魯 薇，楊秀蓉，譚 焱，吳強(qiáng)盛，劉春艷

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院/長(zhǎng)江大學(xué)根系生物學(xué)研究所，湖北荊州，434025)

在自然栽培下，葡萄的生長(zhǎng)對(duì)水分要求較高，嚴(yán)格控制土壤中的水分是葡萄種植的重要前提。干旱是地球上最嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一，通常被認(rèn)為是限制植物生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量的最主要的非生物因素之一[1]。我國(guó)葡萄的重要產(chǎn)區(qū)多位于干旱、半干旱區(qū)域，這些地區(qū)自然條件較惡劣，干旱少雨，土壤水分虧缺，嚴(yán)重影響葡萄的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，限制了葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一類能與約80%以上的高等植物形成互惠共生體的真菌[3]，廣泛存在于自然界中。AMF可通過(guò)改善園藝植物根際微環(huán)境，通過(guò)根外菌絲擴(kuò)大根系吸收范圍，分泌球囊霉素等物質(zhì)改善土壤團(tuán)聚結(jié)構(gòu)等，從而促進(jìn)宿主植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而改善植物的生理生化特性，調(diào)控其生長(zhǎng)[3]。前期研究表明，接種AMF 能顯著促進(jìn)茶樹(shù)生長(zhǎng)以及根系對(duì)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)的吸收，尤其是磷、鈣、鎂等元素[4]；還能顯著提高菊花根、葉和花被中氮、磷、鉀含量[5]。柑桔接種AMF后，不僅能顯著促進(jìn)其地上部生長(zhǎng)發(fā)育(如株高、莖粗和生物量)，還能顯著促進(jìn)其根系發(fā)育以及各組織碳水化合物的積累[3]。在鹽脅迫下，AMF可以改善宿主植物的根系形態(tài)、促進(jìn)側(cè)根發(fā)育，進(jìn)而提高宿主植物對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的獲取和水分的利用，從而提高宿主植物耐鹽性，改善其生長(zhǎng)[6]。此外，前人的研究還表明，AMF對(duì)于田間栽培的葡萄正常生長(zhǎng)和成活至關(guān)重要，且葡萄幼樹(shù)的成活率與其根系A(chǔ)M的建立密切相關(guān)[7]。AMF侵染葡萄根系后，還能通過(guò)增強(qiáng)葡萄根系菌絲酶的活性，促進(jìn)其根系對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的分解和吸收[8]。

雖然關(guān)于AMF調(diào)控葡萄生長(zhǎng)的一系列研究早已開(kāi)展，但是對(duì)于干旱脅迫下AMF對(duì)南方地區(qū)葡萄生長(zhǎng)及抗性方面的研究甚少，相關(guān)機(jī)理了解不夠。鑒于此，本試驗(yàn)以夏黑葡萄扦插苗為試材，在正常水分(well-watered，WW)和干旱脅迫(drought stress，DS)條件下，研究AMF對(duì)葡萄扦插苗生長(zhǎng)、根系構(gòu)建及養(yǎng)分吸收的影響，探尋AMF對(duì)葡萄生長(zhǎng)及養(yǎng)分吸收的影響機(jī)理，為葡萄優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供理論依據(jù)及實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以1年生夏黑葡萄(VitisviniferaL.Summer black)枝條(直徑約1 cm)為試材，由湖北省荊州市金秋緣農(nóng)業(yè)高新技術(shù)有限公司提供。夏黑枝條于試驗(yàn)前1年的11月采集，砂藏保存，次年3月取出，去除癟芽及發(fā)育不良的部分，將枝條剪成帶有3個(gè)飽滿芽的枝段，用于扦插。供試AMF為摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)，購(gòu)自中國(guó)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)(BGC)，經(jīng)白三葉(TrifoliumrepenseL.)擴(kuò)繁16周后用于本試驗(yàn)。夏黑葡萄扦插于預(yù)先經(jīng)過(guò)高壓蒸汽(121 ℃，110 kPa，2 h)滅菌的栽培基質(zhì)(河砂與土的比例為1∶1)中。用于試驗(yàn)的塑料盆規(guī)格為：內(nèi)徑×盆底內(nèi)徑×盆高=15 cm×10 cm×13 cm，每盆扦插1枝。扦插后的花盆放置在溫度為28 ℃/16 ℃(白天/黑夜)、光子通量密度為338～982 μmol·m-2·s-1、空氣相對(duì)濕度為70%的塑料大棚中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用兩因素兩水平裂區(qū)設(shè)計(jì)。因素一為水分處理，試驗(yàn)設(shè)置DS(田間最大持水量的55%)和WW(田間最大持水量的75%)兩個(gè)水分梯度；因素二為AMF接種，即在每個(gè)水分梯度下分別設(shè)置接種摩西管柄囊霉(Fm)和不接種(CK)處理。Fm處理采用“分層接種”法(即分別在盆土1/2和1/3高度處加入AMF菌種)，每盆接種80 g AMF菌劑(內(nèi)含約1 500個(gè)孢子)。加入相同質(zhì)量、經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的AMF菌劑作為對(duì)照。試驗(yàn)共4個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)6次，共24盆，隨機(jī)排列。

