王姍姍 ， 沈宜釗 ， 李 妍 ， 高艷霞 ， 李建國

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001）

腹瀉是犢牛的常見疾病， 也是造成牧場經(jīng)濟損失的主要原因之一（Windeyer 等，2014；Soberon等，2012）?？股乜梢杂行Ь徑鉅倥８篂a，提高犢牛的生長性能， 但抗生素濫用產(chǎn)生的耐藥性和殘留問題不可忽視。我國自2020 年開始全面禁止促生長類抗生素的使用，因此，尋找抗生素替代物的研究成為熱點。 酸化劑是一種無殘留、無抗藥性、無毒副作用的飼料添加劑， 也是目前動物養(yǎng)殖常用的抗生素替代物之一。 檸檬酸是一種有機酸化劑，許多研究表明，有機酸可以降低消化道的pH，增加乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，減少大腸桿菌，促進動物腸道形態(tài)的發(fā)育， 從而提高動物的生長性能 和 營 養(yǎng) 消 化 能 力 （Long 等 ，2018；Zhai 等 ，2017）。 育肥羊飼糧中添加檸檬酸鈉，可顯著提高羔羊日增重和飼料利用率（Packett 等，1963）。 西門塔爾牛日糧中添加檸檬酸， 可顯著改善其對精料的消化率（孟杰等，2008）。 目前，對檸檬酸的研究主要集中于仔豬和肉雞， 缺乏對犢牛的相關(guān)研究。 因此，本試驗旨在探究開食料中添加檸檬酸對犢牛生長性能、養(yǎng)分表觀消化率、血清生化指標的影響， 為犢牛生產(chǎn)實踐中酸化劑的應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 食品級一水檸檬酸， 為白色顆粒（純度≥99.9），購置于山東濰坊英軒實業(yè)有限公司。

1.2 試驗設(shè)計及日糧 本試驗于2021 年1 ～5月進行。 選擇初生重相近的健康荷斯坦犢牛44頭，隨機分為4組，每組11 頭，各組間平均初生重差異不顯著（P ＞ 0.05）。對照組（CON組）飼喂基礎(chǔ)飼糧，CA1、CA2、CA3組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加 0.5、1.0、1.5 g/d·頭的檸檬酸。試驗期 56 d。試驗牛從3 日齡開始補飼開食料，5 日齡開始在犢牛開食料中添加檸檬酸。 開食料營養(yǎng)水平如表1。

表1 開食料營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)） %

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗犢牛出生后轉(zhuǎn)移至犢牛島，灌服4 L 初乳，單欄飼養(yǎng)，自由飲水。 每天早上6：00 和下午17：00 各飼喂一次。 犢牛出生后的第1周每天每頭飼喂巴氏殺菌乳4 L，第2 ～4 周每天每頭飼喂6 L，第5 ～6 周每天每頭飼喂9 L，第7～8 周逐漸遞減至每天每頭飼喂5 L。 試驗期間定期清理犢牛圈舍，保持圈舍整潔干燥。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 體尺體重 分別于試驗開始 （1 日齡）和試驗結(jié)束（56 日齡）晨飼前稱量犢牛體重，計算1～56 日齡平均日增重（ADG）；并用測仗和卷尺測定體高、體斜長、胸圍和管圍。

1.4.2 采食量和腹瀉率的測定 試驗期間每天記錄每頭犢牛開食料投料量和剩料量， 計算犢牛采食量。每日觀察犢牛糞便狀態(tài)，參考糞便評分標準（表2） 對犢牛的糞便進行評分， 當犢牛糞便評分≥3 時記為腹瀉。 每頭犢牛每腹瀉1 d 記為腹瀉1 次，計算犢牛腹瀉率。

