刁新峰，李新茂，候 亮，魏志玄

1.南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院神經外科，河南 南陽 473000；2.武安市第一人民醫(yī)院神經外科，河北 武安 056300

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是常見的原發(fā)性腦腫瘤之一，占腦部腫瘤的80%以上［1］。盡管可采用手術和放化療等多模式綜合治療，但GBM患者的預后仍然較差［2］。GBM形成和發(fā)展過程中的復雜分子變化使得識別參與GBM病理生理學過程的關鍵靶點具有重要意義。

表觀遺傳修飾與腫瘤發(fā)展密切相關，RNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是一種可逆的動態(tài)表觀遺傳學改變［3］。據研究［4］報道，YTHDF2作為m6A修飾過程的重要識別蛋白，能夠對結合m6A修飾的RNA進行識別，進而促進RNA降解，如YTHDF2通過識別m6A甲基化調節(jié)的OCT4基因進而影響OCT4的mRNA表達，促進肝細胞癌轉移。YTHDF2可能通過靶向不同基因的mRNA轉錄物對不同的癌癥發(fā)揮作用，而YTHDF2及其新靶點在GBM發(fā)展中的作用仍需要進一步闡明。胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）能夠參與細胞生長，并受一組IGF結合蛋白及其受體調控，IGF結合蛋白7（IGF binding protein 7，IGFBP7）是一種分泌性蛋白，可作為IGF依賴和非依賴的細胞生長調節(jié)劑進而發(fā)揮作用［5］。IGFBP7被發(fā)現(xiàn)在GBM中表達顯著降低，具有腫瘤抑制特性［6］。然而，IGFBP7在GBM中的分子機制尚未完全明確。本研究旨在探討YTHDF2是否通過影響m6A修飾的方式調節(jié)IGFBP7的mRNA穩(wěn)定性，明確YTHDF2在GBM進展中的重要作用及其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

人GBM細胞系（LN229和U251細胞）和正常星形膠質細胞系（NHA細胞）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司。100 μg/mL鏈霉素-100 U/mL青霉素混合溶液購自蘇州新賽美生物科技有限公司。LipofectamineTM3000試劑購自賽因百奧生物技術（北京）有限公司。RIPA裂解緩沖液購自上海尚寶生物科技有限公司。放線菌素D和二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒購自上海聯(lián)祖生物科技有限公司。YTHDF1、IGFBP1、p-磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、PI3K、p-蛋白激酶B（protein kinase，AKT）、AKT、β-actin、m6A、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和HRP結合的二級抗體均購自英國Abcam公司。超敏型電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）底物試劑盒購自上海炎熙生物科技有限公司。TRIzol試劑購自上海博湖生物科技有限公司。反轉錄試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。YTHDF2、IGFBP7和GAPDH的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物均購自德國Qiagen公司。SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自北京索萊寶科技有限公司。PolyATtract?mRNA純化系統(tǒng)購自上海前塵生物科技有限公司。RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）試劑盒購自廣州伯信生物科技有限公司。MeRIP試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司。碘化丙啶（propidium iodide，PI）和Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司。流式細胞儀購自北京盛科信德科技有限公司。

1.2 生物信息學分析

GEPIA網站（http://gepia.cancer-pku.cn）用于預測基因在GBM中的表達水平及相關性分析。GSCA網站（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/）用于預測基因在GBM中可能參與的生物學過程。CGGA數據庫（http://www.cgga.org.cn）用于預測YTHDF2的表達水平與GBM患者臨床特征的相關性。從UALCAN網站（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）獲取與YTHDF2在GBM具有負相關性的基因。從StarBase網站（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）獲取可與YTHDF2結合的mRNA。通過RMVAR數據庫（http://rmvar.renlab.org/index.html）預測IGFBP7的m6A修飾位點及識別蛋白。LinkedOmics網站（http://www.linkedomics.org/admin.php）用于預測YTHDF2與PTEN在GBM中表達的相關性。

1.3 樣本采集

從2020年3月—2021年3月于南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院確診為GBM的患者中收集40對腫瘤組織及匹配的癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣≥2 cm）。所有患者術前均未接受放療或化療等治療。手術結束后，立即將組織冷凍在液氮中，于-80 ℃保存。本研究得到南陽醫(yī)學高等專科學校第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準。所有患者在研究開始前均簽署書面知情同意書。

1.4 細胞培養(yǎng)

LN229、U251和NHA細胞均保存在DMEM培養(yǎng)基中，添加10%FBS和100 μg/mL鏈霉素-100 U/mL青霉素混合溶液，細胞培養(yǎng)在37 ℃、CO2體積分數為5%的加濕培養(yǎng)箱中。

