■孫憲法 周 東 孫憲秋 王 聰 蔡青和*

(1.山東民和牧業(yè)股份有限公司，山東 蓬萊 265600；2.上海歐耐施生物技術(shù)有限公司，上海 201606)

恩拉霉素對(duì)家禽腸道內(nèi)有害梭狀芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，從而提高飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的利用率，促進(jìn)增重和飼料轉(zhuǎn)化率[1-2]。恩拉霉素在肉雞中的應(yīng)用效果已被業(yè)界研究所證實(shí)，但從2020 年7 月1 日起，我國(guó)禁止使用除中藥外的所有促生長(zhǎng)藥物飼料添加劑，抗生素的禁用導(dǎo)致家禽腸道疾病高發(fā)，因此尋找抗生素的替代品刻不容緩。

植物精油（Essential oil，EO）是一類(lèi)源于植物的花、葉、莖、根或果實(shí)的次生代謝產(chǎn)物，分子量小，在動(dòng)物體內(nèi)吸收代謝快、無(wú)毒無(wú)殘留，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、消炎殺菌及抗氧化的功效[3]。植物精油種類(lèi)豐富，含有多種活性成分，對(duì)于家禽的腸道發(fā)育、消化生理、腸道免疫和微生物區(qū)系調(diào)節(jié)方面都具有良好的改善作用，是一種潛力巨大的抗生素替代品，國(guó)內(nèi)外關(guān)于植物精油的研究成果快速增長(zhǎng)，將植物精油應(yīng)用在動(dòng)物生產(chǎn)上做了很多工作，獲得了很多成果[4]。酶是有活性的蛋白質(zhì)，在農(nóng)牧、食品、醫(yī)藥、生物燃料等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。家禽的腸道短，食糜停留時(shí)間短，內(nèi)源酶作用有限，養(yǎng)分消化吸收不充分；家禽結(jié)腸退化，盲腸很小，盲腸微生物對(duì)非淀粉多糖（NSP）的降解能力有限，加入酶制劑可增強(qiáng)腸道黏膜屏障功能，改善腸道健康；鈍化日糧中抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高養(yǎng)分消化率，從而減輕產(chǎn)氣莢膜梭菌感染對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)的不利。胰酶是從動(dòng)物胰腺中提取的一種酶的混合物，含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、多種肽酶、脂肪酶和淀粉酶等。劉干[5]研究表明酶制劑可以提高肉雞生長(zhǎng)性能，改善腸道健康。孫秋娟等[6]報(bào)道，酶制劑和植物精油組合添加可提高產(chǎn)氣莢膜梭菌感染肉雞的生長(zhǎng)性狀，并可降低回腸有害菌的定植，保護(hù)腸道屏障功能及組織形態(tài)結(jié)構(gòu)免受產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的侵害，從而維持腸道健康。相關(guān)試驗(yàn)研究表明植物精油和胰酶均可以提高肉雞生長(zhǎng)性能，但植物精油和胰酶二者組合在肉雞生產(chǎn)試驗(yàn)中未見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)以AA肉公雞為研究對(duì)象，在日糧中添加不同水平的植物精油和胰酶，并進(jìn)行攻毒，觀察其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、消化酶活性和腸道健康的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的恩拉霉素為市購(gòu)產(chǎn)品（純度8%，DSM）；植物精油由某公司提供；胰酶（含胰蛋白酶500 U/g、胰淀粉酶2 400 U/g、胰脂肪酶3 500 U/g）由上海某生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將504只AA肉公雞分為7個(gè)處理組，每個(gè)處理分6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只。試驗(yàn)分兩個(gè)階段，第一階段1～21 d，第二階段22～42 d。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

攻毒方案：于第14 d，用產(chǎn)氣莢膜梭菌（CP）毒株（CVCC2030）對(duì)試驗(yàn)中的CP 菌感染組雞只經(jīng)口接種1 mL 菌液[（2～3）×108CFU/mL]，持續(xù)攻毒至第20 d。操作流程：將產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株在含有牛肉粒的滅菌皰肉培養(yǎng)液中37 ℃恒溫過(guò)夜厭氧培養(yǎng)（12～14 h），用胰-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（tryptose-sulfite-cycloserine，TSC）瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，攻毒組每天每只雞口服新鮮菌液1 mL[（2～3）×108CFU/mL]，不攻毒組肉雞口服等量的無(wú)菌皰肉培養(yǎng)液。灌服用注射器或移液槍。

1.3 基礎(chǔ)日糧

基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2019 年6 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)采用封閉式雞舍單層籠養(yǎng)。按照AA肉雞常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行管理，自由采食和飲水，按常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.5 樣品采集與制備

試驗(yàn)第42 d，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只肉仔雞宰殺，取十二指腸食糜并準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)十二指腸食糜的重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶4的比例加入4倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿。將勻漿液4 ℃下2 500 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃保存?zhèn)錅y(cè)消化酶活性。采集第42 d肉雞空腸中段的1 cm腸道樣品在冰磷酸鹽緩沖液中清洗食糜，進(jìn)行腸道炎癥評(píng)分。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 生長(zhǎng)性能試驗(yàn)的第1、21 d 和42 d 稱(chēng)重、結(jié)料用于計(jì)算平均體重、平均日增重（average daily gain, ADG）、平均日采食量（average daily feed intake, ADFI）和飼料轉(zhuǎn)化率（feed conversion ratio, FCR）。

