董宇晴，崔波，王斌，燕守鑫

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，濟(jì)南 250353)

花椒既是一種香料，又是一種中草藥，用途廣泛。大量研究表明，花椒籽油具有一定的藥理活性，包括溫胃、祛寒、除濕、止痛、解毒、止癢等[1-4]?；ń返闹饕瘜W(xué)成分是揮發(fā)油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、黃酮、脂肪酸和甾醇。花椒籽是花椒調(diào)味料的主要副產(chǎn)物[5-6]，國內(nèi)外許多研究人員對花椒籽油的脂肪酸組成進(jìn)行了深入研究。結(jié)果表明，花椒籽油由棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸和少量十七碳烯酸組成[7-9]?；ń贩N子油中油酸、亞油酸和亞麻酸的總含量分別為57.5%、27.9%[10]。Wang等[11]對花椒籽皮油和仁油成分進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)花椒籽油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%，高于皮油中的含量，尤其是亞油酸和亞麻酸。文獻(xiàn)[12]顯示:仁油中的α-亞麻酸含量為35.4%，遠(yuǎn)高于皮油中的含量，仁油中α-亞麻酸和亞油酸之和高達(dá)64.7%。這些發(fā)現(xiàn)表明花椒籽油是一種極具開發(fā)潛力的油料資源[13]，可調(diào)配出脂肪構(gòu)成合理的天然植物調(diào)味油產(chǎn)品[14]。

花椒籽油具有特殊的揮發(fā)性風(fēng)味，主要包括揮發(fā)油、生物堿、酰胺類、木質(zhì)素、香豆素和脂肪酸等[15-16]。特別是，風(fēng)味物質(zhì)酰胺類物質(zhì)是花椒籽油的重要質(zhì)量指標(biāo)。花椒酰胺是一類結(jié)構(gòu)相似的鏈狀不飽和脂肪酸酰胺類化合物[17-18]?；ń纷延驮谫A藏過程中酰胺類物質(zhì)的變化對花椒籽油的品質(zhì)有重要影響[19]?；ń孵０穼θ梭w的各種生理活動產(chǎn)生有益的影響[20]?；ń分械孽０奉惢衔锇é?辣椒素、羥基-α-山奈素、羥基-β-辣椒素、γ-辣椒素、羥基-γ-辣椒素、2-羥基-N-異丁基、8-12-十四烷五烯酰胺、2-羥基-N-異丁基-2-(8)-五烯酰胺、2-羥基-N-異丁基-2-(8)-羥基-N[21]。揮發(fā)油是花椒籽油中的主要香氣物質(zhì)，主要包括烯烴類化合物和烴類含氧有機(jī)化合物[22]?；ń纷延惋L(fēng)味物質(zhì)受品種、產(chǎn)地、溫度、光照、當(dāng)?shù)貧夂虻纫蛩氐挠绊懀虼嘶ń纷延惋L(fēng)味物質(zhì)差異很大[23]。

研究目的：通過對貯藏溫度(4 ℃和 20 ℃)、抗氧化劑BHT、TBHQ、PG、迷迭香提取物(RE)、竹子抗氧化劑(AOB)的分析，探討貯藏溫度、抗氧化劑對花椒籽油貯藏品質(zhì)的影響；采用SPME和GC-MS聯(lián)用技術(shù)，分析了不同處理對花椒籽油貯藏過程中風(fēng)味物質(zhì)變化的影響；采用GC分析了不同處理對花椒籽油貯藏過程中脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽油：由淄博淄川鄂莊花椒合作社提供。TBHQ、BHT、PG、RE、AOB、異辛醇和37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)混合物：購自Sigma公司。分析試劑氯仿、異丙醇、碘化鉀、冰醋酸、乙醚、濃鹽酸、氫氧化鈉、淀粉、硫代硫酸鈉、甲醇、三氟化硼甲醇溶液、正己烷和氯化鈉：購自天津凱通試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L350烘箱 上海精宏公司；HPLC1200氣相分析儀 美國安捷倫公司；TQ8050 GC-MS分析儀 日本島津公司；BH-6 -20 ℃冰箱、DB-86 -80 ℃超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；HH-S4水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；78-1磁力攪拌器 常州智博瑞儀器制造有限公司；5531移液器 Eppendorf艾本德公司；FA2014A分析天平 上海精天電子儀器有限公司；KDM可調(diào)控溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 花椒籽油的儲存和取樣

