尚浩江，周 偉，胡傳明**，申 欣，朱朋昌，李 帥

(1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222000；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007；3.上海海洋大學(xué)，上海 201306)

條斑紫菜(Neopyropiayezoensis)是我國重要的經(jīng)濟(jì)紅藻，主產(chǎn)于江蘇海區(qū)，此外山東與遼寧海區(qū)也有少量分布。2020-2021生產(chǎn)年度，條斑紫菜育苗面積達(dá)8×105m2，海上栽培面積4.1×104hm2，干紫菜產(chǎn)量5.6×109枚(數(shù)據(jù)由江蘇省紫菜協(xié)會(huì)提供)，條斑紫菜產(chǎn)業(yè)是我國長江以北人工栽培海藻中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)業(yè)[1]。長期以來?xiàng)l斑紫菜種苗培育效率滯后于栽培面積的快速發(fā)展，每年均會(huì)出現(xiàn)部分地區(qū)種苗供應(yīng)緊張的情況，導(dǎo)致種苗培育面積無序發(fā)展，育苗面積與栽培面積比逐年增加，育苗企業(yè)虧損面擴(kuò)大，不利于紫菜產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定。紫菜的種苗培育技術(shù)急需向機(jī)械化、智能化方向發(fā)展以提高育苗效率，而其中種苗培養(yǎng)基質(zhì)的篩選，以及突破貝殼基質(zhì)的制約因素而開發(fā)新型基質(zhì)，是解決工廠化育苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1953-1954年，日本藻類學(xué)家黑木宗尚和我國藻類學(xué)家曾呈奎幾乎同時(shí)完成了甘紫菜(Neopyropiatenera，曾用名Porphyratenera)生活史的研究，為紫菜的人工育苗打下理論基礎(chǔ)[2]，此后曾有自由絲狀體(Free-living conchocelis)采苗[3]、單孢子采苗[4]、紫菜葉狀體細(xì)胞酶法采苗[5]等無基質(zhì)育苗技術(shù)出現(xiàn)，均因采苗量達(dá)不到生產(chǎn)要求而未被市場接受。目前紫菜種苗產(chǎn)業(yè)仍采用基質(zhì)培養(yǎng)技術(shù)，且貝殼是唯一的培養(yǎng)基質(zhì)，天然貝殼由95%-99%的碳酸鈣(方解石、文石、球霰石及非晶態(tài))和1%-5%的蛋白質(zhì)(糖蛋白、多糖、幾丁質(zhì)和脂質(zhì)等)構(gòu)成[6]，種苗以貝殼絲狀體(Shell conchocelis[7])形式生長于貝殼內(nèi)層。這與貝殼絲狀體的特殊生長方式有關(guān)，紫菜果孢子附著于貝殼內(nèi)層表面，萌發(fā)形成絲狀體后鉆入貝殼生長[8]，而硅藻、藍(lán)藻等雜藻不能鉆入貝殼，因此生產(chǎn)培養(yǎng)中可通過簡單的清洗貝殼表面加以純化，從而可以大規(guī)模培養(yǎng)貝殼絲狀體。相反，懸浮培養(yǎng)的自由絲狀體常因雜藻而導(dǎo)致污染難以去除[9]。此外，貝殼絲狀體生長于貝殼內(nèi)層表面一定深度，受光較為均勻，可以大量同步形成“雙分”，保障了短期內(nèi)大規(guī)模采苗的要求。

文蛤(Meretrixmeretrix)、牡蠣、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)和扇貝的貝殼是4種廣泛應(yīng)用的紫菜種苗培養(yǎng)基質(zhì)，適宜紫菜絲狀體生長且較易獲取[10]。Heo等[11]研究認(rèn)為牡蠣殼的紫菜絲狀體接種效率高于扇貝殼和文蛤殼。除貝殼外，也有研究表明蛋殼可作為紫菜種苗培養(yǎng)的基質(zhì)[12]。但目前對紫菜種苗培養(yǎng)技術(shù)研究主要聚焦于培養(yǎng)的環(huán)境因子上，如光照強(qiáng)度、光周期與培養(yǎng)水溫等[13-15]，以及黃斑病[16,17]等病害防治方面，未見對貝殼培育性能的系統(tǒng)性研究。因此，本研究選取不同基質(zhì)材料，如文蛤、近江牡蠣(Ostrearivularis)殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼(Patinopectenyessoensis)殼、海月蛤(Placunaplacenta)殼、雞蛋殼、珍珠等生物合成基質(zhì)，以及方解石原石、霰石原石、幾丁質(zhì)碎片與殼聚糖薄膜等與貝殼成分相關(guān)的非生物基質(zhì)，擬通過比較分析，研究多種基質(zhì)對條斑紫菜貝殼絲狀體著生、生長與殼孢子放散的影響，篩選最適培養(yǎng)基質(zhì)，為貝殼替代基質(zhì)的研究打下科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜自由絲狀體取自國家級(jí)紫菜種質(zhì)庫Y-9101品系，文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼由如東華通水產(chǎn)品有限公司提供，海月蛤殼、雞蛋殼、珍珠、方解石原石、霰石原石從市場購買，幾丁質(zhì)(Lot.G7TDKRJ)由東京化成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)，高黏度殼聚糖(Lot.C11029612)由上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器

