何劍全，林小梅，林正坤，林進財，陳健

廈門大學附屬中山醫(yī)院康復醫(yī)學科 福建廈門 361004

骨質疏松癥在中國已成為嚴重影響中老年人健康的疾病之一[1，2]。國際骨質疏松基金會（IOF）報告：全球范圍內每3秒鐘就有1例骨質疏松性骨折發(fā)生。絕經(jīng)后骨質疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）的特征是由于絕經(jīng)后女性雌激素水平下降，導致骨量快速減少，骨微結構破壞，易發(fā)生骨折[3]。PMOP在中醫(yī)學 歸屬“骨痿”、“骨枯”等范疇。根據(jù)《絕經(jīng)后骨質疏松癥（骨痿）中醫(yī)藥診療指南（2019年版）》，將PMOP中醫(yī)證型分為肝腎陰虛證、脾腎陽虛證和腎虛血瘀證3型[4]。同病異治與辨證論治是中醫(yī)藥臨床應用的核心思想，本文旨在探索PMOP的中醫(yī)辨證分型與腸道菌群之間的關聯(lián)，采用16SrDNA基因測序技術，研究不同證型PMOP腸道菌群結構差異，為PMOP的中醫(yī)辨證分型提供基礎理論依據(jù)。

資料與方法

1 入組標準

1.1 診斷標準 診斷標準參照《絕經(jīng)后骨質疏松癥（骨痿）中醫(yī)藥診療指南（2019年版）》[4]和《中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質疏松癥專家共識（2015）》[5]，并根據(jù)指南進行中醫(yī)辨證。

1.2 納入標準 ①符合中西醫(yī)診斷標準，經(jīng)2位主任醫(yī)師診斷中醫(yī)證型一致；②知情本研究內容并簽署知情同意書。

1.3 排除標準 ①合并嚴重心、腎、肝、血液系統(tǒng)功能、內分泌系統(tǒng)疾病、腫瘤患者；②合并精神類疾病及認知障礙者；③ 由骨軟化癥、甲狀旁腺激素功能亢進、類風濕關節(jié)炎、腫瘤等藥物使用等引起的繼發(fā)性骨質疏松者；④近6個月內使用影響骨代謝的藥物和使用中藥治療者; ⑤近3個月內使用影響腸道菌群的藥物，如抗生素、益生菌、益生元等。

2 一般資料

選擇2019年2月至2020年2月就診于廈門大學附屬中山醫(yī)院康復醫(yī)學科的初診PMOP患者88例。所有入組的研究對象均符合骨質疏松癥的中西醫(yī)診斷標準。該試驗已通過廈門大學附屬中山醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（No.201808），中國臨床試驗注冊中心注冊（ChiCTR1900027187）。

3 數(shù)據(jù)收集

記錄患者的年齡、身高、體重、BMI、中醫(yī)證型等信息。采用雙能X線骨密度儀（GE Lunar Prodigy，美國）測量腰椎L1-4、股骨頸和全髖骨密度值。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清雌激素、空腹血清I型膠原交聯(lián)C-末端肽（Serum C-terminal telopeptide of type I collagen， S-CTX）和血清1型原膠原N-端前肽（Procollagen type 1 N-peptide， P1NP）；糞便樣本采用裝有保護液[6]的采樣管取樣。

4 糞便DNA測序

糞便DNA提?。翰捎眉S便DNA提取試劑盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit）提取糞便DNA。對應引物區(qū)域：16S V3-V4區(qū)引物（正向引物序列為5’- CCTACGGGNBGCASCAG-3’，反向引物序列為5’- GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’）；擴增子文庫構建：采用兩步擴增法對樣品細菌的16sDNA基因的V3-V4區(qū)進行PCR擴增及加測序接頭完成文庫構建；NovaSeq（Illumina， 美國）上機測序。

5 數(shù)據(jù)分析

5.1 測序數(shù)據(jù)處理 將下機數(shù)據(jù)拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截除Barcode和引物序列對后續(xù)PE Reads拼接，進行Tags過濾，拼接成Raw Tags，再經(jīng)過嚴格地過濾處理后得到高質量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）。

5.2 OTU聚類和物種注釋

5.2.1 OTU聚類 利用USEARCH 軟件對全部Effective Tags聚類分析。

5.2.2 物種注釋 使用RDP Classifier與Silva數(shù)據(jù)庫對物種進行注釋分析（閾值0.97），按細菌不同分類水平：Kingdom（界），Phylum（門），Class（綱），Order（目），F(xiàn)amily（科），Genus（屬）統(tǒng)計各樣本的菌群落構成。

