郭昱嬌，林 杰，郭俊明

（1.昆明市生態(tài)環(huán)境局五華分局生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，昆明 650031；2.云南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650500）

綠絨蒿是罌粟科綠絨蒿屬植物，學(xué)名為，藏名為烏巴拉色爾布，分布于云南、四川、西藏、甘肅等海拔較高的寒冷地區(qū)。綠絨蒿可分為歐貝、刺兒恩、木窮典云和阿夏擇哦四類。其中，歐貝是多種綠絨蒿的總稱，為常用藏藥，主要來源于五脈綠絨蒿（Regel，花淡紫色）、長葉綠絨蒿（，花紫色）、毛瓣綠絨蒿（Prain，花淡紫紅色）的全草，云南省香格里拉市多為長葉綠絨蒿。綠絨蒿全草含氨基酸、有機(jī)酸、糖類、鞣質(zhì)和生物堿等，性味苦、澀、寒、小毒，功能主治有清熱利濕、止咳、濕熱黃疸、水腫、創(chuàng)傷久不愈合等，同時其含有多種微量元素。

微量元素主要與植物體內(nèi)有機(jī)物形成配合物，成為各種酶活性中心，增強(qiáng)其療效。人們通常以湯劑、針劑、浸膏、粉劑等形式服用中草藥，其中湯劑（煎劑或水提取液）是主要的傳統(tǒng)服用形式。周天澤將煎劑中微量元素的存在形態(tài)分為六態(tài)：溶解態(tài)和非溶解態(tài)、膠態(tài)和非膠態(tài)、有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài)、離子態(tài)和非離子態(tài)、絡(luò)合態(tài)和非絡(luò)合態(tài)、價態(tài)。因此，微量元素不同形態(tài)配合物的不同親脂性和生物活性是其發(fā)揮療效的關(guān)鍵。按照藥理學(xué)藥物鑒定中評價有機(jī)藥物親脂性及生物活性的方法，采用正辛醇-水萃取體系中微量元素的含量比K評價微量元素在人體腸、胃的溶出分布或吸收情況。此外，微量元素的健康風(fēng)險評價也是中藥用藥安全的重要指標(biāo)。目前，藏藥綠絨蒿的研究主要涉及資源、形態(tài)組織學(xué)、有機(jī)化學(xué)成分、藥理活性、臨床應(yīng)用等方面，未涉及綠絨蒿中金屬元素的形態(tài)分析及健康風(fēng)險評價。

本文采用火焰原子吸收光譜法（FAAS）測定分析云南香格里拉長葉綠絨蒿原藥、煎劑、正辛醇-水萃取體系等的Fe、Cr、Zn、Cu和Pb含量，研究金屬元素的形態(tài)分布，采用目標(biāo)危害商值（）評價金屬元素對人體的健康風(fēng)險，為進(jìn)一步研究其金屬元素的作用以及探討長葉綠絨蒿的治療機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

主要儀器有兩種，一是AA-6300原子吸收分光光度計（日本島津公司），二是Cu、Zn、Fe、Cr和Pb空心陰極燈（北京有色金屬研究院）。

主要試劑是1 000 μg/mL Zn、Cu、Fe、Pb和Cr標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家鋼鐵材料測試中心制），使用時用1% HNO分別稀釋成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液；化學(xué)試劑為優(yōu)級純或分析純；試驗用水為高純水。藏藥長葉綠絨蒿購買于云南省香格里拉市迪慶州藏醫(yī)院，為干全草。

1.2 火焰原子吸收光譜法工作條件

根據(jù)表1的工作條件，測定稀釋后標(biāo)準(zhǔn)溶液中各元素的吸光度，繪制工作曲線。線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)如表2所示。

表1 火焰原子吸收光譜法工作條件

表2 線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)

1.3 形態(tài)分析

1.3.1 長葉綠絨蒿預(yù)處理

取一定量的長葉綠絨蒿干全草，用自來水快速沖洗去除泥土后，再用高純水清洗2～3次。晾干水分后，將其放于瓷托盤中，在65 ℃的鼓風(fēng)干燥烘箱干燥6 h。冷至室溫后，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎，得粉狀綠絨蒿原藥。將原藥裝入自封塑料袋，在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 長葉綠絨蒿中金屬元素總含量測定

將0.500 0 g粉狀長葉綠絨蒿原藥置于50 mL燒杯中，加10 mL濃硝酸浸泡至少12 h，之后加濃高氯酸2.5 mL，放于電熱板上加熱消解，至溶液透明，繼續(xù)小心加熱，剩余1～2 mL液體。冷卻后，用少量1%硝酸溶液稀釋、洗滌，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，平行做空白試樣，按照小節(jié)1.2的條件測定Zn、Cu、Fe、Pb和Cr金屬元素的含量。