光照培養(yǎng)箱(MGZ-120B-3，上海丙林電子科技有限公司)；生物顯微鏡[E800，尼康儀器(上海)有限公司]；光譜閃爍照度計(jì)(SFIM-300，杭州遠(yuǎn)方光電信息股份有限公司)；掃描電子顯微鏡(JSM-6510，日本電子株式會(huì)社)。

1.3 方法

1.3.1 絲狀體接種與培養(yǎng)

將文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼、海月蛤殼、雞蛋殼、珍珠、方解石原石和霰石原石清洗干凈，其中雞蛋殼放入有效氯含量5%(m∶V)的84消毒液中浸泡12 h，使雞蛋殼乳突層與蛋殼內(nèi)側(cè)的殼膜層纖維分離[18]，用鑷子將殼膜層清除干凈。殼聚糖加入2%(V∶V)乙酸配置成5%(V∶V)殼聚糖溶液，將5%殼聚糖溶液倒入培養(yǎng)皿自然晾干形成殼聚糖薄膜，沖洗至pH中性。將條斑紫菜自由絲狀體打碎成40-60 μm小段，分別接種于上述培養(yǎng)基質(zhì)上，接種密度為150 ind./cm2，將每種貝殼各3枚、雞蛋殼碎片3枚(每枚約10 cm2)、珍珠5粒放入培養(yǎng)盒培養(yǎng)，共設(shè)置4組平行。將方解石原石、霰石原石各3塊、殼聚糖薄膜3張、碎片狀幾丁質(zhì)1 g放入培養(yǎng)盒中共同培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度(12.5±1.0) μmol/(m2·s)，培養(yǎng)溫度16℃，海水鹽度27‰，光照周期12D∶12L。

1.3.2 著生密度與著生效率的測量

接種后每周用生物顯微鏡觀察絲狀體著生情況，接種6周后貝殼等基質(zhì)表面藻斑肉眼清晰可見，統(tǒng)計(jì)藻斑數(shù)量，計(jì)算著生密度(著生密度=藻斑數(shù)/貝殼面積)，從而計(jì)算出著生效率(著生效率=著生密度/接種密度×100%)。

1.3.3 貝殼絲狀體長度的測量

接種2周起通過測量藻斑直徑計(jì)算水平生長面積(藻斑近似圓形)，至藻斑生長交連到一起時(shí)停止測量。分別于第55天與第100天將貝殼等基質(zhì)沿著藻斑中心處縱切，采用掃描電鏡測量絲狀體縱向生長長度。

1.3.4 貝殼絲狀體殼孢子放散測量

為了研究不同培養(yǎng)基質(zhì)中貝殼絲狀體殼孢子的放散水平，接種120 d后，分別取每種貝殼基質(zhì)各1枚、珍珠5粒、雞蛋殼碎片1枚(約10 cm2)，置于50 mL海水中培養(yǎng)，設(shè)置4組平行。培養(yǎng)溫度16℃，光照條件為7:00-12:30光強(qiáng)(31.3±1) μmol/(m2·s)，12:30-18:30光強(qiáng)(6.3±1.0) μmol/(m2·s)，18:30至次日7:00黑暗。連續(xù)20 d測定單位面積培養(yǎng)基質(zhì)的日放散量[19]，每天中午鏡檢殼孢子放散量后，清洗貝殼并更換海水。通過測量各種基質(zhì)的接種面積(珍珠接種面積近似半球形)，計(jì)算不同基質(zhì)中殼孢子的日放散效率[殼孢子的日放散效率=殼孢子的日放散量/基質(zhì)接種面積，spores/(cm2·d)]。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.，美國)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 22 (IBM，美國)進(jìn)行單因素方差分析，設(shè)置顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 條斑紫菜絲狀體著生情況及其不同培養(yǎng)基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)

