門真菌與植物豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、土壤pH極顯著負(fù)相關(guān)，與年均溫顯著負(fù)相關(guān)，與土壤含水率和海拔極顯著正相關(guān)；被孢霉門與植物豐富度和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)極顯著負(fù)相關(guān)，與年均溫顯著負(fù)相關(guān)，與土壤有機質(zhì)和海拔極顯著正相關(guān)，與年均降雨量和土壤含水率顯著正相關(guān)；子囊菌門與植物 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、pH極顯著正相關(guān)，與植物豐富度指數(shù)、太陽輻射和年均降雨量顯著正相關(guān)，與土壤有機質(zhì)和海拔極顯著負(fù)相關(guān)，與年均降雨量和土壤含水率顯著負(fù)相關(guān)；球囊菌門與植物豐富度和 Shannon-Wiener多樣性指數(shù)極顯著正相關(guān)，與年均溫顯著正相關(guān)，與土壤含水率和海拔顯著負(fù)相關(guān)。

圖5 門分類水平土壤真菌群落與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖Figure 5 Heat map of the correlation between soil fungal communities and environmental factors at the phylum classification level

在山地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤真菌受多種環(huán)境因子的影響。本研究利用方差分解分析（VPA）將所有影響因子歸為植被、海拔和環(huán)境因子三類，定量研究了各類因子對土壤真菌群落的影響（圖6）。結(jié)果表明，植被類型、環(huán)境因子、海拔分布解釋了土壤真菌群落變異的 11%、9%、6%。與此同時各因子之間協(xié)調(diào)作用，植被與環(huán)境因子共同解釋率 9%，環(huán)境與海拔共同解釋率為33%，植被與海拔共同解釋率為5%，三者協(xié)同解釋率為7%。

圖6 影響真菌群落的因子方差分解分析Figure 6 Variation partitioning result of factors affecting fungal community

通過分析海拔、植物多樣性與土壤真菌多樣性的相關(guān)關(guān)系，來確定植被及海拔對土壤真菌多樣性的影響程度（圖7）；結(jié)果表明，植物多樣性指數(shù)與真菌 Ace多樣性指數(shù)都呈極顯著正相關(guān)（P<0.001），海拔與Ace指數(shù)相關(guān)性不明顯。由此說明，賀蘭山東坡土壤真菌群落多樣性受植被的影響大于海拔。

圖7 植物多樣性、海拔與真菌多樣性之間的相關(guān)關(guān)系Figure 7 Correlation between plant diversity, altitude and fungal diversity

3 討論

3.1 土壤真菌多樣性及其群落組成

植物在生長過程中不斷的從土壤中汲取營養(yǎng)物質(zhì)和水分的同時向土壤中釋放大量的分泌物，進而影響土壤環(huán)境的變化以及土壤微生物多樣性（袁仁文等，2020）。植物種類越豐富，其分泌物和凋落物種類也就越多，土壤微生物多樣性和豐富度也就越高（Coroi et al.，2004），本研究中植物豐富度和多樣性指數(shù)高的植被類型中，真菌多樣性指數(shù)也較高。對賀蘭山東坡不同植被類型土壤真菌群落及其多樣性的分析表明，亞高山針葉林土壤真菌多樣性、豐富度指數(shù)和OTUs數(shù)都顯著低于其他植被類型?？赡苁轻樔~林植被較其他植被類型物種單一，林下伴生植物相對欠缺且凋落物以及分泌物種類少，適于微生物生存的生態(tài)幅較窄從而存活率較低有關(guān)（Zak et al.，2003）。

本研究門水平上相對豐度>1%的真菌群落共檢測到子囊菌門、擔(dān)子菌門、球囊菌門、被孢霉門和壺菌門5個門；其中子囊菌門和擔(dān)子菌門平均豐度達到75%以上，是賀蘭山東坡土壤優(yōu)勢真菌群落。這與張樹萌等（2018）和周煜杰等（2021）的研究結(jié)果較為相似。不同植被類型門水平上真菌群落組成差異不大，但是相對豐度存在一定差異，與王詩慧等（2021）對天山林區(qū)土壤真菌群落研究得出一致的結(jié)論。山地荒漠草地、淺山灌叢、亞高山草甸中子囊菌門占據(jù)優(yōu)勢地位，而在亞高山針葉林中，擔(dān)子菌門真菌是絕對的優(yōu)勢真菌群落。究其原因，可能與植被種類的不同有很大的關(guān)系（陳秀波等，2019）。亞高山針葉林中，主要植被為青海云杉純林，植被類型相對單一，而其他植被類型主要包括草本以及灌木，且植被種類相對豐富。已有研究表明，子囊菌門真菌以腐生菌居多，可分解多種難降解物質(zhì)（Beimforde et al.，2014）而擔(dān)子菌門真菌能夠降解木質(zhì)素等難以分解的物質(zhì)（Frey et al.，2004），且在木質(zhì)素含量較高是植被中占據(jù)優(yōu)勢（Bossuyt et al.，2001）。相對于灌木和草本，喬木林木質(zhì)素含量更高，所以在亞高山針葉林中擔(dān)子菌門真菌占據(jù)優(yōu)勢地位；其它植被類型中，植物種類較多，能夠產(chǎn)生多種凋落物和分泌物，更有利于子囊菌的生存。除此之外，Tedersoo et al.（2014）也認(rèn)為擔(dān)子菌門和子囊菌門真菌能夠積極響應(yīng)土壤pH值的變化，且子囊菌門在pH較高的土壤中豐度更高。本研究中，子囊菌門的豐度變化與pH值表現(xiàn)出一致性，很好的證實了這一結(jié)論。

3.2 土壤真菌多樣性及其群落組成的影響因素

森林生態(tài)系統(tǒng)中，植被類型和海拔是影響土壤真菌多樣性的兩大因素。真菌多樣性與植物多樣性和海拔的Pearson相關(guān)性表明（圖7）真菌多樣性與植物多樣性顯著正相關(guān)，與喬沙沙等（2017）對關(guān)帝山土壤真菌群落研究結(jié)果一致；說明不管是生物量較小草本植物還是生物量相對較大的木本植物，都可能因為物種的不同而提供不同質(zhì)量的根際環(huán)境、凋落物和分泌物而產(chǎn)生互補的地下生態(tài)位，從而可以支持各種真菌有更大的多樣性（Yang et al.，2017）。而真菌多樣性與海拔沒有表現(xiàn)出規(guī)律性，說明賀蘭山東坡植被類型較海拔對土壤真菌多樣性的影響更大。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，在不同區(qū)域、不同的森林土壤生態(tài)系統(tǒng)中影響土壤真菌群落組成的因素各有異同。例如羅正明等（2020）研究表明土壤 pH、植物豐富度和總碳含量是影響五臺山土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素；盛玉鈺等（2018）研究表明土壤pH、植物多樣性、土壤濕度和土壤溫度可能是影響神農(nóng)架土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素；周煜杰等（2021）研究表明土壤有效磷含量、pH和海拔是影響秦嶺火地塘土壤真菌群落的主要驅(qū)動因子。本研究結(jié)果表明，植物多樣性、pH、年均溫、土壤有機質(zhì)、年均降雨量、土壤含水率及海拔都可能會影響到真菌群落組成。雖然以上結(jié)果各有異同，但其影響因素都離不開植被、氣候、土壤、環(huán)境因子等，以上因子已然成為影響土壤真菌群落組成的最佳預(yù)測因子。