王旖，張玲，孫媛之，蔣波，曾榮榮，楊柳，范能全(通信作者)

重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 (重慶 401121)

隨著科技的發(fā)展，骨科植入材料經(jīng)歷了從不銹鋼、鈷鉻合金到多孔鉭和鈦及鈦合金的發(fā)展過程。近年來的各研究發(fā)現(xiàn)，多孔金屬材料的三維立體空間構(gòu)型可為成骨細(xì)胞及富含血管的纖維組織提供良好的生長(zhǎng)空間和環(huán)境，且孔隙直徑300～600 μm、孔隙率>75%對(duì)于成骨極為有利。多孔金屬鉭材料的孔徑為400～600 μm，孔隙率為75%～80%，具有良好的骨傳導(dǎo)性，且與人類松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)類似[1]，具有生物相容性良好、孔隙率高、彈性模量與正常骨相似等特性，是理想的骨科植入物材料[2]。目前，鈦材料因其具有質(zhì)輕、彈性模量低、無磁場(chǎng)、抗腐蝕性等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上應(yīng)用廣泛，已成為最有發(fā)展前途的人體硬組織理想替代醫(yī)用生物金屬材料[3]。但是作為長(zhǎng)期植入體內(nèi)的醫(yī)療器械產(chǎn)品，目前鉭、鈦兩種材料仍存在彈性模量過高、抗腐蝕性和抗菌性較差[3]的缺點(diǎn)，同時(shí)存在體液環(huán)境中微粒析出、動(dòng)態(tài)環(huán)境中材料脫落等風(fēng)險(xiǎn)[4]，因此，對(duì)這兩種材料進(jìn)行合理的安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。本研究將鉭、鈦材料制成特定形狀植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉內(nèi)，通過進(jìn)行血細(xì)胞、血清生化指標(biāo)、臟器體質(zhì)量比等檢測(cè)，綜合評(píng)價(jià)兩種材料的亞慢性毒性反應(yīng)，為這兩種材料的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鉭、鈦材料均為直徑10 mm、厚1 mm的圓片，由西南醫(yī)院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只普通級(jí)新西蘭兔(雌雄各半)；適應(yīng)期結(jié)束后體質(zhì)量為2.0～2.73 kg，由濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2018-0006]；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在受控環(huán)境中，溫度20～26 ℃，日溫差不超過4 ℃，維持12 h明暗交替的光照循環(huán)，單籠喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組

36只新西蘭兔隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組、鉭材料組、鈦材料組，每組12只(雌雄各半)。

1.3.2植入途徑與方法

實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行120 d，其中植入期90 d(將植入手術(shù)當(dāng)天定義為實(shí)驗(yàn)第1天)，恢復(fù)期30 d。植入手術(shù)：將鉭、鈦材料高溫(121 ℃)滅菌30 min后，置于烘箱[德國(guó)，美墨爾特，型號(hào)UN 55]中烘干備用；用脫毛器脫去新西蘭兔兩側(cè)脊柱旁肌被毛，用3%戊巴比妥鈉(上海上藥新亞藥業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào) 國(guó)藥準(zhǔn)字H31021725, 規(guī)格0.1g)1 ml/kg靜脈注射麻醉；常規(guī)碘伏消毒后，在距脊中線1.5 cm、脊柱中部偏下2 cm處縱行切開皮膚、皮下組織、筋膜，鈍性分離豎脊肌(深度為2 cm)，假手術(shù)對(duì)照組不植入任何物體，鉭、鈦材料組分別植入備用的鉭、鈦材料(與肌肉緊密接觸)，然后逐層縫合切口；術(shù)后做好傷口消毒，連續(xù)給予注射用頭孢曲松鈉(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號(hào) 國(guó)藥準(zhǔn)字H20045219，規(guī)格1.0 g/瓶)肌內(nèi)注射3 d，0.055 g/(kg·d)。第90天,解剖每組各8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(雌雄各半)。第91天(恢復(fù)期第1天)，取出剩余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(每組各4只)的植入物，處理好傷口，連續(xù)給予注射用頭孢曲松鈉3 d，繼續(xù)喂養(yǎng)至恢復(fù)期結(jié)束。第121天，解剖剩余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1一般觀察