未發(fā)現(xiàn)條斑紫菜絲狀體在方解石原石、霰石原石上著生。幾丁質(zhì)碎片面積為1-12 mm2，浸入海水后逐漸軟化，表面未發(fā)現(xiàn)絲狀體附著。條斑紫菜絲狀體一端附著于殼聚糖薄膜表面，呈自由絲狀體樣向外生長，并未鉆入薄膜內(nèi)部，藻絲有少量單側(cè)分枝，且分枝處無明顯隆起[圖1(a)]。而條斑紫菜絲狀體著生于文蛤殼等5種貝殼基質(zhì)以及雞蛋殼和珍珠基質(zhì)上，并向外生長與向內(nèi)鉆入生長，其中向外生長呈自由絲狀體樣，與殼聚糖薄膜表面生長的絲狀體無異；向內(nèi)鉆入基質(zhì)中，主分枝多于2條，向四周呈輻射生長，側(cè)枝多呈對生，且多出現(xiàn)不定形隆起。在貝殼基質(zhì)和珍珠基質(zhì)中，條斑紫菜絲狀體著生后先于基質(zhì)表層生長后鉆入內(nèi)部[圖1:(b)-(g)]，而在雞蛋殼中，絲狀體著生后即鉆入內(nèi)部，呈彌散狀[圖1(h)]。

圖1 條斑紫菜貝殼絲狀體著生于不同培養(yǎng)基質(zhì)的顯微圖

通過掃描電鏡對基質(zhì)縱切面結(jié)構(gòu)和絲狀體在基質(zhì)中生長的痕跡進(jìn)行觀測，三角帆蚌殼、文蛤殼和珍珠外層由排列密集且整齊的細(xì)小文石多邊形板片相互疊加構(gòu)成[圖2:(a)-(d)]。這3種基質(zhì)剪切時(shí)斷裂面整齊。近江牡蠣殼、蝦夷扇貝殼和海月蛤殼由許多細(xì)長的菱形方解石板條層層疊加構(gòu)成，切面在水平方向呈細(xì)條狀紋路[圖2:(e)-(f)]，剪切時(shí)易產(chǎn)生多層滑動(dòng)斷裂。條斑紫菜貝殼絲狀體在這6種基質(zhì)內(nèi)大多集中在基質(zhì)的表層，且更容易發(fā)育為孢子囊枝，下層的貝殼絲狀體數(shù)量較少，且呈營養(yǎng)藻絲形態(tài)縱向生長。雞蛋殼主要分為兩層結(jié)構(gòu)，分別是蛋殼內(nèi)側(cè)的乳突層和蛋殼外側(cè)的柵欄層，乳突層厚度約為100 μm，蛋殼厚度約為300-400 μm [圖2(g)]。兩層結(jié)構(gòu)的表層均分布大量貝殼絲狀體，且藻斑內(nèi)外發(fā)生重疊，顯示絲狀體穿透蛋殼生長。

圖2 不同條斑紫菜貝殼絲狀體培養(yǎng)基質(zhì)切面掃描電鏡圖

2.2 不同培養(yǎng)基質(zhì)中條斑紫菜貝殼絲狀體的著生效率

絲狀體在近江牡蠣殼與雞蛋殼上著生效率最大，分別為(4.5±0.6)%、(4.2±0.6)%(P≥0.05)，其次為蝦夷扇貝殼與三角帆蚌殼，在珍珠基質(zhì)上的著生效率最低，為(1.7±0.6)%(圖3)。

S：蝦夷扇貝殼;H：三角帆蚌殼;M：近江牡蠣殼;D：雞蛋殼;Z：珍珠;W：文蛤殼;J：海月蛤殼。相同小寫字母表示不同組間差異未達(dá)顯著水平(P≥0.05)

2.3 不同培養(yǎng)基質(zhì)中條斑紫菜貝殼絲狀體的分布

接種兩周后絲狀體開始鉆入基質(zhì)中并形成貝殼絲狀體。在三角帆蚌、海月蛤、近江牡蠣、蝦夷扇貝和文蛤等貝殼基質(zhì)中貝殼絲狀體于第4周水平生長速率最快，生長速率均超過1 000 μm/周，第6至第10周水平生長速率較慢，平均生長速率為321-429 μm/周。蛋殼基質(zhì)中，貝殼絲狀體在第3至第9周的平均水平生長速率為297 μm/周，第10周生長速率最快，達(dá)768 μm/周。珍珠基質(zhì)中，貝殼絲狀體在第3至第8周水平生長速率較慢，平均為317 μm/周，第9周生長速率最快，達(dá)736 μm/周。在三角帆蚌殼、近江牡蠣殼和文蛤殼中，貝殼絲狀體前10周的平均水平生長速率為63.5 μm/d (P≥0.05)；其次為蝦夷扇貝殼，為(59.5±10.6) μm/d；雞蛋殼中貝殼絲狀體的水平生長速率最慢，為(39.9±6.9) μm/d(圖4)。

