李勛章,吳 婷,李萬敏,邸 學,王海波

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院分析實驗室,大連 116000;*通訊作者,E-mail:whb-email@126.com)

遠志為遠志科植物遠志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵葉遠志(Polygala.sibiricalL.)的干燥根[1],具有安神益智、祛痰、消腫的作用,廣布全國各地,以西南和華南地區(qū)最盛[2]。遠志鑒別方法主要有薄層色譜法[3-5]、高效液相色譜法[6-12]。其中,薄層色譜法具有快速有效、價格低廉、高通量等特點,通過人眼觀察比較不同條帶斑點進行定性分析。劉艷麗等[4]和范梅娟等[13]采用薄層色譜對遠志進行鑒別,但條帶斑點多、顏色復雜,僅少量有對應特征斑點能選取作為特征斑點來簡單比較樣品之間關系。

近年來,隨著計算機技術的快速發(fā)展,自動分析技術在中藥領域中也逐漸被應用[14,15]。以遠志對照藥材、不同產(chǎn)地的遠志飲片及同科植物的薄層色譜圖為對象,進行智能分析方法研究。此方法能避免人眼對相近顏色的識別誤差,更好地處理樣品條帶顏色信息,提高色彩識別靈敏度。本文采用自動分析方法,利用計算機圖像分析技術,將薄層色譜圖像信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號進行分析處理,更加全面客觀地呈現(xiàn)樣本間薄層色譜斑點結果情況,為遠志的真?zhèn)舞b別準確性和質(zhì)量等級自動化控制評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2F-2C型暗箱式自動紫外分析儀(上海市安亭電子儀器廠);B-260恒溫水浴鍋,移液槍(上海蘇陽儀器有限公司);KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Linomat5半自動點樣儀(瑞士卡瑪公司);ACCULABALC-110.4萬分之一天平(德國sartorius,型號:ALC-110.4)。

1.2 試藥

硅膠G(中國青島海洋化工);甲醇(分析純,天津市富宇精細化工有限公司);純凈水(遼東半島飲用純凈水有限公司);三氯甲烷、乙酸乙酯(分析純,天津市凱信化學工業(yè)有限公司);遠志對照藥材(批號:120989-201107,中國食品藥品檢定研究院);17批遠志樣品(S1～S17)及小金牛草(S18)來源信息見表1。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學邸學高級實驗師鑒定,17批遠志樣品均為遠志科植物遠志(PolygalatenuifoliaWilld.)的干燥根,小金牛草為遠志科植物小花遠志(PolygalatelephioidesWilld.)的全草。

表1 遠志藥材產(chǎn)地信息表

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 樣品溶液的制備 取不同遠志樣品粉碎,精密稱定粉末0.5 g,置具塞錐形瓶中,加70%甲醇15 ml,超聲處理30 min,濾過,濾液水浴蒸干,殘渣加甲醇1 ml溶解,作為供試品溶液。

2.1.2 薄層層析條件 用硅膠G鋪板,105 ℃活化30 min,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10,4 ℃靜置30 min的下層溶液)為展開劑。

2.1.3 薄層色譜測定方法 照《中國藥典》項下薄層色譜鑒別方法(通則0502)試驗[16],分別吸取對照品溶液與供試品溶液各2 μl,點于同一硅膠G薄層板上,展開、取出、晾干、在紫外燈光(366 nm)下檢視,結果見圖1。薄層板檢視拍照,圖像保存為JPG格式。

1-4，6-9，11-14，16-20.S1～S17；5，15.對照藥材；10.S18圖1 18批遠志藥材薄層色譜圖Figure 1 TLC of 18 batches of Radix Polygala

2.2 薄層色譜目視觀察

遠志樣品在比移值(Rf)0.8處,可見清晰強藍色熒光斑點;在Rf 0.3～0.5處可見淡藍色熒光斑點,各遠志樣品顏色強度相似。偽品S18樣品在Rf 0.8處有淺藍色熒光斑點,在Rf 0.4～0.6處有密集紅色熒光斑點,在Rf 1.0處有強紅色熒光斑點,與遠志對照品不一致。