1.5 細胞轉染

構建并合成靶向YTHDF2的小干擾RNA（si-YTHDF2）、siRNA陰性對照（si-NC）、IGFBP7 shRNA（shIGFBP7）和shRNA陰性對照（shRNA）。將U251細胞接種在96孔板中，待細胞融合至80%，將上述siRNA或shRNA通過LipofectamineTM3000試劑轉染至U251細胞中，轉染48 h后，通過實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）檢測目的基因的表達水平。

1.6 細胞周期檢測

采用流式細胞術檢測細胞周期分布。將轉染后的細胞懸浮在含有10%FBS的磷酸緩沖鹽溶（phosphate-buffered saline，PBS）中，在室溫下將細胞固定在無水乙醇中24 h。在室溫下以3 000×g離心30 s，棄上清液。將細胞懸浮在100 μL RNase A溶液（1 mg/mL）中，在37 ℃下消化10 min。在黑暗中使用400μL PI（50 μg/mL）在室溫下對細胞染色10 min，采用流式細胞術分析G0/G1、S和G2/M期細胞的比例。

1.7 細胞凋亡檢測

使用Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率變化。將轉染后的U251細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后在室溫下以1000×g離心5 min。棄上清液，將細胞重新懸浮在200 μL結合緩沖液中。用10 μL膜聯(lián)蛋白Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI對細胞進行染色，在4 ℃避光條件下培養(yǎng)30 min。采用流式細胞術檢測細胞凋亡，并使用CXP2.1軟件進行分析。通過早期和晚期凋亡細胞的百分比計算凋亡率。

1.8 蛋白質印跡法（Western blot）

使用RIPA裂解緩沖液從組織和細胞中分離總蛋白，使用BCA法對蛋白濃度進行定量。50 μg蛋白質裂解物經8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉 在室溫下封閉1h。將蛋白條帶與YTHDF1（1∶1000）、IGFBP1（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、AKT（1∶1000）和β-actin（1∶1000）抗體在4 ℃下溫育過夜。棄一抗，加入含吐溫-20磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffed saline with Tween-20，PBST）洗滌3次。在室溫下與HRP結合的二級抗體（1∶2000）溫育2 h。通過超敏型ECL底物試劑盒顯色，使用Image Lab軟件進行定量分析。

1.9 RIP實驗

使用RIP試劑盒進行RIP分析。IP裂解緩沖液用于裂解U251細胞。細胞裂解物與涂有5 μg特異性抗體（YTHDF2抗體或IgG抗體）的磁珠在4 ℃下溫育過夜。洗滌后，裂解物用蛋白酶K消化，純化與免疫沉淀蛋白質結合的RNA。使用RTFQPCR測定IGFBP7的mRNA表達水平。

1.10 mRNA穩(wěn)定性檢測

將轉染si-NC或si-YTHDF2的U251細胞接種于6孔板中，用放線菌素D（5 μg/mL）處理細胞0、3或6 h。通過RTFQ-PCR測定IGFBP7的mRNA表達水平。

1.11 RTFQ-PCR

使用TRIzol試劑從GBM組織和細胞中提取總RNA。使用反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix進行RTFQ-PCR。以GAPDH作為內參。相對表達水平使用2－ΔΔCt法進行計算。本實驗中使用的PCR引物序列如下：YTHDF2的上游引物序列為5′-CATGAATGGGAAGGGTCCCG-3′，下游引物序列為5′-GACGAATGTGTCGCAGT TGG-3′；IGFBP7的上游引物序列為5′-TGG AACAAGGTAAAAAGGGGT-3′，下游引物序列為5′-TGGTATTTCATGTAAGGCATAC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CGCTCTGCTCC TGTTTC-3′，下游引物序列為5′-ATCCGTT GATCCGACCTTCAC-3′。

1.12 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行分析。采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗比較兩組之間的差異。方差分析或Kruuskal-Wallis檢驗用于多組間的比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 YTHDF2在GBM組織和細胞中高表達

利用GEPIA數據庫評估正常和GBM樣本中m6A識別蛋白（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2）的表達水平。發(fā)現(xiàn)與正常大腦組織樣本相比，GBM組織樣本中的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3表達較高（圖1A）。在GSCA網站對YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2在GBM進展中參與的生物學過程進行預測，結果顯示，僅YTHDF2在GBM中參與多個生物學過程（圖1B）。此外，在CGGA數據庫中預測得到YTHDF2的表達與GBM患者的組織學分級（P=9.8×10-38）、世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級（P＝1.8×10-24）和IDH突變（P＝2×10-10）顯著相關（圖1C）。RTFQ-PCR和Western blot顯示，與正常組相比，GBM組織中的YTHDF2表達水平顯著升高（圖1D、1E，P＜0.05），與NHA細胞相比，LN229和U251細胞中的YTHDF2也呈高表達（P均＜0.05，圖1F）。由于YTHDF2在U251細胞中的表達最為顯著，因此選用U251細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 YTHDF2在GBM組織和細胞中表達上調Fig.1 The expression of YTHDF2 is up-regulated in GBM tissue and cells