表2 糞便評分標準

腹瀉率/%=（腹瀉頭數(shù)/總頭數(shù)）×100。

1.4.3 飼料和糞便樣品營養(yǎng)成分的測定 每天稱量并記錄每頭試驗牛開食料投料量及剩料量，用于測定犢牛每日的采食量。 收集犢牛剩余開食料300 ～ 500 g， 于 65 ℃烘干 48 h， 并粉碎過 2 mm和0.425 mm 篩（分別用于纖維和其他養(yǎng)分測定），置于封口袋內(nèi)保存，用于營養(yǎng)成分含量的測定。 于犢牛51 ～56 日齡， 每組隨機選取8 頭牛收集糞便樣品，將每天收集的糞便混合，每頭牛收集300 g糞便樣品，于65 ℃烘干48 h，制成風干樣品（粉碎過2 mm 和0.425 mm 篩），置于封口袋內(nèi)保存，用于干物質(zhì)（DM）、粗脂肪（EE）、鈣（Ca）、磷（P）、粗灰分（ASH）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量的測定。 另外，收集 200 g 糞便樣品（按每100 g 新鮮糞便加入20 mL 濃度為10%的H2SO4進行處理，充分混勻），于 65 ℃烘干 48 h，粉碎過0.425 mm 篩，用于測定粗蛋白質(zhì)（CP）。

飼料和糞便樣品 DM、EE、Ca 與P 的含量參照張麗英（2007）實驗室常規(guī)分析方法測定，CP 含量的測定參照國標（GB/T 6432-2018），利用FOSS全自動蛋白測定儀（美國）進行測定。NDF 與ADF的測定參照Van Soest 等（1991）的方法用全自動纖維儀 ANKOM-A2000i（美國）測定。ASH 參照國標（GB/T 6438-2007）進行測定，有機物（OM）=100%-ASH。 酸不溶灰分參照國標（GB/T 23742-2009）用4N-HCL 法進行測定。

1.4.4 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率 用酸不溶灰分法計算飼料中各養(yǎng)分物質(zhì)的表觀消化率。 計算公式如下：

某養(yǎng)分消化率/%＝（a/c-b/d）/（a/c）×100；

式中：a 為飼料中某養(yǎng)分，%；b 為糞中某養(yǎng)分，%；c 為飼料酸不溶灰分，%；d 為糞中酸不溶灰分，%。

1.4.5 血液指標測定 56 日齡時，每組選取8 頭犢牛， 晨飼前通過頸靜脈采集血液樣品約20 mL置于促凝劑管中，3000 r/min 離心15 min，取上層血清分裝于0.5 mL 離心管中，-20 ℃保存待測。血清中總蛋白 （TP）、 白蛋白 （ALB）、 總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。 丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定，試劑盒購自于北京華悅昌生物科技有限公司。 所用酶標儀DNM-9602（中國）購自于北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SAS 9.4 軟件的 PROC MIXED 模型進行數(shù)據(jù)分析， 其中， 處理是固定效應(yīng)，犢牛是隨機效應(yīng)。 在LSMEANS 語句中包含用Tukey 方法調(diào)整的PIDFF 選項，以說明F 檢驗顯著時處理間的多重比較。 采用contrast 語句對檸檬酸添加量的線性、二次和三次效應(yīng)進行分析。 試驗結(jié)果以“平均值和標準誤”表示，P ≤0.05 為組間差異顯著，0.05＜P ≤0.10 表示組間差異有趨勢。 犢牛腹瀉率采用PROC GLIMMIX 模型進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸對犢牛生長性能的影響 由表3 可知，隨著檸檬酸添加量增加，各組犢牛斷奶體重呈二次上升趨勢（P =0.06）；平均日增重二次升高（P＜0.05），CA2組犢牛平均日增重顯著高于CON組（P ＜ 0.05），較對照組提高了 8.53%，與 CA1 和CA3組無顯著差異（P ＞ 0.05）。 由表 4 可知，1 日齡時， 各組犢牛的體尺性狀均無顯著差異 （P ＞0.05），說明各組間犢牛體型差異不大。56 日齡時，隨著檸檬酸添加量的增加，犢牛體高二次升高（P ＜0.05），體斜長呈線性上升趨勢（P ≤0.10），胸圍和管圍沒有顯著差異（P ＞ 0.05）。

