王瑞琦，陳慶曦，葉堅(jiān)挺

(上海大學(xué) 理學(xué)院,上海 200444)

1 問(wèn)題描述

造血細(xì)胞譜系中所有細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)量通過(guò)造血干細(xì)胞(Hematopoietic Stem Cells，HSCs)不斷生長(zhǎng)分化的方式保持動(dòng)態(tài)平衡[1-2].若體內(nèi)不同細(xì)胞類(lèi)型之間的數(shù)量平衡因外部因素影響而被破壞，則會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的血液疾病，如白血病等[3].為了解此類(lèi)疾病的發(fā)病原因以及尋找治療方法，需要了解正常條件下影響造血細(xì)胞分化選擇的因素.

通常情況下，生物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果最為可靠且直觀，但進(jìn)行廣泛試驗(yàn)意味著較高的試驗(yàn)成本與實(shí)驗(yàn)周期，因此引入數(shù)學(xué)建模的分析方式.布爾網(wǎng)絡(luò)作為用于定性分析的建模方式，廣泛應(yīng)用于構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也同樣應(yīng)用于造血細(xì)胞譜系分化的分析中[4-8].在布爾網(wǎng)絡(luò)中可以利用基因之間的調(diào)控作用獲得調(diào)控規(guī)則，進(jìn)而模擬細(xì)胞內(nèi)基因狀態(tài)隨時(shí)間的變化過(guò)程以及最終穩(wěn)態(tài).

布爾網(wǎng)絡(luò)在用于模擬造血細(xì)胞譜系分化時(shí)，通常針對(duì)部分細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行建模，這意味著會(huì)忽略一些重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程.而增加網(wǎng)絡(luò)涉及的細(xì)胞類(lèi)型時(shí)，網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過(guò)程所需的節(jié)點(diǎn)和調(diào)控關(guān)系也同步增加，使得構(gòu)建更為全面的網(wǎng)絡(luò)時(shí)工作量更多，難度也更大.因此考慮通過(guò)整合現(xiàn)有小網(wǎng)絡(luò)的方式在網(wǎng)絡(luò)全面性和建模工作量之間取得平衡.

2 建模過(guò)程

2.1 確定分析范圍

為了更加全面地分析造血細(xì)胞的分化過(guò)程，從造血細(xì)胞譜系的經(jīng)典分化路徑中選擇了幾種主要的細(xì)胞類(lèi)型[2].通常來(lái)說(shuō)，HSCs被看作是造血細(xì)胞分化的起點(diǎn)，但在HSCs分化到本文主要討論的分化階段之前還需要經(jīng)歷一系列的生長(zhǎng)分化過(guò)程，因此本文以多能祖細(xì)胞(Multipotent Progenitors，MPs)作為分化的起始細(xì)胞類(lèi)型，具體的分化路徑如圖1所示.MPs向不同的細(xì)胞類(lèi)型分化的選擇過(guò)程主要由不同的轉(zhuǎn)錄因子影響[9].為了構(gòu)建一個(gè)更加全面的涉及更多細(xì)胞類(lèi)型的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，利用了兩個(gè)已知的有關(guān)造血細(xì)胞譜系分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7-8].兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)都只討論了與造血細(xì)胞譜系中的部分細(xì)胞類(lèi)型有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子.因此，本文通過(guò)特定的整合規(guī)則將兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合，從而獲得一個(gè)可以同時(shí)討論包括巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞和紅細(xì)胞在內(nèi)的不同細(xì)胞類(lèi)型間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得對(duì)于造血細(xì)胞譜系分化過(guò)程有更加全面的理解.獲得的整合網(wǎng)絡(luò)不但能夠保持原有子網(wǎng)絡(luò)所能夠反映的部分細(xì)胞類(lèi)型的調(diào)控規(guī)則，同時(shí)可以利用兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)系獲得更多細(xì)胞類(lèi)型之間的轉(zhuǎn)化關(guān)系.因此本文的首要任務(wù)是通過(guò)特定的整合規(guī)則將兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合，同時(shí)通過(guò)廣泛的文獻(xiàn)查找獲得額外的基因調(diào)控規(guī)則，對(duì)整合后的網(wǎng)絡(luò)加以修正.