2.2 敲減YTHDF2可誘導GBM細胞周期阻滯和細胞凋亡

為探究YTHDF2在GBM細胞中的作用，用si-YTHDF2和si-NC轉染U251細胞。與si-NC組相比，si-YTHDF2組的YTHDF2表達降低（P＜0.05，圖2A）。采用流式細胞術檢測U251細胞的細胞周期，si-YTHDF2組較si-NC組的G0/G1期細胞比例顯著增加，S期減少（P＜0.05，圖2B、2C）。細胞凋亡實驗顯示，與si-NC組相比，si-YTHDF2組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05，圖2D、2E），

圖2 敲減YTHDF2可誘導GBM細胞周期阻滯和細胞凋亡Fig.2 Knockdown of YTHDF2 can induce GBM cell cycle arrest and apoptosis

2.3 YTHDF2能夠識別m6A修飾的IGFBP7進而促進其降解

為探究YTHDF2的下游靶點，將StarBase網站獲取的可與YTHDF2結合的mRNA與UALCAN網站獲取的與YTHDF2在GBM具有負相關性的基因取交集（圖3A），結果為CYBA、TMEM223、RNASEK、IGFBP7、ATP6V0E1和PNKD，將IGFBP7納入本研究。RTFQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，IGFBP7在GBM組織和細胞系中的表達均低于癌旁組織和NHA細胞（P均＜0.05，圖3B、3C）。在RMVAR數據庫預測得到IGFBP7上存在多個m6A修飾位點，其中YTHDF2可作為RBP識別IGFBP7的m6A修飾位點（圖3D）。RIP分析證實了U251細胞中YTHDF2和IGFBP7 mRNA之間的相互作用（P＜0.05，圖3E）。此外，敲減YTHDF2可增加U251細胞中IGFBP7的mRNA表達和蛋白水平（P均＜0.05，圖3F～3H）。對U251細胞進行mRNA穩(wěn)定性分析，與si-NC組細胞相比，si-YTHDF2組細胞中IGFBP7的中位半衰期顯著延長（P＜0.05，圖3I）。

圖3 YTHDF2識別m6A修飾的IGFBP7進而促進IGFBP7降解Fig.3 YTHDF2 promotes the degradation of IGFBP7 via recognizing m6A modified IGFBP7

2.4 下調IGFBP7可部分地挽救敲減YTHDF2對GBM細胞周期分布和凋亡的調控作用

進一步研究YTHDF2調控IGFBP7在GBM細胞活性中的潛在作用。首先采用RTFQ-PCR確認IGFBP7在si-YTHDF2+shIGFBP7組細胞中的表達較si-YTHDF2+shNC組降低（P＜0.05，圖4A）。細胞周期檢測結果顯示，與si-YTHDF2+shNC組相比，si-YTHDF2+shIGFBP7組細胞在G0/G1期比例減少。在細胞分裂的S和G2/M期，si-YTHDF2+shIGFBP7組細胞增加（P＜0.05，圖4B、4C）。流式細胞術測定數據顯示，與轉染shNC的細胞相比，細胞凋亡率在轉染shIGFBP7后明顯降低（P＜0.05，圖4D、4E）。上述結果表明，抑制IGFBP7可部分地挽救敲減YTHDF2誘導的GBM細胞周期阻滯和凋亡增加。

圖4 下調IGFBP7可部分挽救敲減YTHDF2對GBM細胞周期分布和凋亡的調控作用Fig.4 Downregulation of IGFBP7 could partially rescue the regulatory effects of YTHDF2 knockdown on GBM cell cycle distribution and apoptosis

2.5 YTHDF2通過抑制IGFBP7誘導PI3K/AKT活化

由圖1B得知，YTHDF2可能通過激活PI3K/AKT信號轉導通路促進GBM的發(fā)生。在GEPIA和LinkedOmics網站得到IGFBP7與PI3K/AKT信號轉導通路中的關鍵基因PIK3CA在GBM中顯著負相關，而與PI3K/AKT信號轉導通路負調節(jié)因子PTEN正相關（圖5A、5B）。在U251細胞中用Western blot檢測p-AKT、AKT、p-PI3K和PI3K蛋白水平，結果顯示，過表達IGFBP7可降低p-AKT和p-PI3K的蛋白水平，抑制IGFBP7則相反（P均＜0.05）。進一步分析YTHDF2和IGFBP7是否能調控PI3K/AKT信號轉導通路，結果表明，p-AKT和p-PI3K的蛋白水平因敲減YTHDF2而顯著降低，因抑制IGFBP7而部分恢復（P均＜0.05，圖5E、5F）。上述數據表明，PI3K/AKT信號轉導通路可能由YTHDF2通過IGFBP7進行調節(jié)。