2.3 薄層色譜自動分析

對薄層展開條帶進行自動取色分析,采用相似度和聚類分析判斷遠志樣品之間的相關性和分類情況。

2.3.1 色值處理 按條帶位置及展開高度對圖像取色區(qū)域進行劃分,通過取色軟件對彩色圖像進行16進制代碼的顏色輸出,改變色彩模式表達,計算每個像素點的總色值。

2.3.2 薄層條帶色值自動分析 打開軟件,設置自動選點、取色、復制顏色代碼的操作腳本,對拍照圖片進行自動取色及顏色信息匯總,進行相似度和聚類分析。

2.4 自動分析方法學考察

2.4.1 取樣量考察 取相同批次遠志樣品0.2,0.5,0.8,1.0 g,按2.1.1項下方法制備供試品溶液,點樣展開。展開后,按2.3項下方法進行自動分析。確定遠志樣品取樣量為0.5 g,條帶清晰,斑點圓整,結果見圖2A。

2.4.2 點樣量考察 取相同批次遠志樣品0.5 g,按2.1.1項下方法制備供試品溶液進行點樣展開,點樣量分別為1,2,3 μl,進行展開。按2.3項下方法進行自動分析。確定點樣量為2 μl時,色譜斑點清晰,自動取色分析結果好,結果見圖2B。

1-4.分別為樣品量0.2,0.5,0.8,1.0 g A.取樣量考察結果 1-3.分別為點樣量1,2,3 μl B.點樣量考察結果

2.4.3 精密度試驗 取相同批次遠志樣品0.5 g,按2.1.1項下方法制備供試品溶液進行點樣展開,共點8個條帶,點樣量為2 μl,按2.3項下方法對8個條帶分別進行自動分析。結果表明,8個條帶相似度RSD(n=6)分別為0.27%,0.91%,0.37%,0.71%,0.84%,0.80%,0.36%,1.42%,表明該方法精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取5批遠志樣品0.5 g,按2.1.1項下方法制備供試品溶液進行點樣展開,點樣量為2 μl,按2.3項下方法進行取色分析,共分析6次。結果表明,6次分析后的條帶相似度RSD(n=6)分別為0.59%,1.42%,0.69%,0.84%,0.87%,表明本方法重復性良好。

2.4.5 取色高度考察 取相同遠志樣品0.5 g,按2.1.1項下方法制備供試品溶液進行點樣展開,點樣量為2 μl,共點3個條帶。按2.3項下操作對其進行取色分析,條帶取色分析高度間距分別為2像素、3像素、4像素重復進行相似度分析。結果表明,取色高度間距為3像素時,色譜條帶分析結果好。

2.4.6 取色位置考察 取相同遠志樣品0.5 g,按2.1.1項下方法制備供試品溶液進行點樣展開,點樣量為2 μl,共點4個條帶。取色分析時,分別取條帶中心位置、三等分位、五等分位、五等分中間三位。按2.3項下操作對其進行取色分析,相同高度的取色點色值取平均值,進行相似度考察。結果表明,取色寬度為五等分中間三值的平均值,結果最好。

2.5 相似度評價

將20批遠志薄層顏色信息導入SPSS 22.0系統(tǒng)中進行Spearman相關性分析,計算遠志樣品與對照藥材顏色數(shù)據(jù)之間的相似度。17批遠志樣品與對照藥材相似度為0.851～0.955,偽品S18與標準品相似度為0.445(見表2)。說明該方法可鑒別出遠志藥材偽品。

表2 18批樣品與對照藥材相似度評價結果

按照相似度劃分等級,大于0.93為一等品有5批(S3、S9、S10、S11、S13);大于0.89為二等品有6批(S1、S4、S6、S12、S14、S16);大于0.85為三等品有6批(S2、S5、S7、S8、S15、S17)。17批遠志樣品雖在肉眼觀察下近似一致,但經(jīng)自動分析后,可根據(jù)相似度差異進行等級劃分。

2.6 聚類分析

以18批遠志薄層顏色數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù),運用SPSS 22.0軟件進行系統(tǒng)聚類分析見圖3。根據(jù)Pearson相關性分析,將對照藥材1、對照藥材2、S1、S15、S17樣品聚為一類,S2～S14、S16樣品聚為一類,S18樣品單獨為一類(見圖3A)。

