王哲，耿乃志

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 黑龍江哈爾濱 150040

2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 黑龍江哈爾濱 150040

高血壓病（Hypertension）是指以體循環(huán)動(dòng)脈血壓（收縮壓和/或舒張壓）增高為主要特征（收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg），可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征。[1]根據(jù)血壓升高的水平，將高血壓分為1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)；根據(jù)有無(wú)其他危險(xiǎn)因素，將高血壓分為低危、中危、高危、很高危；根據(jù)發(fā)病原因的不同，可分為原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓。高血壓病因復(fù)雜，包括遺傳、年齡、飲食、生活等諸多方面，其中高鹽、高脂引起得肥胖為主要高危因素。[2]作為一種常見的慢性心血管疾病，高血壓患病率在我國(guó)人群中呈逐年升高趨勢(shì)，但知曉率、治療率和控制率較低。[3]

高血壓病屬中醫(yī)“眩暈”“頭痛”范疇，有虛實(shí)之分。[4]《黃帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為高血壓病機(jī)為“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”，得到歷代醫(yī)家的廣泛認(rèn)可，但隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段的不斷完善，高血壓病的病程發(fā)展得到很大程度延緩，其病機(jī)也隨之改變。現(xiàn)醫(yī)家普遍認(rèn)為高血壓多因風(fēng)、火、痰等病理因素影響肝、脾、腎三臟引起情志不遂、勞逸失度、年老體虛、飲食不節(jié)而發(fā)病。[5]現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要通過(guò)改善生活方式、糾正可干預(yù)的危險(xiǎn)因素與藥物治療相結(jié)合的方法，以降低高血壓的靶器官損害與血管并發(fā)癥的發(fā)生和死亡風(fēng)險(xiǎn)。中藥是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，成分復(fù)雜，具有多成分、多通路、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，在治療時(shí)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)更能與高血壓相適應(yīng)。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不同，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)更注重“未病先防”，因此中藥治療高血壓前期常療效顯著，治療過(guò)程中不會(huì)引起直立性低血壓、糖耐量降低、血膽固醇升高及電解質(zhì)紊亂等不良反應(yīng)。[6]

蒺藜為臨床治療高血壓的常用藥物之一，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是蒺藜科植物蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實(shí)，有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目、止癢之功效，可治療頭痛眩暈、胸脅脹痛、乳閉乳癰、目赤翳障、風(fēng)疹瘙癢等癥。此外，現(xiàn)代藥理研究證明，蒺藜具有降壓降脂、抗動(dòng)脈硬化、延緩心室重構(gòu)、改善心功能等作用，故常用于高血壓及其并發(fā)癥的治療。[7-10]蒺藜治療高血壓的潛在關(guān)聯(lián)與作用機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從蒺藜有效活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路等方面對(duì)其論證。

材料與方法

1 蒺藜活性成分篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）分別以生物利用度（OB）、類藥性（DL）為標(biāo)準(zhǔn)采集蒺藜的活性成分和作用靶點(diǎn)。

2 蒺藜活性成分作用靶點(diǎn)和高血壓相關(guān)靶點(diǎn)獲取

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)提取蒺藜全成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)信息，基于“1.1”方法篩選的蒺藜有效活性成分提取蒺藜有效成分相關(guān)靶點(diǎn)的集合，將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Universal Protein，UniPort）獲得標(biāo)準(zhǔn)化基因名稱，即為蒺藜活性成分的作用基因名稱。

利用人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards：The Human Gene Database）、人類孟德爾遺傳病數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）中 以“Hypertension”為關(guān)鍵詞檢索與高血壓相關(guān)的基因靶點(diǎn)、基因圖譜。

利用R4.0.3軟件將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互映射并繪制Venn圖，得到蒺藜治療高血壓的相關(guān)信息。

3 構(gòu)建可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將基于方法“1.2”得到的蒺藜活性成分、作用靶點(diǎn)和高血壓靶點(diǎn)整合，導(dǎo)入Cyroscape3.8.1軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，獲得蒺藜-靶點(diǎn)-效應(yīng)通路的網(wǎng)絡(luò)模型。

4 構(gòu)建蒺藜-高血壓蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，導(dǎo)入蒺藜-高血壓交集靶點(diǎn)，構(gòu)建藥物與疾病的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并制作其蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-to-protein interaction，PPI）。

5 GO生物功能富集分析和KEGG通路注釋分析

利用R4.0.3軟件對(duì)“1.4”方法得到的蒺藜活性成分靶點(diǎn)和高血壓靶點(diǎn)交集基因進(jìn)行GO生物功能富集分析和KEGG通路注釋分析，以說(shuō)明蒺藜干預(yù)高血壓的靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路的富集情況。

結(jié) 果

1 蒺藜活性成分收集

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到關(guān)于蒺藜的有效成分共計(jì)51種，以生物利用度（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18%）為依據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后，最終獲得12種生物有效活性成分。見表1。

表1 蒺藜有效活性成分基本信息

2 蒺藜活性成分作用靶點(diǎn)和高血壓相關(guān)靶點(diǎn)獲取

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出蒺藜有效活性成分相關(guān)蛋白靶點(diǎn)共364個(gè)，經(jīng)UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)校正后得到43個(gè)藥物活性成分相關(guān)基因靶點(diǎn)。以“Hypertension”為關(guān)鍵詞搜索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到8435個(gè)靶點(diǎn)，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)得到56個(gè)靶點(diǎn)，將兩者整理合并去除重復(fù)后共獲得8429個(gè)靶點(diǎn)，其中有39個(gè)靶點(diǎn)與蒺藜的有效活性成分靶點(diǎn)相同。見表2，圖1。