DS處理于AMF接種8周后進(jìn)行，每天18：00通過(guò)稱質(zhì)量法計(jì)算基質(zhì)中的水分含量，并補(bǔ)充相應(yīng)水分，維持穩(wěn)定的含水量。水分處理4周后收獲植株，測(cè)定葡萄生長(zhǎng)指標(biāo)及礦質(zhì)元素含量。

1.3 測(cè)定方法

在葡萄苗收獲前，人工計(jì)數(shù)扦插葡萄苗葉片數(shù)量、抽梢數(shù)量，采用直尺測(cè)定扦插葡萄苗枝梢長(zhǎng)度，游標(biāo)卡尺測(cè)定枝條粗度。隨后將葡萄苗從試驗(yàn)盆中完整取出，分成地上部和地下部。小心地將地下部清洗干凈，吸干表面水分，立即稱取地上部和地下部的鮮質(zhì)量，然后利用EPSON平板掃描儀掃描完整的根系，獲得的根系圖片采用WinRHIZO根系分析儀測(cè)定根系形態(tài)參數(shù)，包括長(zhǎng)度、投影面積、表面積、體積和平均直徑。然后，將根系平鋪在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，人工計(jì)數(shù)不定根數(shù)量，參考周冀衡等[9]的方法，將不定根上長(zhǎng)出來(lái)的一級(jí)根系定義為一級(jí)不定根，以此類推。

隨機(jī)選取各級(jí)側(cè)根，去掉根尖，剪成1～2 cm長(zhǎng)的根段置于FAA固定液中，經(jīng)曲利苯藍(lán)染色后測(cè)定菌根侵染率[10]。葡萄葉片和根系經(jīng)105 ℃殺青 30 min 后，于75 ℃下烘48 h，磨碎后備用。不同處理下的葡萄根系和葉片采用硫酸-雙氧水消煮后，經(jīng)化學(xué)分析儀(Smart Chem 200)測(cè)定其氮(N)含量。葡萄植物體內(nèi)磷(P)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、銅(Cu)、錳(Mn)、鋅(Zn)、硼(B)等礦質(zhì)元素的含量經(jīng)硝酸-高氯酸消煮后，采用離子發(fā)射光譜儀(IRIS Advantage)測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SAS軟件(8.1版本)ANOVA過(guò)程進(jìn)行處理間差異顯著性檢測(cè)，采用LSD法(p=0.05)做多重比較分析。

2 結(jié)果分析

2.1 對(duì)葡萄扦插苗生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果看出，摩西管柄囊霉能夠侵染夏黑扦插苗根系，并在根系中可以清楚地觀察到泡囊、叢枝、菌絲等結(jié)構(gòu)，表明AMF與葡萄根系可建立良好的共生關(guān)系(見(jiàn)圖1)。然而，與WW相比，DS顯著抑制了AMF對(duì)葡萄扦插苗根系的侵染，降低了葡萄根系的菌根侵染率，降低了12.48%(見(jiàn)表1)。