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的油脂中抗氧化劑的種類，選用了3種合成抗氧化劑(TBHQ、BHT和PG)和2種天然抗氧化劑(AOB和RE)，具體添加標(biāo)準(zhǔn)見表1。本實驗將所有樣品分為A組(4 ℃)和B組(20 ℃)，每組包含10種抗氧化劑組合。油樣中加入抗氧化劑的條件為：將0.9 kg花椒籽油放入1.5 L棕色玻璃瓶中，然后加入抗氧化劑，用磁力攪拌器攪拌30 min。最后，在規(guī)定的條件下密封存放于棕色玻璃瓶中。在第0，20，40，60，80，100 天至少檢測3個樣本的POV和AV。樣本平均值之間的差異采用鄧肯多重比較進(jìn)行檢驗。數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析采用Pearson雙尾相關(guān)性分析，具體分組見表1。

表1 花椒籽油的儲藏方法Table 1 The preservation methods of Chinese prickly ash seed oils

1.3.2 POV的測定

參照GB 5009.227-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》。

1.3.3 AV的測定

參考GB 5009.229-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價的測定》。

1.3.4 脂肪酸的甲酯化反應(yīng)

甲酯化反應(yīng)采用三氟化硼甲醇溶劑法[24-26]。將15 mg花椒籽油與5 mL氫氧化鈉-甲醇溶液混合，充分搖勻，然后在80 ℃的水浴中加熱60 min。在5 mL 15%(W/V)的三氟化硼-甲醇溶液中，混合物在80 ℃的水浴中回流3 min。冷卻后加入7 mL正己烷，充分搖勻，然后加入適量飽和氯化鈉溶液。最后，上清液用0.22 μm有機(jī)膜過濾，然后用GC分析。

1.3.5 GC條件

DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度：260 ℃，進(jìn)樣量：1 μL，無分流，火焰離子化檢測器溫度：260 ℃，程序升溫：起始溫度50 ℃，保溫1 min，以25 ℃/min升溫至100 ℃保溫5 min，然后以4 ℃/min升溫至240 ℃保溫30 min。載氣：N2；壓力59 kPa；氫氣：40 mL/min；空氣：400 mL/min。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味成分的提取

采用固相微萃取對花椒籽油的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行提取[27-28]。將2 mL花椒籽油放入5 mL頂空瓶中，然后加入2 μL異辛醇，混合均勻，用聚四氟乙烯墊片密封。恒溫平衡20 min后，固相微萃取針穿過樣品瓶墊，將活化后的固相微萃取探針放入水浴中，以70 ℃的溫度加熱30 min。然后將固相微萃取針快速穿過進(jìn)樣口的硅膠隔離器，突出纖維頭，解吸并以250 ℃注入樣品。

1.3.7 GC-MS條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣溫度：50～150 ℃(保持5 min)，升溫速率：5 ℃/min，150～280 ℃，升溫速率15 ℃/min，10 min，汽化溫度：250 ℃，載氣：氦氣，分流比：50∶1[29-30]。

質(zhì)譜條件：電離方式：EI，電離電壓：70 eV，離子源溫度：250 ℃，質(zhì)量掃描范圍：30 mm，400 amu。利用薄層色譜圖譜中的峰面積對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量，并以異辛醇為內(nèi)標(biāo)得到風(fēng)味物質(zhì)的濃度。用NIST文庫對風(fēng)味成分進(jìn)行定性分析。