1.3.3 長葉綠絨蒿中金屬元素水煎提取

準(zhǔn)確稱取10.000 0 g粉狀長葉綠絨蒿原藥置于500 mL燒杯中，加高純水200 mL，室溫下靜置30 min后加熱至沸，調(diào)節(jié)電熱板溫度，保持微沸30 min，關(guān)閉電源，靜置稍冷，用中藥過濾袋濾擰，每次用20～25 mL熱高純水洗濾殘渣，重復(fù)2～3遍，得到第一次水煎液（A液）和殘渣，將A液濃縮至約50 mL，冷后用1%硝酸溶液定容至100 mL。在藥渣中加入150 mL高純水，重復(fù)以上步驟，得到第二次水煎液（B液）。采用同樣方法處理，得到第三次水煎液（C液）和最終殘渣。取A液、B液和C液各10 mL分別放于50 mL燒杯中，各加入10 mL濃HNO放置過夜，然后加入2.5 mL高氯酸消解，消解步驟與小節(jié)1.3.2相同，并分別用50 mL容量瓶定容，測定各元素含量。同時，要進(jìn)行空白處理。

1.3.4 制備可溶態(tài)測定液

分別準(zhǔn)確量取長葉綠絨蒿原藥水煎A液、B液和C液各10 mL，置于50 mL燒杯中混勻，高速離心2 h，上清液用0.45 μm濾膜過濾，棄濾渣，濾液平均分成3份，濾液為可溶態(tài)。分別將濾液按照小節(jié)1.3.2方法消解后，用25 mL容量瓶定容，測定各元素含量，取平均值。同時，平行做空白試樣。

1.3.5 制備模擬人工胃、腸提取測定液

取水煎A液、B液和C液各5 mL，移入50 mL燒杯中混勻，均分為2份，用稀HCl和稀NaOH溶液分別調(diào)節(jié)為pH=1.3（模擬胃液的酸度）和pH=7.6（模擬腸液的酸度）。靜置8 h后，將其分別轉(zhuǎn)入分液漏斗，各加入正辛醇5 mL，振蕩萃取0.5 h，靜置分層0.5 h，收集水相并重復(fù)萃取2次，水相分別為模擬胃水溶態(tài)和模擬腸水溶態(tài)。將各水相蒸發(fā)至近干，按照小節(jié)1.3.2方法消解、定容為25 mL，測定其中5種元素含量，胃（或腸）醇溶態(tài)中元素含量為總水煎液中元素含量與胃（或腸）水溶態(tài)元素含量之差。平行3組試樣，同時平行做空白試樣。

1.4 非致癌重金屬健康風(fēng)險評價模型

藏藥長葉綠絨蒿中Fe、Zn、Cr、Cu和Pb 5種金屬元素為非致癌毒性元素。根據(jù)美國環(huán)境保護(hù)署（USEPA）創(chuàng)建的非致癌風(fēng)險評價方法，評價長期服用單一金屬元素的健康風(fēng)險（THQ），其計算公式為：

式中：c為長葉綠絨蒿中金屬元素的含量，mg/kg；為人群暴露頻率，d/a；為暴露時間，a；為長期服用長葉綠絨蒿患者的日攝入量，g/（人·d）；為成年人的平均體重，kg；為非致癌風(fēng)險平均暴露時間，d；為金屬元素每日允許攝取最大量，mg/（kg·d）。

若THQ＜l，則表明無明顯的健康風(fēng)險，反之，則說明有健康風(fēng)險。

同時存在多種金屬元素時，其復(fù)合健康風(fēng)險（）用式（2）評價。

多元素復(fù)合健康風(fēng)險評價標(biāo)準(zhǔn)為：＜1表示無非致癌風(fēng)險，≥1表示有非致癌風(fēng)險。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬元素的形態(tài)分析

