古瑪納， 姚 丹， 王宏軍， 周麗芹， 博 意， 李虹穎， 張 達(dá)

（錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

從中草藥中最大限度地提取、分離、純化有效物質(zhì)，盡量減少無效甚至毒性成分，是確保中草藥制劑質(zhì)量并發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵。張兆旺、孫秀梅（1995）提出了“半仿生提取法（SBE）”。 經(jīng)歷二十多年的發(fā)展和檢驗，SBE 法既符合中醫(yī)藥理論，又是中草藥提取分離技術(shù)的革新， 具有較高的學(xué)術(shù)價值和推廣應(yīng)用前景。 大黃芩魚散為經(jīng)典漁用抗菌復(fù)方中草藥，收載于《中華人民共和國獸藥典》，主治魚蝦類的爛鰓病。 目前國內(nèi)外對大黃芩魚散半仿生提取物的系統(tǒng)研究較少， 在其質(zhì)量評價方法、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分、藥理毒理作用及機制方面的研究更加不足。因此，本項研究以最小抑菌濃度為響應(yīng)值，利用均勻設(shè)計 U5（53）安排 3 因素 5 水平實驗， 優(yōu)選大黃芩魚散半仿生提取物的制備工藝， 為大黃芩魚散抗菌制劑進一步研發(fā)和成果轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 大黃、黃芩、魚腥草（亳州市貢藥飲片廠）；濃鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；胃蛋白酶、胰蛋白酶（上海生工生物工程股份有限公司）；乙腈（天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；磷酸（天津南開大學(xué)精細(xì)化工股份有限公司）；黃芩苷、槲皮素、大黃素、 蘆薈大黃素 （成都曼思特生物科技有限公司）；鵝沙門氏菌（錦州醫(yī)科大學(xué)）。

DHG-9245A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（北京金北德工公司）；雷磁PHS-3C 型pH 計 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）。 高效液相色譜儀：L-7420（日本日立公司），配四聯(lián)泵、脫氣泵、紫外檢測器和柱溫箱；色譜柱：島津 InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（天津市尚亞科技發(fā)展有限公司）； 超聲波清洗器：KQ-300B（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 均勻?qū)嶒炘O(shè)計 利用均勻設(shè)計表U5（53）安排溶媒pH、料液比、提取時間3 因素5 水平的實驗，實際操作方案見表1。 以最小抑菌濃度（MIC）為響應(yīng)值，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

表 1 U5（53）均勻?qū)嶒炘O(shè)計操作表

1.2.2 提取溶媒的配制 按照《中國獸藥典》中收錄的人工胃液（pH 1.5）、人工腸液（pH 6.8）、人工大腸液（pH 8.3）配制方法制備提取溶媒，其他pH溶媒用鹽酸或氫氧化鈉配制。

1.2.3 提取物的制備 按照《中國獸藥典》中收錄的大黃芩魚散處方比例，每組稱取大黃1.08 g、黃芩 0.65 g、魚腥草 0.27 g，按照表 1 開展實驗，每組提取溫度均為37 ℃，每組重復(fù)3 次。

1.2.4 MIC 的測定 精確稱取各組提取物浸膏加水溶解配制成濃度為100 mg/mL， 采用徐淑云等（1994） 提出的活菌計數(shù)法調(diào)整細(xì)菌濃度為106cfu/mL，采用 Jiang 等（2013）報道的微孔-平板法測定各組中草藥提取物對鵝沙門氏菌的最小抑菌濃度，重復(fù)3 次。

1.2.5 色譜條件 流動相： 乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫， 有機相洗脫梯度為：0 ～ 23 min，20% ～25%乙腈；23 ～ 29 min，25% ～ 30%乙腈；29 ～ 40 min，30% ～ 35%乙腈；40 ～ 52 min，35% ～ 55%乙腈；52 ～ 56 min，55% ～ 75%乙腈；56 ～ 60 min，80%乙腈；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量 10 μL。

1.2.6 樣品制備 精確稱量各組浸膏0.1 g，加10 mL 甲醇充分溶解，濾液即為待測樣品；另外精確稱取黃芩苷、槲皮素、大黃素、蘆薈大黃素2 mg，加10 mL 甲醇溶解，濾液即為對照品。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 版統(tǒng)計軟件進行逐步回歸分析及單因素方差分析，P ＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗各組的MIC 表2 顯示各組中草藥半仿生提取物體外對鵝沙門氏菌的MIC 結(jié)果，經(jīng)SPSS 26 版軟件進行逐步回歸分析獲得其線性方程為 Y=12.419-0.384X1+0.136X2-0.67X3，R2=0.91，模型回歸與殘差有顯著性差異（P ＜0.05），表明該模型能夠反映出各因素對MIC 的影響，三種因素對MIC 的影響大小順序為料液比＞溶媒pH＞提取時間，其中料液比為顯著性影響因素（P ＜0.05）。鑒于MIC 越小則抗菌活性越強，則經(jīng)統(tǒng)計分析獲得大黃芩魚散半仿生提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為提取溶媒pH 8.3、料液比1:40、提取時間0.5 h。