1.6.2 十二指腸消化酶活性

采用南京建成生物工程研究所試劑盒方法，測(cè)定42 d 肉雞十二指腸食糜中淀粉酶（DIS）、胰蛋白酶（Tps）、糜蛋白酶（Chy）和脂肪酶（LP）活性。

1.6.3 腸道炎癥評(píng)分

觀察42 d肉雞空腸腸道炎癥情況并做評(píng)分，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0=無(wú)肉眼可見(jiàn)的損傷；1=腸壁薄或易碎（充血）；2=小的局灶壞死或潰瘍；3=局灶性壞死或潰瘍。

1.6.4 腸黏膜組織炎性因子mRNA表達(dá)量

刮取42 d肉雞空腸、回腸組織腸黏膜，液氮保存，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、Toll 樣受體-4（Toll-like receptor4，TLR-4）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）的mRNA相對(duì)表達(dá)量?？俁NA提取按照賽默飛公司提取步驟進(jìn)行，隨后用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA的純度和濃度。cDNA合成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKa-Ra，大連）。采用SYBR Green Ⅱ染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用美國(guó)ABI 7500 熒光定量PCR 儀進(jìn)行測(cè)定，引物序列見(jiàn)表3。

表3 PCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS 17.0 軟件中單因素方差分析（one-way ANOVA）程序進(jìn)行分析，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＞0.05 為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油和胰酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表4～表6）

表4 植物精油和胰酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響(1～21 d)

表6 植物精油和胰酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響(1～42 d)

由表4 可知，試驗(yàn)前期（1～21 d），B 組和A 組相比，ADFI、ADG和21 d體重均下降，但差異不顯著（P＞0.05），F(xiàn)CR 均為1.72。C 組和A 組相比，ADG、21 d體重和FCR 均有改善，但差異不顯著（P＞0.05）。D～F 組與B 組、D～F 組與G 組相比，差異不顯著（P＞0.05）。G 組與B 組相比，21 d 體重和FCR 有改善，但差異不顯著（P＞0.05）。

由表5 可知，試驗(yàn)后期（22～42 d），B 組和A 組相比，ADG和42 d體重均下降，但差異不顯著（P＞0.05）；FCR升高，但差異不顯著（P＞0.05）。C組和A組相比，ADFI、ADG 和42 d 體重均有改善，但差異不顯著（P＞0.05）；FCR 均為1.73。D～F 組與B 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善，且隨著植物精油添加量的增加，F(xiàn)CR 有逐漸降低的趨勢(shì)。G 組與B 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善。F組與G組差異不顯著（P＞0.05）。

表5 植物精油和胰酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響(22～42 d)

由表6可知，整個(gè)試驗(yàn)期（1～42 d），B組和A組相比，ADFI、ADG和42 d體重均下降，但差異不顯著（P＞0.05）；FCR 升高，但差異不顯著（P＞0.05）。C 組和A組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善，但差異不顯著（P＞0.05）。D～F 組與B 組相比，ADFI、ADG、FCR 指標(biāo)均有改善，且隨著植物精油添加量的增加，F(xiàn)CR 有降低的趨勢(shì)。G 組與B 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有改善。F 組與G 組相比，各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 植物精油和胰酶對(duì)肉雞十二指腸消化酶活性影響（見(jiàn)表7）

表7 植物精油和胰酶對(duì)42 d肉雞十二指腸消化酶活性影響(U/mg prot.)

由表7可知，42 d時(shí)B組Chy、LP、DIS活性低于A組，但差異不顯著（P＞0.05），Tps高于A組差異不顯著（P＞0.05）。C組Tps、Chy、LP活性高于A組，但差異不顯著（P＞0.05）；C組DIS活性較A組顯著提高了44.77%（P＜0.05）。隨著植物精油添加量的增加，各項(xiàng)指標(biāo)有逐漸提高的趨勢(shì)，其中F 組酶活性最高。F 組中Chy、LP、DIS 活性顯著高于B 組（P＜0.05），F(xiàn) 組中Tps 活性高于B 組，但差異不顯著（P＞0.05）。E 組、F 組與G 組各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。G組中各項(xiàng)酶活性顯著高于B組（P＜0.05）。

2.3 植物精油和胰酶對(duì)肉雞腸道炎癥的影響（見(jiàn)表8）

表8 植物精油和胰酶對(duì)42 d肉雞腸道炎癥評(píng)分

由表8 可知，C 組和A 組相比、D～F 組與B 組相比，腸道炎癥評(píng)分值降低，但差異不顯著（P＞0.05）。且隨著植物精油添加量的增加，腸道炎癥有降低的趨勢(shì)。D～F 組與G 組相比，評(píng)分值相當(dāng)，差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 植物精油和胰酶對(duì)肉雞腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量的影響（見(jiàn)表9、表10）

