徐建男

江蘇省蘇州市吳中區(qū)疾病預防控制中心檢驗科,江蘇蘇州 215128

2020年2月11日，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了關(guān)于修訂新型冠狀病毒肺炎英文命名事宜的通知，決定將“新型冠狀病毒肺炎”英文名稱修訂為“COVID-19”，同時，國際病毒分類委員會聲明將新型冠狀病毒命名為“SARS-CoV-2”。目前，國家衛(wèi)生健康委員會推薦的病原學檢查方法是實時熒光定量PCR(RT-PCR)和新一代測序(NGS)方法，由于NGS方法存在價格昂貴、人員要求高等局限性，基層醫(yī)療機構(gòu)和疾病預防控制機構(gòu)仍然是以RT-PCR檢測為主[1-2]。中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》指出，需將待測標本56 ℃ 孵育至少45 min或更高溫度進行滅活[3]。LECLERCQ等[4]對中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-Cov)的研究表明其在56 ℃ 孵育25 min，病毒滴度會降低10-4，進一步升高溫度到65 ℃處理15 min沒有任何殘留。RABENAU等[5]也發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒(SARS-CoV)在56 ℃孵育30 min后，滴度低于檢測限，溫度升高到60 ℃ 30 min，SARS-CoV完全被滅活。物體上攜帶的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)也可以傳染給人類，所以各級檢測機構(gòu)開展了對物體表面攜帶SARS-CoV-2的檢測。為了明確SARS-CoV-2滅活后是否對核酸檢測有影響，本研究將對滅活前和不同滅活處理方式(56 ℃ 45 min、60 ℃ 30 min、75%乙醇30 min處理)滅活后平均循環(huán)閾值(Ct值)進行比較分析。

1 材料與方法

1.1標本來源 選擇區(qū)級檢測機構(gòu)送檢的物體表面標本25份，經(jīng)過RT-PCR檢測結(jié)果均為陽性，其中14份(標本號1～14)標本為蘇州市相城區(qū)疾病預防控制中心篩選送檢的陽性標本，11份(標本號15～25)標本為蘇州市工業(yè)園區(qū)疾病預防控制中心篩選送檢的陽性標本。

1.2標本處理及滅活 每份標本平均分成4份，采用DMEM培養(yǎng)液(Gibco 公司，貨號：12430-054)分別進行4種不同的處理方式：(1)未滅活組，100 μL標本+300 μL DMEM 4～8 ℃，30 min；(2)滅活組，①100 μL標本+300 μL DMEM 60 ℃，30 min；②100 μL標本+300 μL DMEM 56 ℃，45 min；③100 μL標本+300 μL 無水乙醇，形成終濃度75%的環(huán)境，4～8 ℃，30 min。

1.3核酸提取及RT-PCR檢測 采用Roche MagNA Pure 96 system全自動核酸提取儀配套的MagNa Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit 提取病毒核酸，采用達安生物科技有限公司的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(國械注準20203400063)，按試劑盒說明書在羅氏LightCycler 480Ⅱ PCR儀進行擴增，同時檢測ORF和N基因，陽性判讀標準參考試劑說明書。所有標本重復檢測3次，記錄Ct值。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，未滅活組和不同滅活組間標本的Ct值采用Mauchly球形度檢驗和Greenhouse-Geisser 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1未滅活組與滅活組標本Ct值比較 不同處理方式下ORF基因 和N基因的Ct值分布，見表1。未滅活組和滅活組Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(ORF基因：F=48.740，Eta=0.720，P<0.05；N基因：F=65.597，Eta=0.781，P<0.05)；滅活組60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(ORF基因：P=0.306；N基因：P=0.920)，60 ℃水浴30 min與75%乙醇30 min Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(ORF基因：P<0.05；N基因：P<0.05)，56 ℃水浴45 min與75%乙醇30 min Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(ORF基因：P<0.05；N基因：P<0.05)。

表1 未滅活組與滅活組ORF基因和N基因平均Ct值比較

續(xù)表1 未滅活組與滅活組ORF基因和N基因平均Ct值比較

2.2未滅活組和滅活組ORF基因和N基因Ct值區(qū)間變化 從圖1 和圖2中可以看出當未滅活組ORF基因Ct值為22～26時，未滅活組和滅活組Ct值比較接近，兩組ORF基因、N基因Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；隨著未滅活組ORF基因Ct值的增大，未滅活組和滅活組Ct值差異逐漸加大，當未滅活組ORF基因Ct值>36時，滅活組不同處理方式下ORF基因的全部Ct值>40；而未滅活組ORF基因Ct值≥34時，75%乙醇30 min處理ORF基因Ct值>40。