表3 飼喂檸檬酸對犢牛體重的影響

表4 飼喂檸檬酸對犢牛體尺性狀的影響 cm

2.2 檸檬酸對犢牛顆粒料采食量的影響 由表5可知， 檸檬酸的添加對第1 周和第3 周犢牛采食量無影響。但隨檸檬酸添加量的增加，第2 周和第8 周犢牛采食量呈線性上升趨勢（P ＜0.10）；第4和第 7 周犢牛采食量線性升高（P ＜ 0.05）；第 5 周犢牛采食量線性升高（P ＜0.05），與對照組相比，CA1、CA2 和CA3組犢牛采量分別提高了14%、17.2%和14.6%；第6 周犢牛采食量二次升高（P ＜0.05），CA2組犢牛采食量顯著高于 CON組，較CON組提高了16.4%。 從全期來看，各組犢牛采食量二次升高 （P ＜ 0.05），CA2組犢牛采食量最高，較CON組提高了13.2%。

表5 檸檬酸對犢牛開食料采食量的影響 g/d

2.3 檸檬酸對犢牛腹瀉頻率的影響 由表6 可知，不管是各試驗周還是整個試驗期，各組犢牛的腹瀉率均無顯著差異（P ＞0.05）。

表6 檸檬酸對犢牛腹瀉率的影響 %

2.4 檸檬酸對犢牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響由表 7 可知，檸檬酸添加對EE、ADF 和 P 的消化率均無顯著影響（P ＞0.05）。但隨檸檬酸添加量的增加，DM、OM、CP 及 NDF 消化率線性升高 （P ＜0.05），其中，與對照組相比，CA1、CA2 和 CA3組犢牛 NDF 消化率分別提高了 10.3%、15.1%和17.9%，Ca 的消化率呈二次上升趨勢（P =0.08）。

表7 檸檬酸對犢牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響 %

2.5 檸檬酸對犢牛血液生化指標的影響 由表8可知， 檸檬酸添加對各組犢牛血清生化指標均無顯著影響（P ＞ 0.05），但血清 TP 濃度隨檸檬酸添加量增加呈二次上升的趨勢（P =0.08）。

表8 檸檬酸對犢牛血液生化指標的影響

3 討論

3.1 檸檬酸對犢牛生長性能的影響 檸檬酸作為一種日糧中常見的酸化劑， 具有良好的調(diào)味功能， 有研究認為日糧添加檸檬酸能夠有效提高多種動物的采食量。 Chavez 等（2013）在柳枝稷和苜蓿干草中添加10 g/kg 檸檬酸，可提高肉牛干草的攝入量。李卓卿（2005）研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸與蘋果酸聯(lián)用能提高奶牛對低質(zhì)粗飼料的采食量。 本試驗結(jié)果表明， 檸檬酸可以顯著提高犢牛顆粒料采食量，與前人研究結(jié)果一致，說明檸檬酸可能改善了開食料的風味和適口性， 進而促進了犢牛的采食量；犢牛全期采食量有二次升高趨勢，以1.0 g/d組犢牛采食量最高，表明檸檬酸添加需要適量，高濃度劑量添加可能會降低飼糧適口性。 Packett 等（1963）在以谷物高粱、棉籽粕、甘蔗糖蜜、紫花苜蓿和棉籽殼為基礎(chǔ)日糧的羔羊育肥試驗中， 添加3%的檸檬酸鈉可顯著提高羔羊的采食量及飼料利用率，進而提高羔羊日增重。Kazemi-bonchenari等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦犢牛補飼檸檬酸處理大麥可以顯著提高日增重。本試驗中，與對照組相比， 添加1.0 g/d 檸檬酸組犢牛日增重顯著提高，與前人結(jié)果一致。 同時犢牛體高和體斜長也有一定的增長，可能是檸檬酸提高了犢牛采食量，增加了營養(yǎng)物質(zhì)的攝入， 進而提高了斷奶前犢牛的生長性能。