1.3.8 統(tǒng)計分析

每項指標(biāo)至少測量一式三份，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。均數(shù)差異經(jīng)方差分析和鄧肯多重極差檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對花椒籽油貯藏期間POV和AV的影響

由圖1中a可知，隨著貯藏時間的延長，POV在4 ℃和20 ℃都呈上升趨勢。4 ℃時POV值從2.93 meq/kg增加到25.52 meq/kg，20 ℃時從2.93 meq/kg增加到30.81 meq/kg，這些變化解釋了儲藏過程中氧氣與花椒籽油反應(yīng)產(chǎn)生過氧化物，導(dǎo)致POV升高[31]。研究表明，低溫對花椒籽油的酶活性有抑制作用。而在本實驗條件下，花椒籽油在儲存期小于40 d時，4 ℃和20 ℃的POV值差異不顯著(P>0.05)，花椒籽油的POV值與對照相比差異不顯著(P>0.05)。原因可能是食物內(nèi)部及周圍的氧氣含量通過抗氧化劑的還原反應(yīng)降低，一些抗氧化劑如抗壞血酸、異抗壞血酸等容易被氧化，可以使食物中的氧先與其反應(yīng)，從而避免油脂的氧化[32]。貯藏初期抗氧化劑含量基本相同，且足以與周圍環(huán)境中的氧結(jié)合產(chǎn)生抗氧化作用，貯藏初期效果不顯著(P>0.05)。對于較長的儲存期(60～100 d)，4 ℃保存的花椒籽油POV值顯著低于20 ℃保存的油樣(P<0.05)，說明低溫保存有利于花椒籽油的保存。

由圖1中b可知，AV隨儲存期的延長呈上升趨勢，與儲藏溫度無關(guān)。4 ℃時AV由6.54 mg/g增至31.13 mg/g，20 ℃時由6.54 mg/g增至31.55 mg/g。這是由于隨著儲存期的延長，水將甘油三酯水解成游離脂肪酸，導(dǎo)致花椒籽油的AV增大。貯藏結(jié)束時，20 ℃時的AV明顯高于4 ℃時的AV(P<0.05)。

2.2 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間POV的影響

由表2可知不同的抗氧化劑對花椒籽油在儲存過程中POV的影響。空白組在第0，20，40，60，80，100 天的POV分別為2.93，6.34，12.35，19.84，24.67，30.81 meq/kg，顯著高于抗氧化劑處理組(P<0.05)，說明添加抗氧化劑能有效抑制POV的升高[33-34]。不同抗氧化劑處理對花椒籽油貯藏期間POV的影響不同[35]。在抗氧化劑處理中，TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG在各個貯藏時間的抗氧化效果(POV值較低)均高于其他抗氧化劑[36-37]。

表2 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間POV的影響Table 2 Effects of different antioxidants on POV of Chinese prickly ash seed oils during storage

2.3 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間AV的影響

由表3可知，空白組在第0，20，40，60，80，100 天的AV分別為6.54，6.48，11.03，18.23，28.89，31.55 mg/g。通過比較9種抗氧化劑組合在每個貯藏時間的AV，解釋了影響AV的主要因素是含水率。測試樣品來自同一批次的原材料，因此含水量差異很小[38]。

表3 不同抗氧化劑對花椒籽油貯藏期間AV的影響Table 3 Effects of different antioxidants on AV of Chinese prickly ash seed oils during storage

續(xù) 表

2.4 花椒籽油貯藏過程中脂肪酸含量的變化

2.4.1 主要脂肪酸的定性和定量分析

我們選擇了3組抗氧化劑(TBHQ、TBHQ+BHT、TBHQ+PG)來分析儲存在4 ℃時的脂肪酸。本實驗通過36種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)的氣相色譜分析[39]，得到36種脂肪酸的峰高和36種脂肪酸的濃度，見表4。

