馮 芮潘 飛王曉玉陳浩月陳悅霞鄭遵成

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東泰安 271016；2.東平縣中醫(yī)院，山東泰安 271500；3.東平縣人民醫(yī)院，山東泰安 271500；4.泰安市中心醫(yī)院，山東泰安 271000

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是當(dāng)今社會致殘的主要原因之一［1］，臨床治療及康復(fù)效果欠佳，損傷后的功能障礙多由原發(fā)性機(jī)械損傷、繼發(fā)性細(xì)胞死亡、反應(yīng)性膠質(zhì)增生和受損軸突再生能力差等多種因素引起［2］。脊髓損傷中心多為壞死性神經(jīng)性死亡，繼發(fā)性變化導(dǎo)致?lián)p傷周圍組織缺血、缺氧、興奮性毒性等，特別是大量遠(yuǎn)離損傷中心的少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，會導(dǎo)致脫髓鞘和軸突傳導(dǎo)惡化［3］。最終導(dǎo)致病理學(xué)上的病變遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最初的機(jī)械性創(chuàng)傷，甚至可能導(dǎo)致某些功能永久性喪失。

嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）移植是目前脊髓損傷療效較好的治療方法之一。OECs 存在于中樞和周圍神經(jīng)中，是一種特殊的在功能上介于雪旺細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的膠質(zhì)細(xì)胞，具有營養(yǎng)神經(jīng)、抑制膠質(zhì)增生與瘢痕形成、成鞘等作用，可以為脊髓損傷部位新生軸突生成與神經(jīng)傳導(dǎo)的建立提供基礎(chǔ)［4］。研究表明Wnt/β-catenin信號通路可能參與成年組織（包括脊髓）的穩(wěn)態(tài)和疾病進(jìn)展，成年大鼠脊髓中存在大多數(shù)Wnt 配體、受體和抑制劑的組成性表達(dá)以及活躍的典型Wnt信 號［5-6］。而OECs 移 植 后 是 否 通 過 激 活Wnt/βcatenin 信號通路發(fā)揮作用的相關(guān)報道較少。本研究旨在通過觀察經(jīng)OECs移植后大鼠脊髓組織Wnt/β-catenin 信號通路的關(guān)鍵分子Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、c-myc的表達(dá)變化，為脊髓損傷細(xì)胞修復(fù)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

健康成年體質(zhì)量（180 ± 10）g 雄性SD 大鼠60只，購買于濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司［許可證號：SCXK（魯）20190003］，常規(guī)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，每組30只，分別為空白組：T9-11椎板去除；損傷組：T10脊髓損傷；移植組：T10脊髓損傷，OECs移植。

1.2 OECs提取與培養(yǎng)

新生3~5 d 乳鼠4 只，采取斷頸取頭法將其處死，逐層剪開乳鼠頭部，將暴露在兩側(cè)腦半球前端的橢圓形嗅球用平頭鑷子小心夾出，放入盛有DMEM/F12 培養(yǎng)基的小號培養(yǎng)皿中，眼科剪將嗅球組織剪碎，離心后轉(zhuǎn)移至6 孔板中，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)，取培養(yǎng)至第三代的細(xì)胞進(jìn)行移植。

1.3 慢病毒標(biāo)記OECs

采用陰性對照病毒CON077（上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司）感染OECs。用OECs 完全培養(yǎng)基制備密度為（3~5）×104個/mL的細(xì)胞懸液，接種到6 孔板中；37 ℃培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)基，并在每孔中加入40μL 感染增強(qiáng)液；37 ℃培養(yǎng)12 h 后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；感染后約72 h，觀察感染效率，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 模型制備及細(xì)胞移植

10%水合氯醛腹腔注射（0.4 mL/100 g）麻醉，15~20 min后將大鼠俯臥位固定在操作板上，背部剃毛器剃毛，碘伏常規(guī)消毒。確定T10水平，實施背側(cè)正中切口，切口的長度為3 cm，空白組僅做T10椎板切除，其余兩組在暴露脊髓后采用改良的Allens＇打擊器，在T10脊髓節(jié)段打擊脊髓，出現(xiàn)鼠尾擺動表明打擊成功，移植組在損傷脊髓上0.5 cm處用微量進(jìn)樣器注射1μL密度為1×105/μL的OECs，然后依次縫合各層組織，關(guān)閉傷口，無菌敷料予以包扎。術(shù)后即刻注射青霉素針（2 萬U/100 g），連續(xù)腹腔注射3 d，預(yù)防術(shù)后感染。造模術(shù)后，每只大鼠分籠飼養(yǎng)，保持鼠房的適宜溫度（22 ~ 26 ℃）和空氣濕度（50% ~ 70%），每日2 次人工按摩輔助排尿。如果大鼠意外死亡，模型需重復(fù)再造以作補(bǔ)充。在大鼠造模前和造模后7 d、14 d，由兩名不了解本操作和專業(yè)的觀察者依據(jù)運(yùn)動功能評分表（basso beattie bresnahan，BBB）對大鼠雙后肢功能進(jìn)行評分，行BBB評分后提取脊髓組織。。