3.2 檸檬酸對犢牛腹瀉率的影響 檸檬酸作為一種有機酸化劑，具有良好的替抗作用。 Lingyan等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，酸化乳可以降低犢牛腹瀉率，可能與酸化乳引起的腸道pH 降低以及細菌總數(shù)和大腸桿菌數(shù)量的減少有關(guān)。 高巖等（2020）研究也發(fā)現(xiàn)，酸化乳可通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，降低犢牛腹瀉率，改善糞便評分。 此外，斷奶仔豬上的研究也證明飼糧中添加適量檸檬酸可通過酸化日糧降低仔豬胃腸道內(nèi)的pH，增加乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量，抑制沙門氏菌、大腸桿菌等致病菌的生長繁殖，改善仔豬腸道微生態(tài)環(huán)境， 從而達到有效防治腹瀉的目的（嚴欣茹等，2020；姚繼明等，2017；張淑琴，2016），說明檸檬酸進入幼齡動物腸道具有降低腸道pH，改善微生物菌群結(jié)構(gòu)，進而緩解腹瀉的作用。 本研究中，檸檬酸直接添加入開食料中，并不經(jīng)食管溝進入真胃和腸道， 而是直接在瘤胃參與微生物發(fā)酵， 因此本研究中檸檬酸對犢牛腹瀉沒有顯著影響。

3.3 檸檬酸對犢牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響酸化劑可通過酸化日糧，降低消化道pH，提高某些蛋白酶活性，從而提高飼料消化利用率（肖軍，2020； 潘寶海等，2019）。 Kazemi-bonchenari 等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，犢牛飼喂檸檬酸處理后的大麥日糧，對OM 和NDF 的消化率有提高的趨勢。孟杰等（2008）研究表明，西門塔爾牛日糧添加200 g/d檸檬酸可顯著提高對精料 DM、EE、NDF 和 ADF的消化率。 本試驗中，隨著檸檬酸添加量增加，犢牛 DM、OM、CP 和 NDF 消化率線性升高， 且 1.5 g/d檸檬酸組犢牛消化率最好，表明檸檬酸在一定程度上可以促進犢牛對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。 李成良等（2007）在生長豬研究中發(fā)現(xiàn)，檸檬酸有進一步提高植酸酶對植酸磷的消化和對鈣磷利用的趨勢。 本試驗中，Ca 的消化率有二次上升的趨勢，與前人研究結(jié)果一致。

3.4 檸檬酸對犢牛血液生化指標的影響 血清生化指標的變化，可以反映動物生長、代謝情況。TP 和ALB 由肝臟合成， 可以反映機體蛋白的代謝水平。朱孟玲等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸可顯著提高斷奶仔豬TP 水平。 本試驗中，血清TP 含量有二次上升的趨勢， 這與犢牛試驗前期采食量增加及CP 消化率顯著提高的趨勢相吻合， 表明檸檬酸可以提高日糧蛋白質(zhì)的利用， 并對蛋白質(zhì)的合成代謝產(chǎn)生積極作用。GLU、TG 和TC 是能量代謝的重要指標， 本試驗中檸檬酸添加對犢牛血清GLU、TG 和TC 含量變化沒有顯著影響，說明檸檬酸在犢牛對糖的吸收運轉(zhuǎn)以及能量代謝方面的影響不大。 ALT 和AST 是肝臟損傷的重要指標，當肝臟細胞發(fā)生氧化損傷時，ALT 和AST 活性增強。 張之迎等（2010）在延邊半細毛羊日糧中添加有機酸，ALT 和AST 活性均在合理范圍內(nèi)， 不會對肝臟組織產(chǎn)生危害。 本試驗中， 檸檬酸的添加對犢牛ALT 和AST 活性均無顯著影響，與前人研究結(jié)果一致， 說明檸檬酸不會對肝臟產(chǎn)生不良影響。 MDA 和T-AOC 是反映機體抗氧化能力的重要指標。 李建平等（2009）研究表明，添加檸檬酸可顯著提高斷奶仔豬血清T-AOC 水平。 在本試驗中，各組犢牛 T-AOC 水平與MDA 含量均無顯著差異，與前人研究結(jié)果不同，可能與動物品種、酸化劑種類及使用劑量等不同有關(guān)。

4 結(jié)論

犢牛開食料中添加檸檬酸， 雖然對腹瀉率沒有顯著影響，但是可以顯著提高犢牛采食量，改善營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率，進而促進犢牛的生長發(fā)育。綜上，本試驗條件下，犢牛飼糧中檸檬酸的建議添加量為 1.0 ～ 1.5 g/d·頭