表9 42 d肉雞回腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量

表10 42 d肉雞空腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量

由表9可知，整個(gè)試驗(yàn)期（第1～42 d），B組回腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量高于A 組，但差異不顯著（P＞0.05）。C組低于A組，但差異不顯著（P＞0.05）。隨著植物精油添加量的增加，炎性因子表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，其中F組最低。G組血清中IL-1β、IL-6表達(dá)量顯著低于B組（P＜0.05），IL-4、IL-10表達(dá)量低于B組，但差異不顯著（P＞0.05）。F組與G組各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

由表10 可知，整個(gè)試驗(yàn)期（第1～42 d），B 組空腸黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10 高于A 組，但差異不顯著（P＞0.05）；B組空腸黏膜IL-2、IL-8、TLR-4、TNF-α顯著高于A 組（P＜0.05）。C 組空腸黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10低于A組，但差異不顯著（P＞0.05）；C組空腸黏膜IL-2、IL-8、TLR4、TNF-α顯著低于A 組（P＜0.05）。隨著植物精油添加量的增加，白細(xì)胞介素有逐漸降低的趨勢(shì)，其中F 組白細(xì)胞介素最低。G 組空腸黏膜IL-1β、IL-6 低于B 組，但差異不顯著（P＞0.05），G組空腸黏膜IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、TLR-4和TNF-α顯著低于B組（P＜0.05）。F組空腸黏膜IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10與G組差異不顯著（P＜0.05）。

3 討論

3.1 植物精油和胰酶對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，無(wú)論肉雞是否感染產(chǎn)氣莢膜梭菌，日糧中添加植物精油和胰酶均可以在一定程度上提高肉雞生長(zhǎng)性能。這說(shuō)明植物精油和胰酶組合添加能讓肉雞更大程度利用飼糧中的營(yíng)養(yǎng)成分，可以在一定程度上緩解蛋白飼料原料短缺現(xiàn)象。王蘭等[7]研究表明，肉雞日糧中添加植物精油對(duì)其生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，但各試驗(yàn)組ADG、ADFI均不同程度提高、FCR降低，這說(shuō)明植物精油對(duì)肉雞有一定的促生長(zhǎng)作用。日糧中添加酶制劑可以提高家禽生長(zhǎng)性能[8-9]。在家禽飼糧中添加胰酶可以提高飼料轉(zhuǎn)化率[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果與上述學(xué)者研究的結(jié)論相一致。Tiihonen等[12]研究表明日糧中添加植物精油可以有效改善肉雞生長(zhǎng)性能。顯著性差異的原因可能與精油的添加劑量、組分、試驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)。在本試驗(yàn)中，在攻毒狀態(tài)下，隨著精油添加劑量的增大，肉雞的日增重也逐漸提高，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。

3.2 植物精油和胰酶對(duì)肉雞十二指腸消化酶活性影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，日糧中添加植物精油和胰酶可以提高肉雞十二指腸消化酶的活性。這是因?yàn)槿占Z中的豆粕含有大量的胰蛋白酶抑制因子，而胰蛋白酶抑制因子可顯著降低小腸胰蛋白酶活性，添加胰酶和植物精油，可以提高十二指腸消化酶活性。

劉倩[10]研究結(jié)果表明，正常蛋白水平日糧，添加胰酶可以提高肉雞十二指腸消化酶活性。王恩玲等[9]報(bào)道，飼糧中添加復(fù)合酶可以提高肉雞消化酶活性。本試驗(yàn)研究的結(jié)論與上述學(xué)者研究的結(jié)論相一致。

3.3 植物精油和胰酶對(duì)肉雞腸道炎癥的影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，日糧中添加植物精油和胰酶可以在一定程度上緩解肉雞腸道炎癥。趙琛等[13]研究報(bào)道，日糧中添加植物精油可以減少單胃動(dòng)物腸道炎癥的發(fā)生。劉干[5]研究表明，復(fù)合酶制劑可以調(diào)控肉雞腸道健康。這與本試驗(yàn)研究的結(jié)論相類(lèi)似。

3.4 植物精油和胰酶對(duì)肉雞腸黏膜組織炎性因子表達(dá)量的影響

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，日糧中添加植物精油和胰酶可以降低腸黏膜炎性因子表達(dá)量。劉嬌等[14]研究結(jié)果表明，在攻毒作用下，日糧中添加植物精油可以降低肉鴨腸道黏膜炎性因子的表達(dá)量。劉嬌[15]研究結(jié)果表明，日糧中添加酶制劑可以減少肉鴨炎癥的發(fā)生。熊學(xué)林[16]研究表明，在妊娠后期、哺乳期母豬日糧中添加植物精油，可以降低其炎性反應(yīng)。這與本試驗(yàn)研究的結(jié)論相類(lèi)似。

4 結(jié)論

在肉雞日糧中添加植物精油和胰酶能夠緩解腸道炎癥，提高腸道消化酶活性及肉雞生長(zhǎng)性能，且呈現(xiàn)植物精油劑量效應(yīng)。