5.2.3 OTUs系統(tǒng)發(fā)生關系構建 快速多序列比對使用MUSCLE軟件，所得的OTUs代表序列的系統(tǒng)實際發(fā)生關系。

5.3 多樣性分析（α-diversity） α-diversity用于分析各樣品內（Within-community）的微生物群落多樣性，利用單樣本的α-diversity分析反映樣品內的菌群落的多樣性豐度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。5.4 多樣品比較分析（β-diversity） 使用R包vegan計算OTUs的Bray-Curtis距離。采用主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis， PCoA），相似性分析（Analysis of similar， ANOSIM）等多變量統(tǒng)計學方法，進一步挖掘樣品間微生物群落結構差異和不同分類對樣品間的貢獻差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

5.5 LEfSe分析 采用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析不同分組間豐度差異顯著的物種，利用Wilcoxon秩和檢驗分析顯著性差異物種中的所有亞種，比較是否都趨同于同一分類級別，最后用線性判別分析（LDA）評估顯著差異菌群種類的影響力。

5.6 臨床指標與菌群的相關性分析 利用R包psych進行相關性分析，得出臨床指標和菌群之間的相關性和顯著性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 88例PMOP患者不同證型基本信息

共收集了PMOP患者88例，其中肝腎陰虛證36例、脾腎陽虛證28例和腎虛血瘀證24例，各組年齡、BMI、骨密度、雌激素、S-CTX和P1NP差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 88例PMOP患者不同證型基本信息

2 各證型菌群在α多樣性差異比較分析

分析PMOP患者3種證型腸道菌群的6個α多樣性指數(shù)（Observe、Evenness、ACE、Chao1、Shannon、Simpson），多樣性指數(shù)值越高，說明菌群落的多樣性越高。肝腎陰虛型、脾腎陽虛型與腎虛血瘀型相比，菌群的Observe指數(shù)更高，且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但是，3種證型在Evenness、ACE、Chao1、Shannon、Simpson指標差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1 各證型腸道菌群在α多樣性差異比較分析

3 各證型菌群組間成分差異分析

Venn圖分析發(fā)現(xiàn)肝腎陰虛證、脾腎陽虛證和腎虛血瘀證獨有的菌屬依次為46、24、23種（圖2A）。各證型排名前10的菌屬豐度主要集中在Bacteroidales、Prevotella、Phascolarctobacterium、Escherichia-Shigella、Klebsiella、Faecalibacterium、Roseburia、Veillonella、Lachnoclostridium和Alistipes。（圖2B）。PCoA、ANOSIM分析證實3種證型在腸道菌群的屬水平存在統(tǒng)計學差異（圖2C-D，P<0.01）。

圖2 各證型菌群組間成分差異分析

4 各證型菌群菌屬間的熱圖分析

在豐度熱圖中（圖3）顯示，在細菌屬水平，肝腎陰虛型患者的菌群含量豐富的為Lachnospira、Prevotella、Bacteroidales，豐度最低的為Peptostreptococcus。脾腎陽虛型患者菌群含量豐富的為Subdoligranulum、Howardella，豐度最低的為Bifidobacterium、Blautia及Muribaculaceae。腎虛血瘀型患者的菌群含量最豐富為Phocaeicola，豐度最低為Mitsuokella和Phascolarctobacterium。

圖3 各證型腸道菌群菌屬豐度分析

5 各證型菌群菌屬間菌群LEfSe分析

LEfSe分析可以分析組間菌群差異，找出各組間差異的微生物種類，可用于開發(fā)生物標志物等研究。在上述3個證型中，設定LDA閾值為3，篩選了相應證型的特征菌群，具體菌群如圖4所示。3個證型中腎虛血瘀型分析出16種特征差異菌群，肝腎陰虛型證型和脾腎陽虛型都有5種特征差異菌。

圖4 各證型菌屬間腸道菌群LEfSe分析

6 PMOP患者臨床指標與特征差異菌的相關性分析

相關性熱圖（圖5）顯示與年齡成正相關菌屬有Butyrivibrio，負相關的有Bifidobacterium、Citrobacter和Morganella；與BMI成負相關菌屬有Peptostreptococcus和Phocaeicola；與血清雌激素成正相關菌屬有Howardella和Phascolarctobacterium，負相關的有Muribaculaceae；與腰椎骨密度成負相關的菌屬有Prevotella；與股骨頸骨密度成正相關的菌屬有Morganella，負相關的有Muribaculaceae和Lachnospira；與全髖骨密度成正相關的菌屬有，負相關有Bacteroidales、Peptostreptococcus；與S-CTX成 正 相關的菌屬有Blautia和Howardella，負相關有Phocaeicola; 與P1NP成正相關的菌屬有Bifidobacterium和Blautia。

