成洪杰，張 曉，崔培林

1.首都醫(yī)科大學(xué)大興教學(xué)醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 102600；2.北京市大興區(qū)榆垡鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院國(guó)際醫(yī)療部綜合內(nèi)科

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高。根據(jù)最新中國(guó)癌癥城市報(bào)告[1]，2013年中國(guó)城市居民中，胰腺癌發(fā)病率為6.95/10萬(wàn)，死亡率為6.18/10萬(wàn)，且發(fā)病率和死亡率呈逐年升高的趨勢(shì)。胰腺癌的早期診斷困難，就診時(shí)，只有不足20%的患者適合接受手術(shù)治療；晚期治療困難，進(jìn)展期胰腺癌患者的中位生存時(shí)間不足6個(gè)月[2]。鑒于胰腺癌惡性程度高、早期診斷難、晚期治療難、易發(fā)生局部浸潤(rùn)和全身轉(zhuǎn)移，深入探索胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在臨床治療靶點(diǎn)尤為重要[3]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子總稱。研究[4-6]顯示，lncRNA在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，與肝癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等密切相關(guān)，lncRNA可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等。近年來(lái)，有關(guān)lncRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用得到了越來(lái)越多的關(guān)注。研究[2-3]表明，多種lncRNA在胰腺癌組織中存在異常表達(dá)，lncRNA可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。HOTAIR、MALAT1、H19、gas5、HOTTIP、PVT-1等多種lncRNA與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有明顯相關(guān)性。

HOX的反義基因間RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與胰腺癌有關(guān)的lncRNA分子，長(zhǎng)度為2 158 bp，位于染色12q13.13的HoxC位點(diǎn)。近年來(lái)研究表明，HOTAIR在乳腺癌、肝癌、食管癌、結(jié)腸癌等存在異常表達(dá)[7-11]，HOTAIR高表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。研究[2-3]表明，HOTAIR可能是一種原癌基因，在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。研究[12]發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在胰腺癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，與胰腺癌周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處浸潤(rùn)密切相關(guān)，并且異常表達(dá)HOTAIR還是影響胰腺癌患者臨床預(yù)后的重要因素之一，高表達(dá)水平的HOTAIR預(yù)示著較短的生存期。

目前，關(guān)于HOTAIR在胰腺癌中作用的報(bào)道仍然較少，研究尚處于初步階段，HOTAIR在胰腺癌中的生物學(xué)功能尚不明確，具體發(fā)揮作用途徑和分子機(jī)制更是知之甚少。因此，本研究體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞，旨在研究HOTAIR對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移等影響，為胰腺癌的臨床靶點(diǎn)治療提供可能的方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為胰腺癌的診斷和治療開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1和Panc-1購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞中心；DMEM高糖培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、青鏈雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑、質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；小干擾RNA(siRNAs)和陰性對(duì)照siRNA(si-NC)由北京健坤禾潤(rùn)科技有限公司代購(gòu)；CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；GoScriptTMReverse Transcription System A5001購(gòu)自美國(guó)Promega公司；GoTaq?qPCR Master Mix A6001購(gòu)自美國(guó)Promega公司；RQ1 Rnase-Free Dnase M610A購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞(Panc-1、AsPC-1)用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，補(bǔ)充含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 獲取目的基因和構(gòu)建質(zhì)粒：查閱基因文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)并找到人胰腺癌細(xì)胞目的基因HOTAIR轉(zhuǎn)錄mRNA核苷酸序列，利用qRT-PCR技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA再擴(kuò)增形成一個(gè)全長(zhǎng)的HOTAIR片段，用于擴(kuò)增的HOTAIR的寡核苷酸序列為：上游：5′-CATGGATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3′，下游：5′-ACTCT-CGAGCCACCACACACACACAACCTACAC-3′，分別包含外源性Hind Ⅲ和Xho Ⅰ位點(diǎn)。驗(yàn)證PCR的產(chǎn)物并亞克隆至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1中。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胰腺癌細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁且融合度為40%～60%時(shí)，通過(guò)Lipofectamine 2000進(jìn)行載體及對(duì)照組的轉(zhuǎn)染，具體方法參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。注意轉(zhuǎn)染前更換為無(wú)血清培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染后6 h更換含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清培養(yǎng)液。第一步轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOTAIR至人胰腺癌細(xì)胞(Panc-1、AsPC-1)中，以空白pcDNA載體(pcDNA3.1-NC)作陰性對(duì)照(陰性對(duì)照組)，空試劑做空白處理(試劑空白組)。第二步轉(zhuǎn)染HOTAIR基因小干擾RNA(siRNA-HOTAIR)至人胰腺癌細(xì)胞(Panc-1、AsPC-1)中。應(yīng)用3條獨(dú)立的小干擾RNA(siRNA-HOTAIR-1187、siRNA-HOTAIR-83、siRNA-HOTAIR-1524)分別轉(zhuǎn)染兩株胰腺癌細(xì)胞，尋找并發(fā)現(xiàn)HOTAIR干擾敲低率最佳的siRNA。以陰性siRNA(si-NC)作對(duì)照，空試劑做空白處理。3個(gè)獨(dú)立的HOTAIR siRNA靶序列分別為：siRNA-HOTAIR-1187：5′-GCACUGUCUCUCAAAUAAUTT-3′；siRNA-HOTAIR-83：5′-GCACAUUCUGCCCUGAUUUTT-3′；siRNA-HOTAIR-1524：5′-GCCUUUGCUUCGUGCUGAUTT-3′。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)HOTAIR表達(dá)量：收集轉(zhuǎn)染后48 h的胰腺癌細(xì)胞，按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取HOTAIR總RNA。使用GoScriptTMReverse Transcription System和GoTaq?qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測(cè)HOTAIR表達(dá)水平，結(jié)果用磷酸甘油酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。HOTAIR的PCR上游引物：5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物：5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；GAPDH上游引物：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物:5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。分析qRT-PCR的結(jié)果并計(jì)算其相對(duì)于臨界循環(huán)次數(shù)的值，然后轉(zhuǎn)換為相對(duì)GAPDH的倍數(shù)改變，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞以起始1.0×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加培養(yǎng)液100 μl，24 h后轉(zhuǎn)染，每株胰腺癌細(xì)胞均設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(NC)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。向每孔加入10 μl CCK溶液，注意不要在孔中生成氣泡，否則會(huì)影響吸光度值(OD)的讀數(shù)。分別于轉(zhuǎn)染后0 d、1 d、2 d、3 d和4 d檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.2.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。將胰腺癌細(xì)胞消化后鋪在transwell小室上層，起始數(shù)量為2.0×104個(gè)/100 μl。含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl位于下層。24 h取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)壁一面細(xì)胞，外側(cè)細(xì)胞結(jié)晶紫染色。顯微鏡下拍照。之后2% SDS裂解細(xì)胞(600 μl)。之后移入96孔板檢測(cè)OD值。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1和Panc-1的表達(dá)情況