2.2 構(gòu)建整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

在整合兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，以兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)中共有的4個(gè)節(jié)點(diǎn)(Cebpa,Spi1,Gfi1和Egr2)作為連接點(diǎn)，使得這4個(gè)節(jié)點(diǎn)同時(shí)在兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中生效，并將分屬于兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)利用調(diào)控規(guī)則連接到這4個(gè)公共節(jié)點(diǎn)上，從而獲得一個(gè)結(jié)構(gòu)整合后的調(diào)控網(wǎng)絡(luò).除了結(jié)構(gòu)整合之外，還應(yīng)當(dāng)把兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中公共節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的布爾調(diào)控規(guī)則進(jìn)行整合.在整合的過(guò)程中，由于公共節(jié)點(diǎn)在兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)中均存在相應(yīng)的調(diào)控規(guī)則，因此對(duì)兩條調(diào)控規(guī)則的整合方式進(jìn)行了規(guī)定.假如兩條規(guī)則所涉及的布爾規(guī)則完全不同，將其理解為兩條規(guī)則在實(shí)際調(diào)控作用中需要同時(shí)生效，因此通常利用“&”語(yǔ)句，也就是“和”邏輯進(jìn)行整合，表示兩條規(guī)則在影響相應(yīng)節(jié)點(diǎn)表達(dá)情況時(shí)需要同時(shí)生效.假如兩條規(guī)則中的內(nèi)容有部分相似，則利用“|”語(yǔ)句，也就是“或”邏輯進(jìn)行整合，表示這兩條規(guī)則可以單獨(dú)發(fā)揮作用.另外在整合時(shí)，為了網(wǎng)絡(luò)的精簡(jiǎn)考慮，不區(qū)分基因與其對(duì)應(yīng)生成的蛋白質(zhì)，只采用基因作為網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn).通過(guò)以上的整合規(guī)定，可以獲得一個(gè)初步的整合網(wǎng)絡(luò)及其對(duì)應(yīng)的布爾調(diào)控規(guī)則.

在修正初始整合網(wǎng)絡(luò)之前，必須確定各個(gè)細(xì)胞分化階段的穩(wěn)態(tài)，也就是對(duì)應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型的布爾值，從而為判斷構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)是否準(zhǔn)確提供原始依據(jù).因此首先需要補(bǔ)全所有細(xì)胞類(lèi)型基因表達(dá)情況的布爾值.對(duì)于某一基因來(lái)說(shuō)，可以獲得其在部分細(xì)胞類(lèi)型中已有的布爾值以及文獻(xiàn)中參考的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[7-8].在所有已知該基因布爾值的細(xì)胞類(lèi)型中，可以在所有布爾值表達(dá)為“0”的細(xì)胞中確定一個(gè)最大的基因表達(dá)數(shù)值，這確定了令布爾值表達(dá)為“0”的閾值，對(duì)于所有低于該值的基因表達(dá)數(shù)值，均可將布爾值定為“0”.這一閾值確定的原則適用于大部分基因.同理可以獲得令基因布爾值表示為“1”的最小基因表達(dá)數(shù)據(jù)，也就是另一個(gè)閾值，對(duì)于所有高于該閾值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，均可將布爾值定為“1”.因此對(duì)于缺少的布爾值，即可通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與兩個(gè)閾值進(jìn)行比較，當(dāng)?shù)陀诘谝粋€(gè)閾值時(shí)，缺少的布爾值表示為“0”，表示這個(gè)基因沒(méi)有被激活，若高于第二個(gè)閾值，則布爾值為“1”，表示這個(gè)基因已經(jīng)被激活了.對(duì)于未能依靠閾值判定的布爾值，依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與閾值的距離確定歸屬.總的來(lái)說(shuō)，結(jié)合文獻(xiàn)[7-8]中已有的布爾值以及通過(guò)閾值判斷得到的缺失布爾值，得到了所有細(xì)胞類(lèi)型完整的標(biāo)準(zhǔn)布爾值，如表1所示，表中加黑字體表示的布爾值代表根據(jù)閾值判斷得到的布爾值，其他表示的布爾值代表參考子網(wǎng)絡(luò)中原有的布爾值.