圖1 正常水分(WW，A)和干旱脅迫(DS，B)下夏黑葡萄扦插苗根系菌根侵染情況

DS顯著降低了菌根化夏黑葡萄枝梢的長(zhǎng)度、葉片和根系生物量以及非菌根化葉片和根系的生物量。與不接種AMF相比，接種AMF后，葡萄扦插苗枝梢長(zhǎng)度、枝梢粗度和葉片數(shù)在DS條件下分別增加25.32%、12.57%和21.21%；在WW條件下分別增加61.68%、16.71%和16.00%。此外，在DS和WW條件下，菌根化處理后葡萄葉片和根系的生物量是非菌根化處理的3.22、3.67、2.04和2.43倍(見(jiàn)表1)。

表1 干旱脅迫下AMF對(duì)夏黑葡萄扦插苗生長(zhǎng)的影響

2.2 對(duì)葡萄扦插苗不定根發(fā)生的影響

DS顯著降低了非菌根化下二級(jí)和三級(jí)不定根數(shù)量以及菌根化下葡萄扦插苗的各級(jí)不定根數(shù)量(p<0.05)。與不接種AMF相比，接種AMF顯著促進(jìn)了葡萄扦插苗生根，葡萄扦插苗的不定根、一級(jí)不定根、二級(jí)不定根、三級(jí)不定根在DS條件下分別增加65.85%、15.82%、27.99%和166.67%，在WW條件下分別增加100%、60.08%、28.53%和189.87%(見(jiàn)表2)。由此可見(jiàn)，DS會(huì)抑制葡萄根系的生長(zhǎng)，而接種AMF后能有效促進(jìn)扦插苗根系的生長(zhǎng)。

表2 干旱脅迫下AMF對(duì)葡萄扦插苗發(fā)根數(shù)量的影響 根

2.3 對(duì)葡萄扦插苗根系構(gòu)型的影響

無(wú)論是在接種還是未接種AMF條件下，DS顯著降低了葡萄扦插苗根系總長(zhǎng)、表面積、平均直徑。與不接種AMF相比，接種AMF后顯著促進(jìn)了葡萄扦插苗根系發(fā)育，根系總長(zhǎng)、表面積、平均直徑以及體積，在DS和WW下均有不同程度增加(見(jiàn)表3)。由此可見(jiàn)，接種AMF在促進(jìn)葡萄扦插苗根系發(fā)育上具有重要作用。

表3 干旱脅迫下AMF對(duì)葡萄扦插苗根系構(gòu)型的影響

2.4 對(duì)葡萄扦插苗養(yǎng)分吸收的影響

水分處理和AMF接種與否并沒(méi)有影響葡萄扦插苗葉片N和Mg的含量。DS顯著降低了非菌根化葡萄葉片P、K、Ca、Cu、Mn、Zn以及菌根化下K、Ca、Fe、Zn的含量。與不接種AMF相比，接種AMF后，葉片中的P、K、Ca、Fe、Cu、B在WW和在DS下均有明顯增加，N、Mg、Fe元素含量變化不明顯，Mn、Zn分別降低了9.55%、54.65%(見(jiàn)表4、表5)。

DS降低了非菌根化處理下葡萄扦插苗根系K、Fe、Zn、B以及菌根化下K和Ca的含量，增加了菌根化下P和Cu的含量，對(duì)其他處理下其他元素含量無(wú)顯著影響(見(jiàn)表4)。與不接種AMF相比，接種AMF后葡萄扦插苗根系P、K、Ca、Fe、B在WW下分別增加了165.63%、9.65%、75.97%、24.97%、14.48%，Mg、Mn分別降低了52.16%、21.32%，N、Cu、Mn元素含量無(wú)顯著變化；在DS下P、K、Fe、Cu、Zn、B分別增加了201.45%、16.99%、90.43%、15.63%、23.92%、25.28%，Mg、Mn分別降低了53.89%、21.75%，N、Ca含量無(wú)顯著變化(見(jiàn)表4、表5)。