表2 蒺藜-高血壓潛在靶標(biāo)基本信息

圖1 蒺藜治療高血壓靶點(diǎn)預(yù)測(cè)Venn圖

3 構(gòu)建蒺藜治療高血壓的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)Cyroscape3.8.1軟件構(gòu)建蒺藜與高血壓的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其節(jié)點(diǎn)為本研究篩選出蒺藜及有效活性成分、高血壓及其相關(guān)靶點(diǎn)。利用Cyroscape3.8.1軟件的Network Analyzer插件分析可知蒺藜中山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）的網(wǎng)絡(luò)度值最高，分別為32和16，說(shuō)明蒺藜干預(yù)高血壓的過(guò)程中山柰酚、異鼠李素可能占據(jù)重要作用。見圖2。

圖2 蒺藜-靶點(diǎn)-效應(yīng)通路的網(wǎng)絡(luò)模型

4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，以人為限定物種、閾值≥0.4為篩選條件，隱藏游離基因后，得到39個(gè)節(jié)點(diǎn)，168條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）及tsv文件，并借助R4.0.3軟件分析后得知相關(guān)性前5位核心基因分別為MAPK8、AHR、AR、CASP3、ESR1。

圖3 蒺藜治療高血壓的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

5 GO生物功能富集分析

借助R4.0.3軟件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物功能富集分析，共得到81個(gè)相關(guān)條目（P<0.05）。根據(jù)分析結(jié)果可知，核心靶點(diǎn)在核受體活性（nuclear receptor activity）、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、類固醇結(jié)合（steroid binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合（transcription coactivator binding）等方面富集程度較為集中。見圖4。

圖4 蒺藜治療高血壓核心靶點(diǎn)的GO生物功能富集分析

6 KEGG通路注釋分析

借助R4.0.3軟件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路注釋分析，共得到73個(gè)信號(hào)通路（P<0.05）。根據(jù)分析結(jié)果可知蒺藜主要通過(guò)流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝作用（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、化學(xué)致癌作用（Chemical carcinogenesis）等信號(hào)通路干預(yù)治療高血壓。見圖5、圖6。

圖5 蒺藜治療高血壓核心靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路富集分析柱狀圖

圖6 蒺藜治療高血壓核心靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖

討 論

高血壓是一種多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的疾病，常因遺傳與環(huán)境因素相互作用而誘發(fā)，與心血管疾病和全因死亡率的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[11]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究蒺藜干預(yù)高血壓的潛在關(guān)聯(lián)與作用機(jī)制。

通過(guò)對(duì)蒺藜活性成分與蛋白靶點(diǎn)的搜索和篩選，得到12種有效活性成分，43個(gè)蛋白基因靶點(diǎn)，其中山柰酚和異鼠李素為蒺藜的核心成分；針對(duì)高血壓基因靶點(diǎn)的搜索匯總和去除重復(fù)，獲得與高血壓相關(guān)的8429個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，其中蒺藜蛋白靶點(diǎn)與高血壓基因靶點(diǎn)交集基因39個(gè)；蒺藜主要靶點(diǎn)多富集于核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇結(jié)合、類固醇激素受體活性、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合等生物功能，通過(guò)流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝作用、化學(xué)致癌作用等信號(hào)通路，作用于MAPK8、AHR、AR、CASP3、ESR1等核心靶點(diǎn)，對(duì)高血壓起干預(yù)治療作用。

山柰酚和異鼠李素可抑制CYP1B1表達(dá)并拮抗AHR活化。[12]多項(xiàng)研究表明，調(diào)節(jié)CYP1B1可預(yù)防肥胖、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥。[13]山柰酚具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[14]，可通過(guò)抑制血清中IL-6、TNF-α等炎性因子的水平，抑制MAPK的表達(dá)。[15-16]異鼠李素通過(guò)抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等機(jī)制而具有器官保護(hù)、預(yù)防肥胖、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心腦血管等作用[17]。異鼠李素抑制NF-κB信號(hào)通路過(guò)度激活，減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。MAPK8調(diào)控自噬激活相關(guān)信號(hào)通路[19]；AHR在屏障組織或在代謝中起重要作用[20]；AR主要介導(dǎo)雄激素的相互作用[21]；CASP3基因主要編碼細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白酶[22]；ESR1可介導(dǎo)雌激素的作用[23]。以上調(diào)節(jié)因子廣泛參與炎癥、機(jī)體代謝和細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程。流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路作用于內(nèi)皮剪切應(yīng)力誘導(dǎo)阻力動(dòng)脈的血管舒張，并在動(dòng)脈粥樣硬化傾向中起主要作用[24]。AGE / RAGE信號(hào)可通過(guò)激活Nox-1和降低SOD-1的表達(dá)來(lái)增加氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)糖尿病介導(dǎo)的血管鈣化[25]。TNF即腫瘤壞死因子，是細(xì)胞凋亡以及炎癥和免疫的主要介體，可誘導(dǎo)細(xì)胞膜上多蛋白信號(hào)復(fù)合物的形成[26]。細(xì)胞色素P450酶在異生物素的排毒，細(xì)胞代謝和體內(nèi)平衡中起關(guān)鍵作用[27]。 化學(xué)致癌涉及控制細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和DNA修復(fù)的基因突變-即原癌基因和抑癌基因中的突變[28]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究蒺藜治療高血壓的潛在作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，蒺藜中活性成分可能通過(guò)抗炎、抗氧化、抗凋亡等機(jī)制對(duì)高血壓的治療起主要藥理作用，為后續(xù)科學(xué)研究及臨床應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供幫助。