長葉綠絨蒿原藥、水煎液和模擬人工胃、腸提取液等的Fe、Zn、Cr、Cu和Pb元素測定結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，長葉綠絨蒿原藥中5種金屬元素含量差別較大，F(xiàn)e含量最多，Zn和Cu含量較高，Pb含量最少，F(xiàn)e含量是Pb含量的240倍，5種元素含量順序為Fe＞Zn＞Cu＞Cr＞Pb，表明長葉綠絨蒿是富含F(xiàn)e、Zn和Cu藥用植物，有害元素Pb含量低。長葉綠絨蒿中Pb、Cu含量均低于《中華人民共和國藥典》（2020年版，一部）中規(guī)定的限量，即Pb≤5 mg/kg，Cu≤20 mg/kg，但長葉綠絨蒿中Cu含量與Cu限量很接近。研究結(jié)果與楊若明等測定的四川藏草藥毛瓣綠絨篙中金屬元素含量大小有較大差別，這與不同地區(qū)土壤中相關(guān)元素含量不同有關(guān)。但同云南長葉綠絨蒿一樣，毛瓣綠絨蒿中Fe、Zn和Cu元素含量較高，Cr含量較低，說明綠絨蒿類植物易富集Fe、Zn和Cu元素；從水煎液中各金屬元素含量來看，隨著水煎次數(shù)的增加，水煎液中金屬元素含量降低，總水煎提取液的金屬元素含量均比原藥的低，表明通過水煎藥物，只能部分利用長葉綠絨蒿中的部分元素；長葉綠絨蒿可溶態(tài)中各金屬元素含量均比總水煎液的低得多；從模擬人工胃、腸提取的水溶液各金屬元素含量來看，除Pb外，其都比胃、腸醇溶態(tài)中金屬元素含量低得多，表明Fe、Zn、Cu和Cr相對易被人體吸收，而對于有害元素Pb，人體本身可能具有排斥性。

表3 長葉綠絨蒿中5種金屬元素形態(tài)分析結(jié)果

從不同元素的醇溶態(tài)元素含量與水溶態(tài)元素含量比值K來看，K值差別較大。從胃酸度來看，F(xiàn)e、Zn、Cu和Cr的K值都較大，其中Fe的K值最大，Pb的K值最小，Zn、Cu和Cr的K值相差不大，其中Fe的是Zn的5倍多。這說明Fe、Zn、Cu和Cr在胃部吸收較多，而Pb在胃部幾乎不吸收。從腸酸度來看，F(xiàn)e、Cu和Cr的K值較大，其中Cu的最大，Cr次之，而Zn、Pb的K值很小，說明Fe、Cu和Cr在腸部易吸收，而Zn、Pb吸收很少。由此可以看出，pH對Zn吸收有較大影響?？傊琙n主要在胃部吸收，F(xiàn)e、Cu和Cr則在胃、腸部均可吸收，而Pb在胃、腸部均吸收少，該結(jié)果為長葉綠絨蒿治療相關(guān)疾病時選擇作用靶點(diǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

2.2 形態(tài)分析參數(shù)

為了進(jìn)一步了解藏藥長葉綠絨蒿中金屬元素的初級形態(tài)分布，根據(jù)長葉綠絨蒿各形態(tài)分析測定結(jié)果，按照相關(guān)研究方法計算形態(tài)分析參數(shù)，結(jié)果如表4所示。主要參數(shù)有水提取率（，每次水煎液元素含量與原藥元素含量之比）、水提殘留率（）、總水提浸留比（，總水煎液中元素含量與最后一次水提殘留量元素含量之比）、溶解率（，可溶態(tài)元素含量與原藥元素含量之比）和顆粒吸附率（，總水煎液與可溶態(tài)中元素含量之差同原藥相應(yīng)元素含量之比）。其中，水提取率（）表示實際的服用部分，是制定提取工藝的重要依據(jù)，而總水提浸留比（）則為該元素發(fā)揮作用的標(biāo)度，越大表明該元素在藥中的作用越大。

從表4可以看出，長葉綠絨蒿第一次水煎提取液中元素最多，隨著水煎提取次數(shù)的增加，元素提取率均呈下降趨勢，但Cr的三次提取率均較大，Cr總提取率達(dá)到82.04%，說明含Cr物質(zhì)在水中的溶解性較大。雖然Fe在原藥中的含量達(dá)到242.68 μg/g，但總提取率最低（10.90%），表明含F(xiàn)e物質(zhì)在水中的溶解性很差。Zn、Cu和Pb的總提取率均保持在22.08%～26.73%，相差不大。根據(jù)提取率大小可判斷，長葉綠絨蒿中的Cr元素受熱易溶出，主要以無機(jī)離子型或親水性有機(jī)物形態(tài)存在；Fe用水煎方法難溶出，主要以疏水性有機(jī)物形態(tài)存在，Zn、Cr和Pb也主要以疏水性有機(jī)物形態(tài)存在。因此，元素水煎提取率的高低是確定中藥劑量或考察其毒性的重要依據(jù)。