圖1 未滅活組和滅活組ORF基因Ct值的區(qū)間變化

圖2 未滅活組和滅活組N基因Ct值的區(qū)間變化

3 討 論

新型冠狀病毒肺炎作為突發(fā)公共衛(wèi)生事件，其傳播速度快，感染性強，給全人類帶來了嚴重的健康威脅和經(jīng)濟負擔。核酸檢測作為目前確診新型冠狀病毒肺炎最主要的方法，靈敏度高，特異性強，在疾病早期快速診斷和動態(tài)觀察抗病毒治療效果中具有優(yōu)勢[6]。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒，與蝙蝠 SARS 樣冠狀病毒同源性超過85%，具有高度的傳染性[7]?！缎滦凸跔畈《痉窝讓嶒炇覚z測技術(shù)指南(第四版)》中指出SARS-CoV-2對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒[8]。

在實驗室檢測中如何能降低實驗風險，這對全國范圍內(nèi)各級醫(yī)療機構(gòu)開展核酸檢測有著非常重要的作用，目前可采用前處理滅活病毒方式降低實驗人員感染的風險。本研究發(fā)現(xiàn)，未滅活組和滅活組Ct值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在未滅活組ORF基因Ct值為22～26時，未滅活處理和各滅活組ORF基因、N基因Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與陳培松等[9]研究結(jié)果一致。隨著未滅活組ORF基因Ct值增加，滅活組ORF基因Ct值相應(yīng)也會增大，但是當未滅活組ORF基因Ct值>36時，滅活組ORF基因Ct值增加更大，Ct值會超過40，依據(jù)試劑盒說明書要求Ct值>40判為陰性，由此會出現(xiàn)漏檢的可能。在滅活組中60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min Ct值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，兩種滅活方式相差不大，而75%乙醇30 min相比60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min處理，Ct值增加更多，當未滅活處理Ct值≥34時，75%乙醇30 min處理就有可能會超過40，從而判為陰性。本研究中12份標本(標本號1、6、8、9、11、14、15、18、19、20、23、24)未滅活時ORF基因Ct值≥34，標本14、15、23和24號如果選擇滅活處理就非常有可能判為陰性，造成漏篩。本研究發(fā)現(xiàn)滅活處理確實會造成RNA降解，特別是當標本攜帶病毒水平比較低時，滅活處理對檢測結(jié)果影響較大，有可能造成漏檢，這也與段秀枝等[10]研究結(jié)果一致。

由此可見，物體表面攜帶SARS-CoV-2的標本在核酸檢測前進行滅活處理，核酸檢測陽性結(jié)果有可能轉(zhuǎn)陰，采用75%乙醇30 min處理相比60 ℃水浴30 min和56 ℃水浴45 min處理轉(zhuǎn)陰的概率更大。因此，在保障生物安全的前提下，是否進行標本滅活處理，各實驗室需慎重選擇，避免出現(xiàn)漏檢。

本研究分析了采用不同滅活方式對物體表面SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果的影響，這是目前實驗室檢測過程中遇到的現(xiàn)實問題，市一級疾病預防控制中心為了確保后續(xù)研究和滿足陽性標本的復核需要，一般不進行滅活檢測，但是目前開展檢測的醫(yī)療機構(gòu)都對擬檢測標本進行了滅活，而且滅活的條件還不盡相同，遇到核酸滴度很低的標本時極易漏檢，而這種漏檢在特殊情況下有較大傳播風險，尤其是在大面積篩查時應(yīng)注意這種風險。另外，由于滅活會升高臨床檢測標本的Ct值，而這在實際檢測中會導致該類滅活標本(臨界標本)結(jié)果不易判讀，結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)單靶標陽性，復核也不易得到準確結(jié)果，造成漏檢或誤判。因此，在高度懷疑標本為陽性標本時不建議事先進行滅活處理，可以在做好個人防護的情況下利用提取核酸的過程完成滅活，這樣能盡量避免漏檢。

本研究中的實驗室數(shù)據(jù)還比較粗糙，樣本量較小，還不能很好地推廣結(jié)論。因此，建議擴大樣本量，并使用其他高靈敏度的方法或抗原抗體方法來驗證是否漏檢，以進行更可靠的評價。