3 討 論

RNA的m6A修飾是研究GBM的一個新興領域［7］。先前研究［8］表明，m6A“寫入器”、“擦除器”和“識別器”的表達與GBM的惡性進展和預后高度相關。本研究中，作為m6A“識別器”的YTHDF2在GBM組織和細胞中表達升高。敲減YTHDF2基因能夠通過提高IGFBP7的mRNA表達，抑制PI3K/AKT信號轉導通路，誘導GBM細胞周期阻滯和凋亡率升高。

據研究［9］報道，YTHDF2對GBM細胞增殖、侵襲和腫瘤的發(fā)生具有促進作用。YTHDF2通過誘導細胞質中的靶mRNA穩(wěn)定性降低來執(zhí)行其功能，如YTHDF2介導腫瘤抑制因子的mRNA降解，促進前列腺癌的惡性進展［10］。YTHDF2下調IRS1的mRNA水平在子宮內膜癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用［11］。本研究借助一系列生物信息學預測網站發(fā)現(xiàn)YTHDF2在GBM中表達升高，并通過RTFQ-PCR和Western blot得以證實。通過CSCA網站預測YTHDF2可能參與調控GBM細胞周期進展和凋亡過程，本研究的實驗數據顯示，敲減YTHDF2在GBM細胞中的表達可有效地抑制GBM細胞的周期分布，增加細胞凋亡，提示YTHDF2可作為GBM中的有效治療靶點。

借助StarBase和UALCAN網站獲取YTHDF2可特異性結合的mRNA和與YTHDF2在GBM中具有負相關性的基因，篩選得到IGFBP7。IGFBP7先前被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中充當腫瘤抑制因子發(fā)揮作用［12-14］。研究［15］表明，IGFBP7在GBM中的低表達與患者預后不良顯著相關。IGFBP7在GBM組織和細胞系中的低表達水平通過RTFQPCR得到證實。在RMVAR數據庫預測得到YTHDF2可識別IGFBP7的m6A修飾位點，本實驗通過RIP分析證實YTHDF2可特異性地結合GBM細胞中的IGFBP7，敲減YTHDF2可有效地提高IGFBP7的mRNA穩(wěn)定性。功能性實驗數據顯示，敲減YTHDF2對GBM細胞周期分布的抑制和凋亡的促進可通過敲減IGFBP7實現(xiàn)部分消除，表明YTHDF2通過抑制IGFBP7的表達在GBM中發(fā)揮促癌作用。此外，CSCA網站還顯示，YTHDF2可能通過調節(jié)PI3K/AKT信號轉導通路參與GBM進程。既往研究［16］表明，m6A水平的降低激活致癌的PI3K/AKT信號轉導通路促進胃癌細胞的惡性表型。抑制PI3K/AKT信號轉導通路的激活可抑制GBM細胞增殖和耐藥性增加［17］。本研究采用Western blot檢測證實，敲減YTHDF2可降低p-PI3K和p-AKT的蛋白水平。IGFBP7先前被報道可抑制PI3K/AKT信號轉導通路的激活進而抑制乳腺癌細胞的生長［18］。IGFBP7抑制甲狀腺癌中的AKT活性來抑制癌細胞增殖［19］。此外，GEPIA和LinkedOmics數據庫顯示，IGFBP7與PI3K/AKT信號轉導通路中的關鍵基因PIK3CA在GBM中顯著負相關，而與PI3K/AKT信號轉導通路負調節(jié)因子PTEN呈正相關［20］。Western blot檢測結果顯示，過表達IGFBP7可降低p-PI3K和p-AKT蛋白水平，敲減IGFBP7則相反。此外，下調IGFBP7可部分地挽救因敲減YTHDF2降低的p-PI3K和p-AKT蛋白水平，提示YTHDF2可能通過抑制IGFBP7激活PI3K/AKT信號轉導通路參與調節(jié)GBM進展。

本實驗的局限性在于未對YTHDF2在GBM中的作用展開體內實驗的驗證。此外，下游信號轉導通路的作用也有待進一步探索。本研究證實，敲減YTHDF2可通過識別m6A修飾的IGFBP7，降低其mRNA的穩(wěn)定性，阻斷PI3K/AKT信號轉導通路的激活，抑制GBM細胞周期分布，誘導細胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)初步闡明了m6A“識別器”調控GBM腫瘤發(fā)生的潛在機制，有望為GBM的有效治療提供新的思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。中國癌癥雜志,2020,30(5):328-334.