2.1.1 AsPC-1細(xì)胞：HOTAIR轉(zhuǎn)染成功過(guò)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AsPC-1的敲低取得成功，siRNA-1187檢測(cè)到最高敲低率，約為89.6%。其余兩條分別為 43.8%(siRNA-83)，74.3%(siRNA-1524)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表1、圖1)。PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線良好，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好(以AsPc-1過(guò)表達(dá)為例，見(jiàn)圖2)。

2.1.2 Panc-1細(xì)胞：HOTAIR轉(zhuǎn)染成功過(guò)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Panc-1的敲低取得成功，siRNA-83敲低率最高，相對(duì)陰性白質(zhì)粒對(duì)照組平均值，敲低效率約為62.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表2、圖3)。PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線良好，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。

表1 AsPC-1細(xì)胞中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量Tab 1 The relative expression of HOTAIR in AsPC-1

圖1 AsPC-1細(xì)胞HOTAIR過(guò)表達(dá)(A)和敲低(B)Fig 1 The overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR in AsPC-1

圖2 AsPC-1過(guò)表達(dá)擴(kuò)增曲線(A)和AsPC-1過(guò)表達(dá)熔解曲線(B)Fig 2 Amplification curve: the overexpression of HOTAIR in AsPC-1 (A) and melting curve: the overexpression of HOTAIR in AsPC-1 (B)

表2 Panc-1細(xì)胞中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量Tab 2 The relative expression of HOTAIR in Panc-1

2.2 HOTAIR對(duì)人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1和Panc-1增殖的影響

2.2.1 AsPC-1細(xì)胞：HOTAIR過(guò)表達(dá)組與空載體對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖4A)，這可能與HOTAIR本身在AsPC-1細(xì)胞中的高表達(dá)相關(guān)。但HOTAIR敲低實(shí)驗(yàn)中，3組HOTAIR敲低表達(dá)的細(xì)胞增殖能力普遍弱于陰性對(duì)照組，0～2 d此趨勢(shì)較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖4B)。

2.2.2 Panc-1細(xì)胞：跟蹤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況表明，相比陰性對(duì)照組，0～3 d過(guò)表達(dá)HOTAIR組呈生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；相比陰性對(duì)照組，HOTAIR敲低效率較高的siRNA-83和siRNA-1187組增殖能力減弱(見(jiàn)圖5)。

圖3 Panc-1細(xì)胞HOTAIR過(guò)表達(dá)(A)和敲低(B)Fig 3 The overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR in Panc-1

圖4 AsPC-1細(xì)胞HOTAIR過(guò)表達(dá)(A)和敲低(B)對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig 4 The effect of overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR on proliferation in AsPC-1

圖5 Panc-1細(xì)胞HOTAIR過(guò)表達(dá)(A)和敲低(B)對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig 5 The effect of overexpression (A) and knockdown (B) of HOTAIR on proliferation in Panc-1

2.3 HOTAIR對(duì)人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1和Panc-1遷移的影響

2.3.1 AsPC-1細(xì)胞：Transwell結(jié)果表明，相比陰性對(duì)照組，過(guò)表達(dá)HOTAIR組細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。siRNA-1187轉(zhuǎn)染的細(xì)胞遷移能力明顯下降，而siRNA-83和siRNA-1524變化相對(duì)陰性對(duì)照組不明顯(見(jiàn)圖6)。