從表4水提殘留率可知，除Cr元素殘留較小外，殘渣中其他金屬元素含量遠(yuǎn)高于水煎液中的含量，主要原因是殘渣纖維吸附使這些成分不易進(jìn)入水相；從總水提浸留比來看，長葉綠絨蒿中微量元素Cr最大，說明Cr是該藥中發(fā)揮藥效作用最大的元素，Zn、Cu和Pb相差不大，最小的是Fe元素；各金屬元素懸浮態(tài)顆粒吸附率差別較大，其中Cr的最大，F(xiàn)e的最小，Pb約為Fe的2倍，Zn和Cu也較小，但相差不大，說明含Cr物質(zhì)易被吸附，F(xiàn)e和Pb不易被吸附。

表4 長葉綠絨蒿中金屬元素形態(tài)分析參數(shù)

2.3 Kow值及酸度變化對元素形態(tài)分布的影響

分別以各元素的正辛醇相平衡濃度與水相平衡濃度比值K評價其親脂性及生物活性，進(jìn)而評價金屬元素在胃、腸中的吸收情況。結(jié)果如表3所示。

從表3可見，pH=1.3胃酸度和pH=7.6腸酸度環(huán)境會影響金屬元素形態(tài)分布，所測長葉綠絨蒿中5種元素在胃酸度條件下的K均大于腸酸度條件下的K，表明這5種元素在胃部的吸收可能較多，而在腸部的吸收相對較少，也就是說，在胃環(huán)境中其生物活性較高，有利于參與人體代謝過程。但pH對有害Pb元素的K影響小，說明胃和腸吸收都較少，原因可能是人體本身就有排斥反應(yīng)。

2.4 健康風(fēng)險評價結(jié)果

按照《中華本草》的綠絨蒿用法用量，每日內(nèi)服（煎湯）3～6 g，將該用量的平均值（4.5 g）作為成年人長期服用的日攝入量（）。按照相關(guān)研究，式（1）中、、和分別取90 d/a、30 a、60 kg和10 950 d（按30 a計）。對于金屬元素每日允許攝取最大量（），按照聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）規(guī)定的每周可耐受攝入量，Zn、Cu、Cr和Pb的值分別為30.00 mg/（kg·d）、4.00×10mg/（kg·d）、1.50 mg/（kg·d）和3.50×10mg/（kg·d）。按照《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量（簡要本）》中金屬元素可耐受最高攝入量（），F(xiàn)e的值取50 mg/（kg·d）。非致癌健康風(fēng)險評價結(jié)果如表5所示。

從表5健康風(fēng)險評價結(jié)果可以看出，無論是單一金屬元素還是多種金屬元素，其或均遠(yuǎn)小于1，說明每日通過原藥、總水煎液、可溶態(tài)的形式服用長葉綠絨蒿均無非致癌風(fēng)險，在胃醇溶態(tài)、腸醇溶態(tài)中元素的吸收也不會有非致癌風(fēng)險。在5種金屬元素中，Cu和Pb對的貢獻(xiàn)率較大，而Fe和Zn對的貢獻(xiàn)率較小。

表5 長葉綠絨蒿中5種金屬元素的THQ、HI

3 結(jié)論

本文采用濕法消解處理藏藥長葉綠絨蒿，運(yùn)用火焰原子吸收光譜法檢測Fe、Zn、Cr、Cu和Pb 5種元素，5種元素在原藥中的含量有較大差異，其順序為Fe＞Zn＞Cu＞Cr＞Pb。其中，F(xiàn)e含量最多，Pb含量最少，F(xiàn)e含量是Pb含量的240倍，Zn、Cu含量也較高。這表明長葉綠絨蒿是富含F(xiàn)e、Zn、Cu藥用植物，有害元素Pb含量低。Fe的總水煎提取率最低（10.90%），Zn、Cu和Pb的總提取率均保持在22.08%～26.73%，相差不大，Cr總提取率最高（82.18%）；微量元素Cr的總水提浸留比最大，它是此藥中作用最大的元素，Zn、Cu和Pb相差不大，F(xiàn)e元素的總水提浸留比最小。Zn主要在胃部吸收，F(xiàn)e、Cu和Cr則在胃、腸部均可吸收，Pb在胃、腸部吸收都較少；pH對Zn吸收影響較大，對Pb吸收影響較小。5種金屬元素在長葉綠絨蒿原藥、總水煎液、可溶態(tài)、胃醇溶態(tài)、腸醇溶態(tài)等中的或均遠(yuǎn)小于1，說明長期服用長葉綠絨蒿均無非致癌風(fēng)險。在5種金屬元素中，Cu和Pb對的貢獻(xiàn)率較大，是主要的風(fēng)險元素。