1.5 定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）測定

3組大鼠每組取15只，分別于移植后1、3、5、7、14 d 冰上處死，每個時間點3 只，采用總RNA-純細(xì)胞/組織總RNA分離試劑盒（南京諾唯贊RC-112）從脊髓組織中快速提取總RNA；用HiScriptⅡ一步法RT-PCR試劑盒（南京諾唯贊RC-112）反轉(zhuǎn)錄cDNA；使用RapidTaqMasterMix（南京諾唯贊P222）進(jìn)行PCR 引物擴(kuò)增（Roche 公司，LightCycle96）。引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成（表1）。

表1 Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、c-myc及內(nèi)參GAPDH引物序列

1.6 免疫組化

3 組大鼠分別于術(shù)后7 d 各取3 只，取材（方法同上），4%多聚甲醛常規(guī)固定組織，制作冰凍切片，切片按程序進(jìn)行脫蠟和水化后，內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育10 min，PBS 溶液重復(fù)洗滌3 次，每次3 min；用組化筆在組織周圍畫圈，5%山羊血清在濕盒中室溫封閉30 min；濾紙吸干血清后，將抗NF200一抗（稀釋比例為1∶400）滴入組織，玻片放在濕盒中4 ℃過夜；第二天取出37 ℃復(fù)溫45 min，一抗棄掉，PBS溶液重復(fù)洗滌5次，每次5 min；濾紙吸干水后37 ℃溫箱二抗孵育30 min；二抗棄掉，PBS 溶液重復(fù)洗滌5 次，每次5 min；后用DAB 染色液顯色3 min，蘇木精復(fù)染3 min，最后脫水、干燥、中性樹膠封片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 OECs的培養(yǎng)鑒定

單個OECs胞體突起變長，呈雙極形或梭形，細(xì)胞排列呈柵欄狀或連接成網(wǎng)狀。經(jīng)慢病毒標(biāo)記熒光顯微鏡下顯示，OECs 呈綠色細(xì)長條狀，胞體飽滿且較大，群集分布。損傷7 d 脊髓熒光顯微鏡下可見組織輪廓，大腦灰質(zhì)密度均一；經(jīng)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記移植后脊髓灰質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)密集分布、顏色較亮、數(shù)量較多的OECs。見圖1。

A 為正常培養(yǎng)OECs，比例尺：100μm；B 為慢病毒感染OECs，比例尺：100μm；C 為SCI 后7 d 熒光顯微鏡下脊髓，比例尺：200μm；D 為SCI 后熒光顯微鏡下GFP 標(biāo)記OECs 移植7 d 脊髓，比例尺：200μm

2.2 BBB評分

移植組術(shù)后14 d BBB評分高于損傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。表明OECs 移植對脊髓損傷大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)有較為明顯的影響。

表2 3組大鼠移植后BBB評分

2.3 qPCR檢測結(jié)果

空白組不同時間點各信號分子表達(dá)穩(wěn)定，趨勢較為平穩(wěn)；損傷組Wnt-1、GSK-3β 與c-myc 總體呈下調(diào)趨勢，β-catenin 有小幅上升，但都呈明顯抑制狀態(tài)，詳見表3 ~ 6；與損傷組比較，移植組除Wnt-1 呈小幅上調(diào)趨勢外，β-catenin、GSK-3β 與cmyc 均呈較高表達(dá)，明顯減輕了損傷后的抑制狀態(tài)，詳見圖2~5。