采用相同聚類條件分析176個樣品點,共聚成7類,分別與條帶Rf值相對應。條帶上1～9斑點(Rf:0.005～0.051)聚為一類,分為第一區(qū)域;條帶上10～32斑點(Rf:0.056～0.182)聚為一類,分為第二區(qū)域;條帶上33～50斑點(Rf:0.188～0.284)聚為一類,分為第三區(qū)域;條帶上51～93斑點(Rf:0.290～0.528)聚為一類,分為第四區(qū)域;條帶上94～145斑點(Rf:0.534～0.824)聚為一類,分為第五區(qū)域;條帶上146～150斑點(Rf:0.830～0.852)聚為一類,分為第六區(qū)域;條帶上151～176斑點(Rf:0.858～1.000)聚為一類,分為第七區(qū)域(見圖3B)。

A.18批遠志樣品結果 B.遠志條帶176個斑點結果圖3 遠志樣品聚類分析結果圖Figure 3 Cluster analysis results of Radix Polygala samples

2.7 樣品條帶色譜斑點主成分綜合評分

采用SPSS統(tǒng)計軟件對17批樣品的176個樣品點進行主成分分析,得到各取色點的綜合評分,部分結果見表3。結果表明,176個樣品點綜合評分高的前24個點主要分布在第七區(qū)域,其次分布在第三、第五兩個區(qū)域,剩余四個區(qū)域的樣品點綜合得分接近于0。由此推測,Rf:0.188～0.284、Rf:0.534～0.824、Rf:0.830～0.852這三個區(qū)域可能對樣品聚類分析有明顯的影響。

3 討論

使用自動分析與目視比較法同時對圖1進行分析。結果表明,通過目視比較法得出S18樣品為偽品小金牛草,S6樣品斑點較少,S2、S7、S12、S16、S17樣品的斑點比較多,各遠志樣品與對照藥材在Rf為0.5～0.8之間有不明顯斑點。采用本實驗建立的薄層色譜自動分析方法對18批遠志樣品進行定性鑒別,分析比較18批遠志樣品與對照藥材之間的色譜條帶數(shù)值相似度,發(fā)現(xiàn)S18樣品為偽品小金牛草,其余17批遠志樣品與對照藥材的相似度均高于0.85,說明17批遠志樣品均一性較好;并根據(jù)相似度結果對各個樣品進行等級劃分:相似度大于0.93為一等品有5批,大于0.89為二等品有6批,大于0.85為三等品有6批。

表3 176個樣品點綜合評分結果

主成分綜合評分高的24個樣品點集中分布在第三、第五、第七3個區(qū)域。第七區(qū)域的樣品點是遠志樣品聚類分析結果的主要影響因素,第三、第五2個區(qū)域?qū)Ψ治鼋Y果也存在明顯影響;其中第五區(qū)域Rf:0.534～0.824在目視比較時,僅有不明顯暗斑,各條帶間無明顯差異;但采用自動分析法時,第五區(qū)域?qū)l帶間相似性存在明顯影響。

對自動分析相似度值的影響因素除17批遠志樣品質(zhì)量存在差異外,薄層圖譜條帶是否規(guī)整、拍照角度是否垂直、薄層板是否有邊緣效應、斑點條帶熒光亮度等都會對相似度評價以及聚類分析類別劃分產(chǎn)生明顯影響,且斑點圓整性、背景顏色、展開距離、點樣點大小等也會對自動分析數(shù)據(jù)處理結果產(chǎn)生一定程度上的干擾。

本方法通過對薄層板顏色識別,可用于不同品種遠志的定性鑒別,克服人眼對相近顏色識別誤差,準確性好,且適用廣泛;對條帶數(shù)目多、斑點復雜的薄層板鑒別靈敏度高,條帶間相似度判斷準確,實現(xiàn)了薄層結果自動、直觀、數(shù)據(jù)化分析,使結果更加準確。同時可對市售不同品種不同來源的遠志進行等級劃分,為遠志的等級劃分也提供參考依據(jù),為進一步完善遠志藥材的質(zhì)量評價方法提供研究依據(jù),有助于遠志品種質(zhì)量評價標準的提高。