表4 36種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 4 The standard curves of 36 standard fatty acids

續(xù) 表

2.4.2 抗氧化處理對花椒籽油貯藏過程中脂肪酸含量的影響

由表5～表7可知，在第0，20，40，60，80，100 天時，TBHQ、TBHQ+BHT、TBHQ+PG組合中檢測到23種脂肪酸。第0天時，主要脂肪酸為棕櫚酸、亞油酸和甲基花生酸，分別占脂肪酸總量的50.13%、35.29%和3.43%。3個組合的棕櫚酸含量分別由50.13%降至45.03%、43.1%和41.11%，總體趨勢是下降趨勢。亞油酸含量由35.29%分別降至30.06%、30.03%和32.01%，總體趨勢是下降趨勢。甲基花生酸含量由3.43%分別降至1.56%、0.73%和0.59%，總體走勢比較平穩(wěn)。肉豆蔻酸含量由0.78%分別提高到1.94%、1.51%和1.71%，總體趨勢是上升趨勢。結(jié)果表明，添加3種抗氧化劑對主要脂肪酸沒有顯著影響[40]。據(jù)報道，脂肪酸的組成和變化受原產(chǎn)地環(huán)境、儲存方式和環(huán)境的影響。

表5 TBHQ組合花椒籽油在4 ℃儲藏過程中脂肪酸組成的變化Table 5 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ during storage at 4 ℃

續(xù) 表

表6 TBHQ+BHT組合花椒籽油在4 ℃儲藏過程中脂肪酸組成的變化Table 6 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ+BHT during storage at 4 ℃

表7 TBHQ+PG組合花椒籽油在4 ℃儲藏過程中脂肪酸組成的變化Table 7 Changes in fatty acid composition of Chinese prickly ash seed oils containing TBHQ+PG during storage at 4 ℃

續(xù) 表

將檢測到的脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸。3個組合中飽和脂肪酸主要是甲基硬脂酸，含量分別由1.02%至1.20%、0.88%和4.65%，總體變化態(tài)勢比較平穩(wěn)。單不飽和脂肪酸主要為棕櫚酸，棕櫚酸含量分別由50.13%降至45.03%、43.1%和41.1%，總體趨勢是下降的。多不飽和脂肪酸以亞油酸為主，亞油酸含量由35.29%分別降至30.06%、32.03%和32.01%，總體呈下降趨勢。綜合分析，第0天的飽和脂肪酸含量高于第100天，第0天的不飽和脂肪酸含量低于第100天，3種抗氧化劑的添加對主要脂肪酸的影響不顯著。

2.5 花椒籽油貯藏過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化

主成分分析(PCA)是一種多元統(tǒng)計方法，它利用降維的思想，在信息損失較少的前提下，將多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為多個綜合指標(biāo)，它被廣泛應(yīng)用于指標(biāo)變量的相關(guān)性分析[41]?；ń纷延筒煌瑑Υ嫫诘膿]發(fā)性成分峰面積相對離散，因此采用主成分分析法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使數(shù)據(jù)更加簡潔，不影響結(jié)果。

用GC-MS分析了TBHQ混合物中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[42]。以異辛醇為內(nèi)標(biāo)對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析，利用NIST譜庫對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析，共檢測出19種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并對19種風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，見表8。

表8 TBHQ處理花椒籽油儲藏過程中揮發(fā)性成分的GC-MS測定Table 8 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ during storage determined by GC-MS

由表9可知，第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為52.493%，第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為23.697%，第三主成分的方差貢獻(xiàn)率為12.267%。一般來說，當(dāng)主成分的累計貢獻(xiàn)率超過85%時，可以用主成分來表示原始數(shù)據(jù)。因此，這3個主成分基本能反映原始變量的信息。

表9 提取的主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 9 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