2.3.2 Panc-1細(xì)胞：Transwell結(jié)果表明，相比陰性對(duì)照組，過(guò)表達(dá)HOTAIR組細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。敲低效率較高的siRNA-83和siRNA-1187轉(zhuǎn)染的細(xì)胞遷移能力明顯下降，而siRNA-1524變化相對(duì)陰性對(duì)照組不明顯(見(jiàn)圖7)。

注：A1為HOTAIR過(guò)表達(dá)組，A2為A1的陰性對(duì)照組，B1為siRNA-1187組，B2為B1的陰性對(duì)照組，圖片均放大100倍。

注：A1為HOTAIR過(guò)表達(dá)組，A2為A1的陰性對(duì)照組,B1為siRNA-83組，B2為B1的陰性對(duì)照組，圖片均放大100倍。

3 討論

胰腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度高，轉(zhuǎn)移出現(xiàn)早，早期診斷困難，晚期治療困難，預(yù)后較差。目前胰腺癌的治療仍以手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療為主，雖然患者術(shù)后中位生存期延長(zhǎng)，但生存質(zhì)量并未得到顯著提高。因此，深入研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制和靶向治療尤為重要。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子總稱。近年來(lái)研究[7-11]表明，lncRNA與肝癌、食管癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，HOTAIR高表達(dá)可能增加了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，HOTAIR高表達(dá)常常提示腫瘤患者不良的預(yù)后。

近年來(lái)，有關(guān)lncRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用得到了越來(lái)越多的關(guān)注，為臨床上胰腺癌的早期診斷、治療和預(yù)后提供了新的方向。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在胰腺癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，與胰腺癌周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處浸潤(rùn)密切相關(guān)，并且高表達(dá)水平的HOTAIR常預(yù)示著較短的生存期。但關(guān)于HOTAIR在胰腺癌中作用的報(bào)道仍然較少，研究尚處于起步階段。

HOTAIR由Rinn等[13]于2007年首次發(fā)現(xiàn)并描述，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)以反式轉(zhuǎn)錄干預(yù)基因表達(dá)的lncRNA。HOTAIR僅存在于哺乳動(dòng)物中，由2 185個(gè)核苷酸組成，位于染色體12q13.13的HOXC11與HOXC12之間，包括6個(gè)外顯子[14]。

HOTAIR有分子骨架的作用，具有特異性雙向結(jié)合能力，能同時(shí)結(jié)合兩種不同的組蛋白修飾復(fù)合體，并可能起到協(xié)調(diào)兩者功能的作用。其5′端與多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的核心組成部分之一EZH2結(jié)合，可使組蛋白H3第27位的賴氨酸三甲基化(H3K27me3)，介導(dǎo)PRC2至特定位點(diǎn)來(lái)沉默HOXD基因座及相關(guān)抑癌基因如HOXD10、JAM2、PCDH的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)；而3′端與賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶復(fù)合體(LSD1/CoREST/REST)結(jié)合，可使組蛋白H3第4位的賴氨酸去甲基化(H3K4deme)[15]，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性，在染色體層面調(diào)控目的基因活性[16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR可以通過(guò)PRC2依賴性和PRC2非依賴性兩種途徑來(lái)介導(dǎo)下游基因表達(dá)調(diào)控，但HOTAIR發(fā)揮調(diào)控作用的機(jī)制仍不完全清楚。

本研究體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控HOTAIR在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，對(duì)其增殖、遷移能力進(jìn)行分析。本研究發(fā)現(xiàn)，在HOTAIR過(guò)量表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，HOTAIR過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)Panc-1細(xì)胞增殖能力，但對(duì)AsPC-1細(xì)胞增殖無(wú)影響，我們分析可能與HOTAIR在AsPC-1細(xì)胞本身呈高表達(dá)狀態(tài)相關(guān)，進(jìn)一步上調(diào)HOTAIR在AsPC-1的表達(dá)水平，其促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖的作用和效果可能不顯著；同時(shí)，過(guò)表達(dá)的HOTAIR可以同時(shí)增強(qiáng)AsPC-1細(xì)胞、Panc-1細(xì)胞的遷移能力。在HOTAIR敲低實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)下調(diào)HOTAIR在胰腺癌細(xì)胞的表達(dá)水平，可以顯著抑制AsPC-1細(xì)胞、Panc-1細(xì)胞的增殖和遷移能力，這與前人研究結(jié)果相吻合，提示HOTAIR可能促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)展，HOTAIR高表達(dá)可能與預(yù)后不良相關(guān)[12]。

綜上所述，本研究表明，HOTAIR高表達(dá)可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，下調(diào)HOTAIR表達(dá)會(huì)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，但由于人胰腺癌細(xì)胞種類較多，本研究只對(duì)AsPC-1和Panc-1兩株胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行了研究，將來(lái)的研究可能涉及更多不同種類的胰腺癌細(xì)胞系，研究結(jié)果可能與本研究有所差異。此外，本研究?jī)H是體外實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果尚需要進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的證實(shí)。