表4 干旱脅迫下AMF對(duì)葡萄扦插苗大量元素含量的影響 g/kg

表5 干旱脅迫下AMF對(duì)葡萄扦插苗微量元素含量的影響 mg/kg

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，AMF侵染夏黑葡萄根系后，能在其根系中清晰地觀察到泡囊、叢枝和菌絲結(jié)構(gòu)，表明葡萄是典型的叢枝菌根類植物，這與吳強(qiáng)盛等[11]的研究結(jié)果一致。在葡萄生產(chǎn)過(guò)程中，新梢粗度、節(jié)間長(zhǎng)度和葉面積常作為衡量樹(shù)體生長(zhǎng)勢(shì)的標(biāo)準(zhǔn)[12]。張永福等[13]在不同葡萄品種上的研究發(fā)現(xiàn)，AMF顯著促進(jìn)葡萄的生長(zhǎng)，增加株高、莖粗、生物量以及根冠比，提高葡萄葉片光合速率以及碳水化合物的積累，且接種AMF后生長(zhǎng)勢(shì)弱的品種總生物量的增加量要大于生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的品種。在本研究中，無(wú)論是在DS還是在WW下，AMF顯著促進(jìn)了葡萄扦插苗地上部的生長(zhǎng)，增加了枝梢長(zhǎng)度、粗度、葉片數(shù)量以及生物量，這與前人在枳[3]、油茶[14]、蘋果[15]和葡萄[16]等一些植物上的研究結(jié)果相同，進(jìn)一步證實(shí)AMF對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)具有積極的效應(yīng)。

良好根系形態(tài)的建立是植株地上部更新復(fù)壯的物質(zhì)基礎(chǔ)。在自然條件下，葡萄根系的生長(zhǎng)與溫度、光質(zhì)、水分、營(yíng)養(yǎng)、土壤的酸堿度、有機(jī)質(zhì)含量等密切相關(guān)，且土壤的水分和養(yǎng)分狀況對(duì)根系的生長(zhǎng)起決定性的作用[17-18]。在本研究中，DS顯著抑制了葡萄扦插苗不定根的形成，降低了根系構(gòu)型參數(shù)，這可能是由于DS下，土壤水分不足從而使得側(cè)根的發(fā)生和伸長(zhǎng)受到抑制[19]；此外，DS還會(huì)降低葡萄葉片光合速率及有機(jī)物質(zhì)的積累，從而抑制了根系的發(fā)育[20-21]。然而，無(wú)論是在WW還是在DS下，AMF的接種顯著促進(jìn)了葡萄扦插苗根系的發(fā)育，增加了不定根數(shù)量及根系構(gòu)型參數(shù)，改善了根系形態(tài)，這與前人[3，17]的研究結(jié)果一致，這主要?dú)w功于AMF龐大的根外菌絲改善了葡萄根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收與利用，促進(jìn)了根系內(nèi)源激素如生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、多胺等的分泌，刺激不定根的發(fā)育與根系構(gòu)建[3，22]。

眾所周知，AMF能夠增強(qiáng)宿主植物對(duì)礦物養(yǎng)分的吸收，主要在于AMF促進(jìn)了宿主植物根系發(fā)育，以及龐大的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)大了根系的吸收面積；菌絲能夠穿透到根系無(wú)法進(jìn)入的區(qū)域，吸收根際范圍之外的養(yǎng)分供植物吸收利用[3]；此外，根外菌絲還能分泌多種有機(jī)酸，以活化土壤中的難溶性養(yǎng)分，增強(qiáng)宿主植物對(duì)養(yǎng)分吸收及利用效率[23]。本研究結(jié)果顯示，在2種不同水分條件下，接種AMF均能明顯增加葡萄扦插苗根系和葉片中礦質(zhì)元素含量，增強(qiáng)了葡萄扦插苗對(duì)無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)的吸收，尤其是對(duì)磷、鉀、鈣等礦質(zhì)元素的吸收，這與前人在滇重樓[24]等眾多植物上的研究結(jié)果一致。此外，AMF增強(qiáng)葡萄扦插苗養(yǎng)分的吸收，與本研究中AMF促進(jìn)了不定根發(fā)育、改善了根系構(gòu)型密切相關(guān)，良好的根系構(gòu)型增強(qiáng)了養(yǎng)分的吸收，養(yǎng)分吸收及利用率的增強(qiáng)促進(jìn)了根系構(gòu)型的建立。

總之，在DS下，AMF可通過(guò)改善葡萄扦插苗的根系形態(tài)、促進(jìn)側(cè)根發(fā)育進(jìn)而提高其對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力。同時(shí)AMF的侵染還能增強(qiáng)根系對(duì)礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收，從而促進(jìn)葡萄扦插苗地上部分的生長(zhǎng)。AMF的應(yīng)用對(duì)提高葡萄的抗旱性具有重要作用。