由表10可知，在TBHQ處理的花椒籽油中，第一主成分為β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、環(huán)己烯、石竹烯、己酸、2-甲基環(huán)己酮、十四烷、十八酸、豆甾醇、二十二烷、角鯊烯，第二主成分為β-水芹烯、花黃素、2-環(huán)己烯-1-甲醇，第三主成分為乙酸芳樟酯、豆甾醇。

表10 TBHQ+BHT處理花椒籽油儲藏過程中揮發(fā)性成分的GC-MS測定Table 10 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ+BHT during storage determined by GC-MS

由表11可知，第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為44.344%，第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為24.059%，第三主成分的方差貢獻(xiàn)率為18.887%。一般來說，當(dāng)主成分的累計貢獻(xiàn)率超過85%時，可以用主成分來表示原始數(shù)據(jù)。因此，前3個主成分基本能反映原始變量的信息。

表11 提取的主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 11 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

由表12可知，TBHQ+BHT處理的花椒種子油中，第一主成分是β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、石竹烯、花黃素、2-甲基環(huán)己酮、氧化石竹烯、十八酸、γ-谷甾醇，第二主成分是β-水芹烯、乙酸芳樟酯、環(huán)己烯、2-環(huán)己烯-1-甲醇、十四烷、豆甾醇，第三主成分是己酸、二十二烷。

表12 TBHQ+PG處理花椒籽油貯藏過程中揮發(fā)性成分的GC-MS測定Table 12 The volatile components of Chinese prickly ash seed oils treated with TBHQ+PG during storage determined by GC-MS

續(xù) 表

由表13可知，TBHQ+PG處理的花椒籽油中只有一個主成分被提取，因此不能對TBHQ+PG處理的花椒籽油進(jìn)行主成分分析。

表13 提取的主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 13 The eigenvalues and contribution rates of the extracted principal components

3 結(jié)論

在4 ℃和20 ℃條件下，花椒籽油的POV值隨著貯藏時間的延長而增加，抗氧化劑的加入顯著降低了花椒籽油的POV值。TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG 3個組合在4 ℃和20 ℃時的POV均較低，且3個組合的TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG在4 ℃時的POV均低于20 ℃時的POV。隨著儲藏期的延長，AV不斷增加，低溫對AV的增加有抑制作用。添加抗氧化劑對AV的影響較小。本研究為延長花椒種子油的儲存期，提高花椒種子油的品質(zhì)提供了一定的理論借鑒。

采用脂肪酸GC分析，對貯藏于4 ℃的花椒籽油進(jìn)行GC分析，通過分析花椒籽油TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG 3個組成的脂肪酸，發(fā)現(xiàn)添加3種抗氧化劑對主要脂肪酸的影響不大?；ń纷延驮诘?天的飽和脂肪酸含量高于第100天，第0天的不飽和脂肪酸含量低于第100天，為花椒籽油儲藏期脂肪酸的變化提供了一定的理論依據(jù)，對花椒油儲藏具有一定的指導(dǎo)意義。

采用SPME和GC-MS技術(shù)分析了TBHQ、TBHQ+BHT和TBHQ+PG處理4 ℃花椒籽油的風(fēng)味物質(zhì)，并用主成分分析法對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析。已知TBHQ處理花椒籽油的第一主成分為β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、環(huán)己烯、己酸、2-甲基環(huán)己酮、十四烷、石竹烯、十八酸、豆甾醇、二十二烷、角鯊烯，第二主成分為β-水芹烯、花黃素、2-環(huán)己烯-1-甲醇，第三主成分為乙酸芳樟酯、豆甾醇。TBHQ+BHT處理花椒籽油的第一主成分主要為β-月桂烯、α-水芹烯、桉樹醇、庚酸、花黃素、2-甲基環(huán)己酮、氧化石竹烯、十八酸、γ-谷甾醇，第二主成分為β-水芹烯、乙酸芳樟酯、環(huán)己烯、2-環(huán)己烯-1-甲醇、十四烷、豆甾醇，第三主成分是己酸、二十二烷。