表2 U5（53）均勻?qū)嶒炘O(shè)計各組的MIC

2.2 HPLC 檢測結(jié)果 從最優(yōu)工藝制備的復(fù)方中草藥提取物中可以同時檢測到多種化學(xué)成分（圖 1a）， 其中標(biāo)定了 4 種化學(xué)成分為黃芩苷（24.415 min）、槲皮素（33.415 min）、蘆薈大黃素（53.082 min）和大黃素（59.915 min）（圖 1b ～ 圖1e）。

圖1 HPLC 色譜圖

3 討論

傳統(tǒng)中獸藥的應(yīng)用需要引進新技術(shù)， 越來越多的學(xué)者在原方基礎(chǔ)上開展中草藥提取物、 新型藥劑方面的研發(fā)。 殷明陽等（2015）報道中草藥提取是中草藥生產(chǎn)中相當(dāng)重要的環(huán)節(jié)， 傳統(tǒng)的中草藥提取方法主要有煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)回流提取法等，且每種方法都有其優(yōu)缺點。 而SBE 可以通過體外模擬人工胃腸的基礎(chǔ)環(huán)境， 提取過程符合口服藥物在胃腸道轉(zhuǎn)運吸收的特點，提高口服中草藥的適口性。 所以，本項研究開展了大黃芩魚散半仿生提取物制備工藝的研究，參照張兆旺、孫秀梅（2011）報道半仿生提取的溫度一般為 37 ～ 60 ℃，且石瑩瑩（2020）指出，半仿生-生物酶法在中草藥中三萜皂苷類、糖苷類、酚酸類、黃酮類、生物堿類等有效成分的提取中應(yīng)用研究較多， 所以本研究選擇的提取溫度為37 ℃，但在后續(xù)研究中還是有必要進一步探討提取溫度對響應(yīng)值的影響， 在加入生物酶的體系中設(shè)定提取溫度為37 ℃，有利于發(fā)揮酶活性；在沒有生物酶的體系中可以嘗試提高提取溫度， 這樣可能會得到更好的結(jié)果。 在本實驗HPLC 檢測結(jié)果中并未如仙靚等（2018）報道的半仿生－酶法可以提高大黃素的提取率，這可能與實驗中選擇的酶有關(guān)。

近年來研究中草藥提取工藝的實驗設(shè)計方法多采用正交設(shè)計試驗法、 響應(yīng)面法，F(xiàn)ang 等（2000）報道均勻設(shè)計法與正交設(shè)計試驗法和響應(yīng)面法相比，只需要考慮試驗點在試驗范圍內(nèi)均衡分散，有效避免前者對數(shù)據(jù)整齊可比性的要求，減少了實驗步驟，具有節(jié)約時間和節(jié)省耗材的優(yōu)點。本研究均勻設(shè)計法優(yōu)化結(jié)果表明， 在提取溫度37 ℃、提取溶媒 pH 8.3、料液比 1:40、提取時間0.5 h 時，獲得的大黃芩魚散半仿生提取物能更好的抑制鵝沙門氏菌生長。該工藝對儀器要求低，能夠減少提取溶液，有效縮短提取時間，提高抗菌活性，該方法準(zhǔn)確可靠。

中草藥成分極其復(fù)雜， 在復(fù)方中草藥中發(fā)揮藥效主要是由各味藥中多種組分共同作用的結(jié)果，因此在控制及評價復(fù)方中草藥質(zhì)量時，僅僅圍繞某種或者幾種中草藥材的成分來開展分析，無法準(zhǔn)確全面地詮釋中草藥的成分和質(zhì)量。 陳靜（2021）報道中草藥指紋圖譜技術(shù)在中草藥分析中的應(yīng)用及在中醫(yī)藥生產(chǎn)中發(fā)揮了積極作用， 促進了中草藥產(chǎn)品質(zhì)量的提升， 亦可加快產(chǎn)品研發(fā)速度，值得拓展，以推動中醫(yī)藥行業(yè)的快速發(fā)展。 大黃芩魚散的含量測定方法在《中國獸藥典》中已有收錄， 僅僅用HPLC 檢測制劑中黃芩苷一種成分的含量。 在本實驗設(shè)計的色譜條件下，HPLC 可同時從提取物中檢測到黃芩苷、槲皮素、蘆薈大黃素和大黃素等多種化學(xué)成分，圖1a 中未標(biāo)明的且分離效果較好的化學(xué)成分， 擬通過HPLC-MS 聯(lián)用設(shè)備進一步鑒定、確認(rèn)，色譜條件還有待于進一步優(yōu)化并進行方法學(xué)考察。

4 結(jié)論

以MIC 為響應(yīng)值， 大黃芩魚散半仿生提取最優(yōu)工藝為提取溫度37 ℃、提取溶媒pH 8.3、料液比1:40、 提取時間 0.5 h； 在檢測波長為 260 nm 條件下， 以乙腈-0.1%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，HPLC 可以同步檢測到大黃芩魚散半仿生提取物中含有黃芩苷、槲皮素、蘆薈大黃素和大黃素。