圖5 PMOP患者臨床指標與差異菌群的相關性

討 論

基于中醫(yī)學辨證論治，PMOP為本虛標實之證，五臟均與POMP的發(fā)生密切相關，主要病變臟腑在肝、脾、腎，多以氣滯血瘀為表證。歷代醫(yī)家多從脾虛、腎虛辨證，久虛致肝腎陰虛，脾腎陽虛，且久虛必瘀，如有外傷，引發(fā)骨折，血滯經(jīng)絡，血瘀加重[5]。因此，最新的指南將POMP分類為脾肝腎陰虛證、腎陽虛證、腎虛血瘀證3種證型，其中以肝腎陰虛證多見[4]。

近年來，有學者提出“腸-骨軸”理論，發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)可直接或間接影響骨代謝，腸道菌群的失調可導致骨重建失衡，而調節(jié)腸道菌群具有防治骨質疏松的作用[7-8]。最新研究發(fā)現(xiàn)我國PMOP患者腸道菌群的豐富度和多樣性降低，與腰椎BMD顯著相關；骨代謝指標與骨量減少患者Allisonella，Klebsiella和Megasphaera正相關[9]。以上研究說明腸道菌群改變與骨質疏松患者密切相關?；贠bserve指數(shù)分析，PMOP腎虛血瘀型患者的菌群α多樣性低于肝腎陰虛型、脾腎陽虛型；但是，采用PCoA和ANOSIM分析表明組間差異顯著，肝腎陰虛型、脾腎陽虛型明顯低于腎虛血瘀患者，該結果為菌群多樣性區(qū)分PMOP腎虛血瘀型和另外兩種證型提供參考依據(jù)。

另外，本研究將PMOP患者的中醫(yī)證型與腸道菌群相關性進行分析，從菌群多樣性、組間特征差異菌群分析、臨床指標與特征差異菌的相關性等來觀察不同中醫(yī)證型的腸道菌群改變特征?；谥嗅t(yī)體質辨證的研究發(fā)現(xiàn)，陰虛質女性腸道菌群豐度最大的前3位菌屬分別是Veillonococcus，Ruminococcus和Koalabacteria[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)PMOP肝腎陰虛型腸道菌群豐度較高的是Lachnospira、Prevotella、Bacteroidales，而Peptostreptococcus相對較低。然而，在脾腎陽虛型PMOP患者腸道中富集Subdoligranulum、Howardella，這與單純陽虛質人群腸道內富含Brevundimonas、Leuconostoc、Turieibacter等菌群并不完全一致[11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)脾陽虛患者的腸道內Firmicutes豐度高于健康人群，而Bacteroides豐度則顯著減少，由此提出Firmicutes增高可能影響脾陽虛患者代謝水平。另有研究報道腎陽虛患者的乳桿菌屬等益生菌顯著下降[13]，本研究則發(fā)現(xiàn)PMOP脾腎陽虛型患者Bifidobacterium等益生菌減少。另外，本研究觀察到腎虛血瘀型PMOP患者不同于另外兩種證型的差異性腸道菌群。上述篩選出的特征差異菌屬可作為中醫(yī)證型的腸道微生態(tài)學檢測指標，為中醫(yī)證型微觀化診斷提供理論基礎。但是，由于腸道菌群受到到飲食、地域、人種、疾病、體質等多種因素的影響[14]，需要大型臨床流行病學調查加以驗證，并且在未來研究中進行因果性驗證。

最后，我們將PMOP患者的骨代謝、骨密度等指標與特征差異菌群進行相關性分析，結果顯示雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等有益菌與年齡呈負相關。隨著年齡的增長，老年人腸道有益菌逐步減少，有害菌增多，菌群失調加劇導致各種疾病發(fā)生[15]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium與P1NP呈正相關，說明該有益菌與骨形成密切相關。有研究表明我國老年人的腸道Bifidobacterium，Lactobacillus等有益菌與骨密度值呈正相關[16]。因此，Jafarnejad等[17]通過臨床試驗證實補充干酪乳桿菌、長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等7種混合益生菌可降低絕經(jīng)后骨質疏松患者S-CTX，抑制骨吸收。動物實驗也發(fā)現(xiàn)單純使用長雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌等益生菌可防止骨丟失，增加骨密度[18]。由此可見，通過調節(jié)腸道菌群是防治PMOP有效方法[19，20]。

本研究探索了PMOP不同中醫(yī)證型的腸道菌群結構，其多樣性改變以及相應特征差異菌群有望作為該證型的微生物學標志物；從腸道微生態(tài)角度證實PMOP中醫(yī)證型與腸道菌群相關性，為PMOP輔助診斷、轉化應用以及腸道菌群干預提供理論依據(jù)，從腸道微生態(tài)學角度驗證辨證論治的中醫(yī)核心思想。