圖2 Wnt-1在不同時間點mRNA表達(dá)變化

表3 Wnt-1不同時間點mRNA表達(dá)變化

2.4 免疫組化情況

免疫組化顯示空白組神經(jīng)絲蛋白-200（NF-200）陽性細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞，為棕色，數(shù)量較多，胞體較大且飽滿，細(xì)胞核大而圓，核仁較明顯；對照組陽性細(xì)胞數(shù)量較少，胞體變性且縮小，核仁消失；細(xì)胞組胞體呈現(xiàn)細(xì)長錐形，核仁出現(xiàn)并位于中央，數(shù)量較對照組增多，且形態(tài)更接近于空白組細(xì)胞，即正常的神經(jīng)元細(xì)胞，提示OECs 移植可以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖。詳見圖6。

A為移植組；B為空白組；C為損傷組；免疫組化染色，比例尺均為50μm

3 討 論

脊髓損傷是年輕人最常見的死亡原因，對患者的社會生活和經(jīng)濟(jì)生活影響往往比其他損傷更為顯著。脊髓損傷的發(fā)病率存在地域差異，發(fā)病率從12 例/百萬人到65 例/百萬人不等，且經(jīng)濟(jì)越發(fā)達(dá)的地區(qū)，發(fā)病率越高［7-9］。當(dāng)前的醫(yī)療技術(shù)并未攻克脊髓損傷的難題，但OECs 移植對神經(jīng)元的修復(fù)作用逐漸得到專家的認(rèn)可，并成為研究的熱點。OECs 起源于嗅基底膜，存在于周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)能長距離的遷移，是一種能夠終生促進(jìn)嗅神經(jīng)元軸突生長和再生的膠質(zhì)細(xì)胞［10］。2003 年開始研究相繼報道自體嗅鞘或嗅球組織移植SCI 患者獲得了一定程度的神經(jīng)功能恢復(fù)，之后許多學(xué)者對OECs 移植進(jìn)行了更加深人的研究，并取得了不同程度的進(jìn)展［11-13］。OECs 移植后，Wnt 信號通路關(guān)鍵分子在脊髓損傷部位發(fā)揮了重要作用，但其具體機(jī)制還未完全明確。

表4 β-catenin不同時間點mRNA表達(dá)變化

表5 GSK-3β不同時間點mRNA表達(dá)變化

表6 c-myc不同時間點mRNA表達(dá)變化

圖3 β-catenin在不同時間點mRNA表達(dá)變化

圖4 GSK-3β在不同時間點mRNA表達(dá)變化

圖5 c-myc在不同時間點mRNA表達(dá)變化

Wnt 基因自發(fā)現(xiàn)以來，目前已有19 個配體和14 個受體，至少激活3 種不同的信號途徑，包括經(jīng)典的Wnt/β-catenin 信號通路、非經(jīng)典的Wnt-JNK 信號通路和Wnt-Ca+信號通路［14］。在經(jīng)典的Wnt/βcatenin 信號通路中，有Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4等經(jīng)典的信號分子，它們參與調(diào)節(jié)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖和分化，在胚胎發(fā)育和成體組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用［15］。GSK-3β、APC 與Axin 則形成一種復(fù)合物，當(dāng)Wnt 配體缺乏時，β-catenin 被復(fù)合物所降解；當(dāng)Wnt配體存在時，β-catenin可通過Wnt受體與配體的結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核，與T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴樣增強(qiáng)因子（TCF/LEF）相互作用，激活下游基因，調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡等變化［16-17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過OECs 移植之后的大鼠BBB評分明顯增高，移植后脊髓局部神經(jīng)元細(xì)胞也有不同程度增加和形態(tài)改善，表明OECs 移植可以促進(jìn)神經(jīng)元增殖，從而促進(jìn)大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)。qPCR 顯示脊髓損傷后，Wnt-1、β-catenin、GSK-3β和c-myc 總體呈下調(diào)趨勢，Wnt/β-catenin 通路被抑制，而OECs 移植后，Wnt/β-catenin 通路抑制性明顯減輕。

研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后神經(jīng)干細(xì)胞在短時間內(nèi)募集，Wnt/β-catenin 信號通路可能被激活參與其中［18］。本研究中脊髓損傷并未激活Wnt/β-catenin信號通路，可能由于細(xì)胞微環(huán)境變化、凋亡、焦亡等原因，自我修復(fù)未有效啟動，而經(jīng)OECs 移植后，減輕了Wnt/β-catenin信號通路損傷后的抑制狀態(tài)，可能協(xié)同參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖反應(yīng)，從而起到修復(fù)受損神經(jīng)元的作用，但OECs 移植后Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控趨勢仍較正常低，相關(guān)原因在未來的研究中將會繼續(xù)探討，改良OECs 或聯(lián)合其他方法治療脊髓損傷或許成為今后改進(jìn)的方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突