表1 所有細(xì)胞類(lèi)型的布爾值

本文的目的是獲得能夠反映造血細(xì)胞分化情況的整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)準(zhǔn)確性的方式是判斷整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)獲得的穩(wěn)態(tài)結(jié)果與本文依據(jù)閾值和基因表達(dá)數(shù)據(jù)獲得的標(biāo)準(zhǔn)布爾值是否匹配，因此需要對(duì)整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)進(jìn)行分析.利用GINsim運(yùn)行初步整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到布爾值，并與此前確定的標(biāo)準(zhǔn)布爾值進(jìn)行比較.由于兩者的表達(dá)情況有明顯的差異，通過(guò)查閱文獻(xiàn)獲得了部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果并在現(xiàn)有網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上增加了相應(yīng)的調(diào)控規(guī)則[10-18]，結(jié)果如表2所示.

表2 整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的布爾調(diào)控規(guī)則

比較了整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在修正后所得到的所有細(xì)胞的布爾值與文獻(xiàn)[19]中的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表達(dá)值.當(dāng)連續(xù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與離散的布爾值整體相同時(shí)，則說(shuō)明整合網(wǎng)絡(luò)可以得到對(duì)應(yīng)細(xì)胞類(lèi)型的穩(wěn)態(tài)結(jié)果，比較結(jié)果如圖2所示.在選擇適當(dāng)?shù)拈撝抵?，可以發(fā)現(xiàn)除GATA-2外的大部分基因在不同細(xì)胞類(lèi)型上的實(shí)驗(yàn)表達(dá)情況與整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)輸出的布爾值類(lèi)似.對(duì)于GATA-2的差別，首先根據(jù)文獻(xiàn)[8]中子網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，當(dāng)GATA2被激活之后，由GATA1和Zfpm1所組成的抑制性相干前饋環(huán)會(huì)重新抑制GATA2，這意味著GATA2在表達(dá)時(shí)通常是處于持續(xù)波動(dòng)的狀態(tài)，在穩(wěn)態(tài)中的表現(xiàn)則通常為不表達(dá).同時(shí)在文獻(xiàn)[8]分析造血細(xì)胞分化過(guò)程中，當(dāng)早期祖細(xì)胞分化為髓系祖細(xì)胞時(shí)，GATA2已經(jīng)被下調(diào)，這說(shuō)明GATA2在GMP等髓系細(xì)胞中不會(huì)被激活，而根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)看，GATA2在GMP中的表達(dá)值為最高，這意味著GATA2在所有細(xì)胞中都不會(huì)被激活，另外由于抑制性相干前饋環(huán)的作用，GATA2的變化過(guò)程會(huì)被延遲，而GATA2的實(shí)驗(yàn)表達(dá)數(shù)據(jù)在GMP細(xì)胞向MAC細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中顯著減少說(shuō)明GATA-2在分化過(guò)程中確實(shí)會(huì)明顯下降，同樣說(shuō)明GATA2在分化潛能較低的這幾類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型中不會(huì)被激活.總的來(lái)說(shuō)，以上的比較結(jié)果意味著構(gòu)建的整合網(wǎng)絡(luò)可以再現(xiàn)細(xì)胞分化過(guò)程中各個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的基因表達(dá)特征，為進(jìn)一步分析不同細(xì)胞類(lèi)型間的分化作用提供了有效的分析基礎(chǔ).

不同細(xì)胞類(lèi)型的布爾值在整體上與實(shí)驗(yàn)表達(dá)數(shù)據(jù)相近，其中GATA-2的差別由抑制性相干前饋環(huán)等原因解釋.這意味著構(gòu)建的整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以正確地重現(xiàn)細(xì)胞分化過(guò)程中各細(xì)胞類(lèi)型的基因表達(dá)特征.