實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察1次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷口愈合情況(有無紅腫、潰爛等)、外觀體征、行為、飲食、對(duì)刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等，以及死亡情況(包括死亡時(shí)間、瀕死前反應(yīng)等)。

1.4.2血細(xì)胞與血清生化指標(biāo)檢測(cè)

第90、121天，檢測(cè)各組解剖動(dòng)物的血細(xì)胞與血清生化指標(biāo)。血細(xì)胞指標(biāo)包括凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細(xì)胞比容(hematocrit，HCT)、紅細(xì)胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)；血清生化指標(biāo)包括肌酐(creatinine，CREA)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(glutamine transpeptidase，GGT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、血糖(blood glucose，GLU)、膽固醇(cholesterol ，CH)、甘油三脂(triglyceride，TG)，以及各種微量元素(K、Na、Cl、Ca、P)。

1.4.3病理組織學(xué)與蛋白芯片檢測(cè)

第90、121天，解剖剩余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，對(duì)其各臟器進(jìn)行肉眼觀察，同時(shí)取腎上腺、腎、腦、心、肝、胸腺進(jìn)行稱重，計(jì)算臟器體質(zhì)量比(臟器濕重/體質(zhì)量)；采集解剖動(dòng)物的血清，采用RayBiothch提供的蛋白芯片(型號(hào)QAL-CYT-1-4，批號(hào)123120 0564)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的差異蛋白；解剖固定后的各組織[包括肝、心、脾、肺、腎、腦(大腦、小腦、腦干)、腎上腺(雙側(cè))、胸腺、脊髓(頸椎、中段胸椎、腰椎)、頜下腺、垂體、氣管、食管、甲狀腺/甲狀旁腺、膽囊、坐骨神經(jīng)、骨骼肌、胰腺、膀胱、主動(dòng)脈、睪丸(雙側(cè))、附睪(雙側(cè))、前列腺、精囊腺、卵巢(雙側(cè))、輸卵管(雙側(cè))、子宮角(雙側(cè))、子宮頸、乳腺、陰道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、骨髓(胸骨)、眼、主支氣管、皮膚和實(shí)驗(yàn)部位肌肉]通過常規(guī)石蠟切片(切片厚4 μm)，HE染色，于光鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

植入期，假手術(shù)對(duì)照組、鉭材料組、鈦材料組分別有2、1、1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)傷口紅腫、輕微流膿現(xiàn)象，11 d后全部恢復(fù)正常；恢復(fù)期，鈦材料組有1只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)傷口紅腫現(xiàn)象，13 d后恢復(fù)正常；植入期與恢復(fù)期的體質(zhì)量以及進(jìn)食均未見任何異常；兩次解剖前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外觀體征、行為活動(dòng)、毛色、糞便、尿液、呼吸及對(duì)外界反應(yīng)均未見明顯異常，處死后解剖觀察各個(gè)臟器組織均未見明顯異常。

2.2 血細(xì)胞與血清生化指標(biāo)

植入期與恢復(fù)期，3組的血細(xì)胞與血清生化各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1～2。

表1 3組血細(xì)胞指標(biāo)比較

表2 3組血液生化指標(biāo)比較

2.3 臟器體質(zhì)量比

植入期與恢復(fù)期，3組各項(xiàng)臟器體質(zhì)量比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 植入期臟器體質(zhì)量比

2.4 蛋白芯片檢測(cè)

植入期，與假手術(shù)對(duì)照組比較，鉭材料組有2個(gè)差異蛋白，分別為IL-17A、IL-21；鈦材料組有6個(gè)差異蛋白，分別為IL-17A、IL-21、IL-8、MIP-1b、IL-1a、MMP-9，見表4～5。恢復(fù)期，與假手術(shù)對(duì)照組比較，鉭材料組有3個(gè)差異蛋白，分別為L(zhǎng)eptin，IL-1b，MIP-1b；鉭材料組無差異蛋白，見表6。