營養(yǎng)藻絲階段，貝殼絲狀體在雞蛋殼中鉆入的深度最深，達(dá)(267.4±60.1) μm，其次為三角帆蚌殼與海月蛤殼，分別為(82.1±35.1) μm、(75.9±37.3) μm，而在近江牡蠣殼、蝦夷扇貝殼、文蛤殼以及珍珠中的鉆入深度基本相同(P≥0.05)(圖4)。

第13周，貝殼絲狀體由營養(yǎng)藻絲發(fā)育為孢子囊枝后繼續(xù)生長，孢子囊枝在雞蛋殼中的鉆入深度最深，穿透蛋殼生長，達(dá)(334.9±15.0) μm；其次為蝦夷扇貝殼，鉆入深度為(168.5±44.8) μm；孢子囊枝在三角帆蚌殼、海月蛤殼、近江牡蠣殼、文蛤殼和珍珠中的鉆入深度基本一致，為(113.9±27.9) μm(P≥0.05)(圖4)。

S：蝦夷扇貝殼;H：三角帆蚌殼;M：近江牡蠣殼;D：雞蛋殼;Z：珍珠;W：文蛤殼;J：海月蛤殼。相同小寫字母表示不同組間差異未達(dá)顯著水平(P≥0.05)

2.4 不同培養(yǎng)基質(zhì)對條斑紫菜殼孢子放散的影響

貝殼絲狀體殼孢子前6 d平均日放散量均較低，后14 d平均日放散量差異較大，其中文蛤殼基質(zhì)殼孢子日放散量最大，達(dá)624 spores/(cm2·d)，其次為雞蛋殼和海月蛤殼，分別達(dá)360 spores/(cm2·d)、223 spores/(cm2·d)，三角帆蚌殼基質(zhì)殼孢子日放散量最小，為41 spores/(cm2·d) (圖5)。

S：蝦夷扇貝殼；H：三角帆蚌殼；M：近江牡蠣殼；D：雞蛋殼；Z：珍珠；W：文蛤殼；J：海月蛤殼

3 討論

紫菜種苗可采用平鋪或吊掛的方式培養(yǎng)，由于不同貝殼的成分、結(jié)構(gòu)以及質(zhì)地有差別，導(dǎo)致貝殼絲狀體的生長與殼孢子放散量存在較大的差異。本研究中文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼、蝦夷扇貝殼、海月蛤殼、雞蛋殼和珍珠等7種絲狀體培養(yǎng)基質(zhì)均為常見的天然材料，主要成分均為碳酸鈣，以及少量幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)，貝殼絲狀體在7種基質(zhì)中的生長及發(fā)育水平差異明顯，可能與培養(yǎng)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、碳酸鈣結(jié)晶方式、晶體排列方式和有機(jī)成分等因素有關(guān)。Oaki等[20]對雞蛋殼、貝殼珍珠層、海綿骨骼、珊瑚和有孔蟲等5種不同生物礦物材料的納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其均由納米晶粒聚合形成。從基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及結(jié)晶方式來看，文蛤殼和三角帆蚌殼內(nèi)側(cè)的珍珠層均由文石晶體組成[21]；珍珠外側(cè)的珍珠層也是由文石晶體組成；蝦夷扇貝殼的內(nèi)層由文石晶體組成，厚度為250-300 μm[22]；牡蠣殼的內(nèi)層由方解石晶體形態(tài)構(gòu)成[23]；雞蛋殼主要分為乳突層和柵欄層，其中的碳酸鈣主要以方解石形態(tài)存在[24]；而海月蛤殼為99%細(xì)長的菱形方解石條板構(gòu)成的單葉微結(jié)構(gòu)。從晶體排列方式來看，Cain等[25]測得雞蛋殼中柵欄層的方解石晶體有著一致的取向性，晶體軸和蛋殼表面的垂直方向有16°-28°的傾斜角度，但是乳突層的晶體取向則是隨機(jī)的；蝦夷扇貝殼內(nèi)層的方解石晶體具有相同的傾斜角度；海月蛤殼具有獨(dú)特的透光性，可見光總透射率高達(dá)80%，這是因?yàn)槠涿總€(gè)方解石板條衍射為單晶[26]。本研究中雞蛋殼、蝦夷扇貝殼、近江牡蠣殼和海月蛤殼的培養(yǎng)層為方解石結(jié)晶形式，文蛤殼、珍珠和三角帆蚌殼屬于文石結(jié)晶形式。絲狀體在這兩種結(jié)晶形式的天然基質(zhì)中均能發(fā)育為貝殼絲狀體。