總之，通過(guò)結(jié)合已有的兩個(gè)布爾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)獲得了一個(gè)初步的整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用已知的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修正.最終根據(jù)整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到的布爾值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比驗(yàn)證了所獲整合網(wǎng)絡(luò)的可靠性，網(wǎng)絡(luò)主體如圖3所示.這一整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)包含了多能祖細(xì)胞向下分化所得到的主要細(xì)胞類(lèi)型，因此計(jì)劃通過(guò)施加擾動(dòng)的方式了解實(shí)現(xiàn)細(xì)胞定向分化的主要影響因素.

2.3 獲得定向分化組合擾動(dòng)策略

在分化過(guò)程中細(xì)胞的基因表達(dá)情況會(huì)發(fā)生變化，這些發(fā)生變化的基因通常與對(duì)應(yīng)的分化選擇有關(guān)，但其中只有部分基因起到主導(dǎo)作用，其余的基因則是在前者的誘導(dǎo)下發(fā)生變化.當(dāng)想要將一種類(lèi)型的細(xì)胞定向分化為另一種細(xì)胞時(shí)，最直接的策略是同時(shí)修改分化前后細(xì)胞類(lèi)型之間全部表達(dá)有差異的基因，但更為合理的策略是僅擾動(dòng)起到主導(dǎo)作用的基因.

通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬各類(lèi)擾動(dòng)策略為驗(yàn)證生物系統(tǒng)的合理性提供了可能，在模擬過(guò)程中所有網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)和邊都可以作為擾動(dòng)的對(duì)象.對(duì)于調(diào)控所采取的策略都有實(shí)際的實(shí)驗(yàn)原理與之對(duì)應(yīng)，例如調(diào)控節(jié)點(diǎn)的敲除可以通過(guò)破壞其調(diào)控啟動(dòng)子序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，另一方面，過(guò)表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)等異位轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，而調(diào)控相互作用的敲除則對(duì)應(yīng)著轉(zhuǎn)錄因子與其靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合親和力突變[20-23].通過(guò)修改布爾模型中的節(jié)點(diǎn)狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)兩種系統(tǒng)性擾動(dòng)，即瞬態(tài)擾動(dòng)或持續(xù)性擾動(dòng).對(duì)于瞬態(tài)擾動(dòng)，僅在模擬初始時(shí)修改被擾動(dòng)節(jié)點(diǎn)的布爾值，使得該節(jié)點(diǎn)提供擾動(dòng)信號(hào)給其他后續(xù)參與到分化過(guò)程的節(jié)點(diǎn)，而在模擬過(guò)程中，該節(jié)點(diǎn)仍可能由于受到其他節(jié)點(diǎn)的反饋影響而改變布爾值，這一擾動(dòng)方式主要是為了模擬實(shí)際情況下細(xì)胞在受到轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)誘導(dǎo)之后發(fā)生的分化過(guò)程.對(duì)于持續(xù)性擾動(dòng)，則通過(guò)敲除或過(guò)表達(dá)等方式保持被擾動(dòng)節(jié)點(diǎn)的布爾值被永久改變，這一方式在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中更容易實(shí)現(xiàn).為了分析各個(gè)基因在擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)中對(duì)于分化選擇的影響，測(cè)試了7種血細(xì)胞類(lèi)型之間的狀態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程.