表4 植入期鉭材料組與假手術(shù)對(duì)照組的差異蛋白

表5 植入期鈦材料組與假手術(shù)對(duì)照組的差異蛋白

表6 恢復(fù)期鈦材料組與假手術(shù)對(duì)照組的差異蛋白

2.5 病理檢查

第90、121天，對(duì)解剖固定后的各組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，均未見明顯亞慢性毒性作用。

3 討論

隨著人們生活水平的不斷上升，交通事故、體育運(yùn)動(dòng)等損傷的日益增多，鉭材料和鈦材料相關(guān)植入性醫(yī)療器械的運(yùn)用也越來越廣泛[5-7]，且其優(yōu)點(diǎn)也已得到有效論證，例如多孔鉭具有高孔隙率、高摩擦系數(shù)和低彈性模量的特點(diǎn)，其優(yōu)良的生物相容性、生物活性及骨整合能力在治療ONFH及關(guān)節(jié)置換術(shù)后翻修骨缺損中臨床療效優(yōu)良[8]；累積疊軋焊加工的鈦合金抗腐蝕性較好；表面改性鈦合金的生物相容性、耐磨性、抗腐蝕性、抗菌性等也有提高[3]。但兩種材料尚存以下不足：(1)高昂的價(jià)格與日益增長(zhǎng)的需求量相悖，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)運(yùn)用較少；(2)鈦材料及其合金的耐磨性、抗腐蝕性、抗菌性等還有待提升；(3)多孔鉭和多孔鈦主要用于松質(zhì)骨缺損骨填充材料，未運(yùn)用于四肢承重骨骨缺損修復(fù)，高力學(xué)強(qiáng)度與高孔隙率間的矛盾以及植入后的穩(wěn)定性也有待研究[8]。鉭、鈦材料作為植入性醫(yī)療器械材料，臨床重點(diǎn)關(guān)注其治療的有效性、準(zhǔn)確性，但其安全性同樣值得關(guān)注。有研究采用浸提液注射大鼠尾靜脈的方法進(jìn)行醫(yī)療器械亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)[4]，其優(yōu)勢(shì)是可避免手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的影響，且大鼠比家兔的生命力更頑強(qiáng)，體征更穩(wěn)定，個(gè)體差異相對(duì)較小，飼養(yǎng)方法也更加簡(jiǎn)便，最終各項(xiàng)數(shù)據(jù)的可靠性更強(qiáng)，但該染毒方法與樣品用途不相適應(yīng)，未使材料接觸到體液并產(chǎn)生相互作用，不能更好地反映出該植入性醫(yī)療器械通過手術(shù)方式對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響。本研究參照GB/T 16886.11《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第11部分：全身毒性試驗(yàn)》，將兩種材料分別植入新西蘭兔肌肉中，通過觀察血細(xì)胞、血清生化、病理檢查等指標(biāo)，未觀察到兩種材料可能引起的亞慢性毒性反應(yīng)和延遲毒性反應(yīng)，為評(píng)價(jià)這兩種材料的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)提供了一定的參考價(jià)值。

蛋白芯片技術(shù)是一種高通量的蛋白質(zhì)免疫檢測(cè)分析技術(shù)[9]，在癌癥、自身免疫性疾病、肥胖等多種疾病的研究中均有所應(yīng)用，相比于ELISA等傳統(tǒng)檢測(cè)方法，其靈敏度更高，可進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)，具有快速、簡(jiǎn)便、所需樣本少、成本低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)血液、生化、病理檢測(cè)雖然均未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但利用蛋白芯片技術(shù)同時(shí)對(duì)IL-1a、IL-1b、IL-8、IL-17A、IL-21、Leptin、MIP-1b、MMP-9、NCAM-1、TNFa等指標(biāo)含量進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)對(duì)照組相比，恢復(fù)期鈦材料的Leptin、IL-1b、MIP-1b均升高，可能由肺及胃腸炎癥引起[10-11]，如需驗(yàn)證鈦材料植入性醫(yī)療器械是否會(huì)造成肺及胃腸等器官炎癥，還需進(jìn)一步研究。