三角帆蚌、文蛤、牡蠣與蝦夷扇貝的貝殼常用于紫菜育苗產(chǎn)業(yè)，這4種貝殼基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及硬度均有所差異(表1)。本研究顯示，在上述4種貝殼中，貝殼絲狀體在三角帆蚌、文蛤與近江牡蠣的貝殼中水平生長速率高于蝦夷扇貝殼，生長深度低于蝦夷扇貝(P≥0.05)。文蛤殼中孢子放散水平顯著高于其他3種貝殼，三角帆蚌殼最低，因此條斑紫菜殼孢子放散水平不能由水平生長速率和生長深度直接反映，還可能與培養(yǎng)基質(zhì)的硬度等物理量有關(guān)。

表1 紫菜育苗產(chǎn)業(yè)常用貝殼結(jié)構(gòu)及硬度

貝殼因其面積小、內(nèi)表面不平整的特點(diǎn)，導(dǎo)致紫菜種苗培育過程中清洗、鋪擺工序耗費(fèi)大量人力與時(shí)間，且其易翻覆，降低了采苗效率，因此具有較高平整度與組裝水平的貝殼替代基質(zhì)是未來紫菜種苗基質(zhì)發(fā)展的方向。本研究選取了與貝殼內(nèi)層相同晶體結(jié)構(gòu)的方解石原石、霰石原石，以及與貝殼內(nèi)層具有共同成分的殼聚糖薄膜、幾丁質(zhì)碎片進(jìn)行同步培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)條斑紫菜絲狀體生長于其中，僅在殼聚糖薄膜表面著生，并向外以自由絲狀體形態(tài)生長，與鉆入生物合成基質(zhì)的貝殼絲狀體形態(tài)有明顯差異。從生物合成基質(zhì)的有機(jī)成分分析，文蛤殼的有機(jī)質(zhì)成分主要為幾丁質(zhì)、富含丙氨酸的不可溶蛋白質(zhì)、富含甘氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸的可溶性蛋白等；牡蠣殼中含有幾丁質(zhì)、糖蛋白、珍珠蛋白、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸和甘氨酸等[34-37]；三角帆蚌殼和珍珠的珍珠層文石結(jié)晶間的有機(jī)質(zhì)主要是幾丁質(zhì)纖維和類絲素蛋白，還含有甘氨酸和丙氨酸等[37]；雞蛋殼中的有機(jī)質(zhì)主要為蛋白質(zhì)、糖蛋白、蛋白多糖[38]，這些天然生物基質(zhì)中均含有1%-5%的有機(jī)成分[39-43]，因此紫菜絲狀體的著生與貝殼絲狀體的形成可能與基質(zhì)中的有機(jī)成分有關(guān)。

4 結(jié)論

條斑紫菜絲狀體可在生物合成基質(zhì)與殼聚糖薄膜表面著生并向外呈自由絲狀體樣生長，向內(nèi)只在生物合成基質(zhì)中形成貝殼絲狀體，并發(fā)育至放散殼孢子，未發(fā)現(xiàn)生長于殼聚糖薄膜內(nèi)，且未在方解石原石、霰石原石與幾丁質(zhì)碎片內(nèi)部著生。貝殼絲狀體在近江牡蠣殼與雞蛋殼中著生效率最高，分別達(dá)(4.5±0.6)%、(4.2±0.6)%；在三角帆蚌、近江牡蠣和文蛤貝殼中水平生長速率最大，平均為63.5 μm/d(P≥0.05)；在雞蛋殼中縱向生長最深，達(dá)(334.9±15.0) μm；在文蛤貝殼中的殼孢子放散量最高，其次為雞蛋殼。因此，除了常用于紫菜育苗生產(chǎn)的文蛤殼、近江牡蠣殼、三角帆蚌殼與扇貝殼外，雞蛋殼較為適宜貝殼絲狀體的著生、生長與殼孢子放散。