通過(guò)系統(tǒng)的組合擾動(dòng)分析，確定了實(shí)現(xiàn)定向分化的最小組合擾動(dòng)策略(最多擾動(dòng)3個(gè)節(jié)點(diǎn))，如表3所示.表中上標(biāo)“T”或“P”分別表示擾動(dòng)是瞬時(shí)的或持久的.例如，從MP到GMP的轉(zhuǎn)換中的擾動(dòng)意味著Cebpa在MP處的布爾值為0，通過(guò)瞬時(shí)擾動(dòng)轉(zhuǎn)化為1.與擾動(dòng)策略相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)如表3所示.這些擾動(dòng)策略可以為造血細(xì)胞譜系規(guī)范提供一些實(shí)驗(yàn)建議.例如，對(duì)于紅細(xì)胞祖細(xì)胞的分化來(lái)說(shuō)，調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的兩種最主要的細(xì)胞因子是促紅細(xì)胞生成素(Epo)和干細(xì)胞因子(SCF)[24].發(fā)現(xiàn)當(dāng)Spi1的布爾值從“1”擾動(dòng)為“0”，同時(shí)GATA1的布爾值從“0”擾動(dòng)為“1”，即瞬時(shí)或持續(xù)性采用“Spi1-0，GATA1-1”這一擾動(dòng)策略時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)MP向EryB的定向分化.通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知EpoR，也就是促紅細(xì)胞生成素(Epo)的受體，是GATA1的目標(biāo)基因[25]，而Epo是紅細(xì)胞體外形成的重要細(xì)胞因子[24].同時(shí)，對(duì)于SCF(c-kit配體)來(lái)說(shuō)，其受體c-kit主要受SCL復(fù)合物的影響[26]，合成SCL的Tal1的表達(dá)被Spi1抑制，被GATA1促進(jìn)[27].這說(shuō)明了本文的擾動(dòng)策略確實(shí)與對(duì)應(yīng)的細(xì)胞分化過(guò)程有關(guān)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分證明了所確定的組合擾動(dòng)策略在生物學(xué)上是合理的.對(duì)于兩種類(lèi)型的擾動(dòng)，即瞬時(shí)擾動(dòng)和持續(xù)擾動(dòng)，得到了相同的結(jié)果，這表明擾動(dòng)策略中確定的節(jié)點(diǎn)在造血細(xì)胞分化選擇上起著重要作用.

表3 實(shí)現(xiàn)定向分化的最簡(jiǎn)擾動(dòng)策略

3 結(jié) 論

本文通過(guò)整合兩個(gè)已有的子網(wǎng)絡(luò)，構(gòu)建了一個(gè)更全面的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)分析在單擾動(dòng)或組合擾動(dòng)下如何實(shí)現(xiàn)不同類(lèi)型血細(xì)胞之間的定向分化.當(dāng)整合兩個(gè)子網(wǎng)時(shí)，除了合并兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)中原有的調(diào)控規(guī)則外，還需要補(bǔ)充一些額外的調(diào)控規(guī)則，使得整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的邏輯模型所獲得的穩(wěn)態(tài)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保持一致，這樣的一致性說(shuō)明了本文構(gòu)成的整合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和邏輯模型是合理的.然后，通過(guò)確定最小擾動(dòng)策略，也就是要擾動(dòng)的最小節(jié)點(diǎn)集以及確定如何擾動(dòng)它們，從而可以實(shí)現(xiàn)不同的血細(xì)胞類(lèi)型之間的定向分化，這些結(jié)果中的大部分結(jié)論可以通過(guò)其他文獻(xiàn)中的結(jié)論進(jìn)行佐證.分析表明，某些特定的單擾動(dòng)或組合擾動(dòng)可引起定向細(xì)胞分化.

此處介紹的整合網(wǎng)絡(luò)和邏輯模型可以為HSC的分化選擇提供良好的定性意見(jiàn)指導(dǎo)，也可以用于分析實(shí)現(xiàn)HSC轉(zhuǎn)分化定性機(jī)制相關(guān)的影響因素.另外對(duì)于兩個(gè)子網(wǎng)的整合過(guò)程也可以用作整合更多的造血分化和轉(zhuǎn)分化調(diào)控規(guī)則的模板，以促進(jìn)對(duì)造血體系的更全面的了解.此外，確定的擾動(dòng)策略還可以為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析所需要確定的擾動(dòng)目標(biāo)提供一些意見(jiàn).所有結(jié)論可以為血液病的研究與治療提供建議.